參芪扶正注射液對急性肺損傷大鼠肺組織熱休克蛋白-70表達的影響

梁俊永 孫秀紅 王國臣

華北理工大學;①附屬醫(yī)院胸外科 河北唐山 063000

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參芪扶正注射液對急性肺損傷大鼠肺組織熱休克蛋白-70表達的影響

梁俊永 孫秀紅①王國臣①

華北理工大學;①附屬醫(yī)院胸外科 河北唐山 063000

①目的 探討內(nèi)毒素致急性肺損傷(ALI)大鼠肺組織中熱休克蛋白-70(HSP-70)的表達以及參芪扶正注射液對ALI的保護作用機制。②方法 30只SD大鼠隨機分為空白對照組、ALI組、參芪扶正組。ALI組腹腔注射內(nèi)毒素，參芪扶正組腹腔注射內(nèi)毒素、參芪扶正注射液,空白對照組不作任何處理。均于實驗開始2小時后處死，測定各組大鼠血氧飽和度、肺系數(shù)，用HE染色觀察組織病理學改變，蛋白印跡方法檢測肺組織中HSP-70的表達。③結(jié)果 ALI組較參芪扶正組肺系數(shù)明顯增加、血氧分壓明顯下降、肺組織中HSP-70的表達明顯降低(P均<0.05)。ALI組大鼠肺組織光鏡下見大量多核白細胞浸潤、肺泡隔增寬、肺泡內(nèi)出血以及肺泡完整性破壞；參芪扶正組大鼠肺組織損傷程度較ALI組減輕，肺間質(zhì)有輕至中度水腫，白細胞浸潤也較ALI組輕。④結(jié)論 參芪扶正注射液對ALI大鼠的肺組織起保護作用，可能與誘導HSP-70表達有關。

急性肺損傷 熱休克蛋白-70 內(nèi)毒素 參芪扶正注射液

急性肺損傷(ALI)是嚴重胸部創(chuàng)傷或重癥感染后最常出現(xiàn)、病死率較高的并發(fā)癥之一[1,2]。熱休克蛋白(HSP)是廣泛存在于生物界從原核生物到真核生物中的一類具有高度保護作用的蛋白質(zhì)，當細胞受到某些不利因素，如：創(chuàng)傷、感染、缺血、缺氧等刺激時，會短暫大量合成，并通過與細胞內(nèi)部分變性蛋白的結(jié)合，協(xié)助其復性，或?qū)⑵溥\送至溶酶體降解而發(fā)揮保護細胞的作用。參芪扶正注射液是由黨參、黃芪提取的活性物質(zhì)，有報道其對ALI具有保護作用[3]。本次實驗旨在觀察參芪扶正注射液對ALI大鼠HSP-70表達的影響，及其保護作用機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠30只，體質(zhì)量100～120g，雌雄不限(由華北理工大學實驗動物中心提供)，隨機分為空白對照組、ALI組、參芪扶正用藥組，每組各10只。ALI組尾靜脈注射內(nèi)毒素5mg/kg+腹腔注射生理鹽水10mL/kg；參芪扶正用藥組：尾靜脈注射內(nèi)毒素5mg/kg+腹腔注射參芪扶正注射液10mL/kg；空白對照組不作任何處理。于實驗開始后2小時處死大鼠。用HE染法觀察組織病理學改變,測定各組肺系數(shù)及動脈血氧分壓(PaO2),并應用Western blot技術測定肺組織中HSP-70的表達。

1.2 PaO2和肺系數(shù)測定 每只大鼠腹腔動脈取血后，進行動脈血氧分析。肺系數(shù)=肺濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.3 肺組織中HSP-70的測定 每組大鼠的肺臟組織裂解、勻漿、提取蛋白，用分光光度計進行蛋白定量，用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，分別按順序加入HSP-70一抗和二抗后，用AEC染色，計算機掃描，用Motic Advanced 3.1圖像分析軟件對Western blot各條帶灰度進行測定。

2 結(jié)果

2.1 大鼠動脈血氣分析和肺系數(shù)測定結(jié)果 ALI組較空白對照組PaO2明顯下降(P<0.05)，肺系數(shù)明顯增加(P<0.05)；而參芪扶正組和ALI組相比其PaO2明顯升高(P<0.05)，而肺系數(shù)明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 三組大鼠PaO2、肺系數(shù)的比較

2.2 Western blot 結(jié)果 Western blot測定結(jié)果顯示,ALI組和參芪扶正組肺組織HSP-70表達較空白對照組顯著上調(diào)(P<0.05)；參芪扶正用藥組較ALI組明顯上調(diào)(P<0.05)，見表2，圖1。

表2 三組大鼠肺組織HSP-70表達western blot灰度值比較

圖1 各組大鼠肺組織HSP-70表達Western bolt結(jié)果

2.3 肺大體形態(tài)學變化及光鏡下切片HE染色結(jié)果 大體標本ALI組可見肺組織充血水腫，表面散在出血點，偶有斑片狀壞死，切面可見紅色液體流出；參芪扶正組肺組織充血水腫較ALI組明顯減輕，未見斑片狀壞死。HE染色切片在400倍光鏡下觀察:空白對照組(圖A)無明顯損傷或損傷輕微，肺泡壁無水腫，肺泡結(jié)構(gòu)完整，可見少量白細胞浸潤；ALI組(圖B)光鏡下見大量多核白細胞浸潤、肺泡隔增寬、肺泡內(nèi)出血以及肺泡完整性破壞；參芪扶正用藥組(圖C)肺組織損傷程度較ALI組減輕，肺間質(zhì)有輕至中度水腫，白細胞浸潤也較ALI組輕。

