丹參酚酸B通過Sirt-1對大鼠肝纖維化模型的影響

吳 航

菏澤醫(yī)學?？茖W校藥理學教研室 山東菏澤 274000

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丹參酚酸B通過Sirt-1對大鼠肝纖維化模型的影響

吳 航

菏澤醫(yī)學?？茖W校藥理學教研室 山東菏澤 274000

①目的 研究丹參酚酸B(SalB)抗大鼠肝纖維化分子的作用機制。②方法 48只大鼠隨機分為4組:對照組(A組)，DMN損傷組(B組)，SalB空白給藥組(C組)，DMN損傷+SalB預處理組(D組)。B、D組大鼠腹腔注射DMN，每周3次，給藥4周；D組大鼠在第一次注射DMN同時灌胃給予SalB溶液；C組也同時給該藥，每天1次，連續(xù)給藥6周。最后一次灌胃結束后禁食24小時，取肝臟標本，測定肝勻漿羥脯氨酸(HYP)水平。明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9活性，Western Blot檢測AP-1和Sirt-1表達水平。③結果 B組大鼠肝臟HYP水平、MMP-2、MMP-9活性以及AP-1蛋白表達水平明顯上升；與B組相比，D組大鼠肝臟HYP水平、MMP-2、MMP-9活性以及AP-1蛋白表達水平明顯下降。另外，B組大鼠Sirt-1蛋白表達水平明顯下降，而D組Sirt-1蛋白表達水平水平明顯上升。④結論 SalB具有明顯的抗肝纖維化作用，其機制與SalB激活Sirt-1表達從而抑制MMP-2、MMP-9的活性密切相關。

丹參酚酸B 肝纖維化 Sirt-1 MMP-2 MMP-9

肝纖維化是一種以肝臟細胞外基質(zhì)(ECM)生成與降解失衡為主要病因的疾病[1]。由于肝纖維化會進展成肝硬化，并且目前在臨床治療尚無特效藥，因此研發(fā)具有抗肝纖維化作用的藥物意義重大。丹參酚酸B(SalB)作為丹參中一種水溶性活性成分，具有抗氧化應激損傷、抗炎、抗腫瘤等多方面的藥理作用[2]。雖然也有報道指出，SalB具有抗肝纖維化的藥理作用，但是其抗肝纖維化的作用機制尚未闡明。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關酶Ⅰ(Sirt-1)是一種存在于哺乳動物細胞中依賴NAD+的去乙?；?，目前已經(jīng)證實Sirt-1可以通過對特定轉錄因子(比如P53、Ku70、myoD等)的去乙?；{(diào)控這些轉錄因子的活性[3]，但是在肝纖維化的發(fā)生和進展過程中，Sirt-1的作用尚未明確。因此，本文通過研究二甲基亞硝胺(DMN)誘導的大鼠肝纖維化模型，旨在探討SalB通過Sirt-1抗肝纖維化的分子作用機制，為中藥治療肝纖維化提供重要的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組及造模方法。雄性SD大鼠48只，隨機分為4組：每組各12只。對照組(A組)，DMN損傷組(B組)，SalB空白給藥組(C組)，DMN損傷+SalB預處理組(D組)。B、D組大鼠腹腔注射DMN 8μg/kg，A、C組大鼠腹腔注射同容量生理鹽水，每周一、三、五各給藥1次，連續(xù)給藥4周。從第一次注射DMN開始時，C、D組大鼠灌胃SalB水溶液15mg/kg、0.1mL/10g，A、B組大鼠同時灌胃同容量生理鹽水，每天1次，給藥6周。最后一次灌胃結束后，禁食24小時，處死動物，在肝臟相同位置留取標本用于生化指標以及分子生物學指標測定。

1.1.2 動物與試劑。丹參酚酸B(純度95%)購自Sigma公司，羥脯氨酸(HYP)試劑盒購自南京建成生物研究所，兔抗鼠Sirt-1抗體、兔抗鼠AP-1抗體均購自Abcam公司，山羊抗兔二抗購自北京碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 生化指標測定。肝組織勻漿后，按照羥脯氨酸試劑盒說明書測定肝組織中羥脯氨酸的水平。

1.2.2 明膠酶譜法測定MMP-2、MMP-9活性。動物處死后在冰浴下立即提取新鮮肝臟蛋白，蛋白定量后在含有1%明膠的分離膠中電泳，洗脫、漂洗結束后，將凝膠置于孵育液中,37℃恒溫孵育48小時，孵育結束后，經(jīng)過染色、漂洗，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照，進行灰度分析。

1.2.3 Western-Blot測定Sirt-1、AP-1的蛋白表達水平。從留取的肝臟標本中提取蛋白，經(jīng)過定性、定量分析后進行SDS-PAGE電泳，轉膜后使用脫脂奶粉封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育2小時，顯色后使用凝膠成像系統(tǒng)進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 本實驗所有計量資料采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SalB對各組大鼠肝組織羥脯氨酸(HYP)含量的影響 HYP是衡量肝組織纖維化程度的一個重要指標，實驗結果顯示，與A組相比，B組大鼠肝臟HYP含量明顯上升(P<0.01)，與B組相比，D組大鼠肝臟HYP含量明顯下降(P<0.05)，與A組相比，C組大鼠肝臟HYP含量未發(fā)生明顯變化，見表1。

表1 SalB對各組大鼠肝臟HYP含量的影響

2.2 明膠酶譜法測定大鼠肝臟MMP-2、MMP-9的活性 A組大鼠肝臟中MMP-2、MMP-9活性較低，經(jīng)過DMN誘導后，肝臟中MMP-2、MMP-9活性明顯上升。而與B組相比，D組大鼠肝臟中MMP-2、MMP-9的活性明顯下降。與A組相比，C組大鼠肝臟MMP-2、MMP-9的活性無明顯變化，見圖1。

2.3 Western Blot測定大鼠肝臟AP-1、Sirt-1蛋白表達水平 A組大鼠AP-1表達水平較低，經(jīng)過DMN的誘導，B組大鼠AP-1表達水平明顯升高(P<0.01)，與B組相比，D組大鼠AP-1表達水平明顯下降(P<0.01)，見圖2。Sirt-1的表達則呈現(xiàn)出與AP-1相反的趨勢，A組大鼠肝臟就有一定量的Sirt-1的表達，而經(jīng)過DMN誘導后，與A組相比，B組大鼠肝臟Sirt-1的表達受到明顯抑制(P<0.01)，與B組相比，D組大鼠肝臟Sirt-1水平明顯上升(P<0.05)。此外，與A組相比，C組大鼠Sirt-1水平明顯上升(P<0.05)，見圖3。

圖1 丹參酚酸B對MMP-2、MMP-9活性的影響

圖2 丹參酚酸B對AP-1蛋白表達的影響

圖3 丹參酚酸B對Sirt-1蛋白表達的影響

3 討論

肝纖維化是一種以ECM沉積和重構為主要特征的進行性疾病。目前的觀點認為肝纖維化是一種可逆的病變[4]，但由于肝纖維化的發(fā)病機制尚未明確，所以臨床上缺乏相應的治療手段，因此在本研究中我們使用DMN誘導大鼠產(chǎn)生肝纖維化，探討SalB抗肝纖維化的作用機制。

HYP是一種在結締組織中特異性表達的氨基酸，在肝纖維化發(fā)生的過程中，由于ECM大量增生，HYP的水平也會隨之上升。因此，肝勻漿中的HYP水平可以反應大鼠肝纖維化的程度[5]。本實驗結果顯示，經(jīng)過DMN誘導后，大鼠肝勻漿中HYP水平明顯上升，而在D組，大鼠肝勻漿中的HYP水平明顯下降，這證明DMN誘導大鼠產(chǎn)生了明顯的肝纖維化，而SalB則具有明顯的抑制肝纖維化的藥理作用。