圖2 三組大鼠肺組織切片HE染色(×400)

3 討論

ALI是臨床常見且后果嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，常由創(chuàng)傷、感染、燒傷等因素引起，病情進展迅速，主要表現(xiàn)為進行性呼吸困難、血氧飽和度降低，嚴重威脅生命安全。ALI典型的病理表現(xiàn)是肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷，肺血管通透性增加導致肺水腫，大量中性粒細胞滲出，血管內(nèi)凝血。有實驗證實內(nèi)毒素可直接損傷肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞，導致大量中性粒細胞和蛋白等滲出，肺系數(shù)增加，其病理改變與ALI的病理改變一致[4]。

熱休克蛋白是一族保護性蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅唾液腺細胞內(nèi)，根據(jù)分子量的不同可以分為5個家族，主要存在于各種真核生物的細胞中。HSP-70是最保守的熱休克蛋白，主要存在于細胞核和細胞質(zhì)中，起分子伴侶的作用,參與新合成蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運,降解細胞內(nèi)的變性蛋白質(zhì),穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)[5]，包括壓力誘導型HSP-72和結(jié)構(gòu)型HSP-73[6]。有研究表明肺臟在受到刺激時，肺泡上皮細胞HSP-70表達增加，具有抗炎、減少炎癥介質(zhì)、抗凋亡、減少細胞因子產(chǎn)生的作用，從而起到保護肺組織的作用[7]。亦有研究表明，在應激時，HSP-70能與導致激活的信號轉(zhuǎn)導途徑相互作用，從而抑制J-N-K介導的細胞凋亡[8]。另外，HSP還可以通過保護和調(diào)節(jié)細胞骨架而起到抗凋亡作用。Hiratska等[9]將載有HSP-70基因的腺病毒注入大鼠體內(nèi)，可誘導其肺組織細胞表達HSP-70大量增加。Wischmeyer等[10]報道，給大鼠注射谷氨酰胺，可以減輕內(nèi)毒素誘導的組織損傷，促進大鼠肺、心臟等組織細胞表達HSP-70。本實驗研究中ALI組HSP-70表達增加，這說明內(nèi)毒素致ALI大鼠肺組織細胞表達HSP-70增加。

參芪扶正注射液由黃芪和黨參組成。研究發(fā)現(xiàn)黨參的化學成分以糖和皂苷糖類為主，在多方面都具有很好的免疫調(diào)節(jié)作用[11]。實驗研究表明，黨參多糖能增強小鼠的免疫功能[12,13]；黃芪的化學成分為多糖、皂甙、黃酮類等，能補氣健脾、升陽固表，對人體免疫功能也有影響，如增強LAK細胞、T細胞、L-2細胞、NK細胞的抗癌活性，亦有升高白細胞的作用[14]。王成陽等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以誘導CD4+T細胞產(chǎn)生IL-4，能夠抑制CD8+T細胞表達γ-IFN，起到調(diào)節(jié)細胞免疫功能的作用。本文顯示參芪扶正組大鼠肺組織中HSP-70的表達明顯高于ALI組和空白對照組;PaO2增高、肺系數(shù)降低、肺組織損傷的病理學改變較輕，表明HSP-70可能與肺損傷后的保護有關，提示參芪扶正注射液可能減輕肺組織的損傷。

綜上所述，參芪扶正注射液可誘導ALI大鼠肺組織細胞HSP-70表達增加，從而減輕肺組織的損傷，起到保護肺臟的作用，其對ALI的肺組織的保護作用與HSP-70有關。這可為以后參芪扶正注射液應用于臨床治療ALI提供一定的理論依據(jù)。

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(2016-01-11 收稿)(張愛國 編輯)

Effect of Shenqi Fuzheng Injection on heat shock protein-70 in lung tissue of rats with endotoxin induced acute lung injury

LIANGJunyong,SUNXiuhong,WANGGuochen

(AffiliatedHospitaltoNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To explore the expression of heat shock protein 70 (HSP-70) in lung tissue of rats with endotoxin-induced acute lung injury (ALl) and the protection mechanism of Shenqi Fuzheng Injection on it．Methods A total of 30 SD rats were randomly divided into three groups:ALI group,blank control group,Shenqi Fuzheng Injection group.After 2 hours of the experiment beginning to killed all rats.to determined the blood oxygen saturation and lung coefficient of each rats,and to observed the histopathological changes by HE staining and detected the expression of HSP-70 in lung tissue by western blotting.Results The lung coefficient increased significantly,blood oxygen saturation decreased obviously in ALI group compared to Shenqi Fuzheng Injection group,the expression of HSP-70 in lung tissues decreased in ALI group obviously than Shenqi Fuzheng Injection group . The lung tissues saw a lot of multi-core leukocyte infiltration，wider alveolar septum，alveolar hemorrhage and alveolar integrity in ALI group rats;the damage degree of rats in Shenqi Fuzheng Injection group were ligher than the ALI group,Pulmonary interstitial had light to moderate edema,also leukocyte infiltration was lighter than ALI group．Conclusion Shenqi fuzheng injection to the ALI rats lung tissue have good protection effect,may be associated with induction of HSP - 70 expression.

Acute lung injury. Heat shock protein-70. Endotoxin.Shenqi Fuzheng Injection

梁俊永(1986-),男,碩士研究生，醫(yī)師。研究方向:胸部疾病。

王國臣。

R 285.6

A

2095-2694(2016)05-393-04