進一步研究SalB抗肝纖維化的作用機制，我們將研究重點集中到了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)上。在肝纖維化的發(fā)生與進展過程中，MMP起到了決定性的作用。不同類型的MMP在肝纖維化發(fā)生與進展過程中的作用并不完全相同[6]。目前的研究普遍認為MMP-2和MMP-9可以降解正常的ECM，加速肝纖維化的進展[7]。在本研究中，明膠酶譜法的結果顯示，B組大鼠肝臟中MMP-2、MMP-9的活性明顯上升，而經(jīng)過SalB治療后，與A組相比，D組大鼠肝臟MMP-2、MMP-9的水平明顯下降。以上結果證實了SalB抗肝纖維化的機制之一是抑制了MMP-2和MMP-9的表達。通過后續(xù)的研究，我們認為SalB抑制MMP-2和MMP-9的表達與其上游的轉錄因子Sirt-1、AP-1密切相關。

Sirt-1是一種廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)依賴NAD+的去乙?；?，通過對多種轉錄因子的去乙?；饔谜{(diào)控相應基因的轉錄[8]。AP-1是MMP-2和MMP-9上游的轉錄因子，目前的研究認為AP-1可以激活MMP-2和MMP-9的轉錄[9,10]。AP-1是由c-fos和c-jun相互結合而形成的異源二聚體，一旦c-jun與c-fos結合形成AP-1就會激活其下游基因的轉錄[11]。Sirt-1可以與c-jun結合，從而對c-jun去乙?；?，而去乙酰化的c-jun不能與c-fos結合形成AP-1[12,13]。我們的實驗結果顯示，經(jīng)過DMN誘導，大鼠AP-1的表達明顯升高，經(jīng)過SalB治療后，大鼠AP-1的水平明顯下降，這證明肝纖維化大鼠肝臟中MMP-2和MMP-9活性升高的一個重要原因是AP-1的高表達。進一步研究結果顯示，B組大鼠Sirt-1表達水平明顯降低，而在D組中，大鼠Sirt-1表達水平明顯提高，以上結果顯示Sirt-1的表達與AP-1的表達呈現(xiàn)出負相關，從而證實了Sirt-1的高表達對AP-1具有負性調(diào)節(jié)作用。同時，與A組相比，C組大鼠Sirt-1表達也有一定程度的提高，這證實了SalB具有激活Sirt-1表達的作用。

綜上所述，我們認為SalB具有明顯的抗肝纖維化的作用，這種作用的機制之一是由于SalB激活了Sirt-1的表達，負性調(diào)節(jié)AP-1，從而抑制MMP-2和MMP-9的表達而產(chǎn)生的。

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(庫雪飛 編輯)

Effect of liver fibrosis model in rats by salvianolic acid B resistant sirt-1

WUHang

(HezeMedicalCollege,Heze274000,China)

Objective To explore the molecule mechanism of anti-hepatic fibrosis by Salvianolic acid B(SalB).Methods A total of 48 SD rats were randomly divided into four groups:(A) control group,(B) DMN group,(C) SalB group,(D) DMN+SalB group.Rats in B and D group were intraperitoneally injected with dimethylnitrosamine(DMN) three times a week,for four weeks. Rats in C and D group were lavaged by SalB once daily,for six weeks.The last time to fill the stomach after fasting for 24 hours,take the liver specimens.Then detected the level of HYP,MMP-2,MMP-9,AP-1 and Sirt-1.Results The levels of HYP,MMP-2,MMP-9 and AP-1 were significantly higher in the B group.However compared with B group,the level of HYP,MMP-2,MMP-9，and AP-1 were significantly lower in D group.The level of Sirt-1 in D group was higher than B group.Conclusion SalB has obvious effect on anti liver fibrosis, the molecule mechanism is related to inhibit MMP-2 and MMP-9 by Sirt-1 activation.

Salvianolic acid B.Hepatic fibrosis.Sirt-1.MMP-2.MMP-9

吳 航(1987- )，男，碩士，助教。研究方向：分子藥理學。

R 657.3

A

2095-2694(2016)05-349-04