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    Wistar大鼠福氏佐劑性類風濕關節(jié)炎動物模型研究

    2016-12-07 02:49:01朱玉芳裴銀輝周芳媛熊艷杰董素寧趙一帆鄭亞楠
    關鍵詞:足趾增殖率佐劑

    朱玉芳 裴銀輝 周芳媛 熊艷杰 董素寧 趙一帆 鄭亞楠

    華北理工大學 河北唐山 063000

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    Wistar大鼠福氏佐劑性類風濕關節(jié)炎動物模型研究

    朱玉芳 裴銀輝 周芳媛 熊艷杰 董素寧 趙一帆 鄭亞楠

    華北理工大學 河北唐山 063000

    ①目的 探討Wistar大鼠佐劑性類風濕關節(jié)炎造模效果,為類風濕關節(jié)炎發(fā)生機制及治療效果等相關研究中動物模型的應用提供實驗依據。②方法 將大鼠隨機分為兩組,分別為模型組和正常對照組,每組各20只。模型組于大鼠右足趾皮下注射福氏完全佐劑(CFA)0.15mL,造模后第7、14、21、28天對兩組大鼠進行關節(jié)炎評分。測量每組大鼠右足趾關節(jié)腫脹度,分離脾臟并制備脾細胞懸液,計算脾細胞增殖率,ELISA法檢測血清中IL-10與IL-17的含量。③結果 模型組致炎后7天足趾腫脹達峰值,14天后再度腫脹,21天出現皮膚潰瘍,28天后潰瘍面進一步擴大。大鼠模型組第14天脾細胞增殖率高于第7天和第21天,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),模型組不同時期脾細胞增殖率均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組第7、28天關節(jié)炎評分高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);第7、14、28天血清中IL-10與IL-17的含量高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。④結論 模型組關節(jié)腫脹明顯,大鼠表現接近于人體的類風濕關節(jié)炎(RA),且造模過程簡單、穩(wěn)定,是研究RA的較理想模型。

    類風濕關節(jié)炎 Wistar大鼠 動物模型 福氏完全佐劑

    類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病,表現為對稱小關節(jié)的慢性關節(jié)滑膜炎癥,而且以炎癥的持續(xù)反復發(fā)作為主要特征[1]。其病程主要表現為關節(jié)滑膜增生和血管翳形成,繼而造成關節(jié)軟骨的破壞,最終導致骨、關節(jié)壞死從而致殘。我國RA的患病率為0.32%~0.36%,略低于0.5%~1%的世界平均水平[2,3],是造成人類勞動力喪失和致殘的主要因素之一。該疾病確切病因及發(fā)病機制尚未完全明確,目前尚無有效的治療方法。由于RA是由環(huán)境、免疫、遺傳、感染等多種復雜因素共同作用的結果,而目前的RA動物模型只是在特定條件下,選取其中某一個或某幾個側重因素而建立起來,并不能完全反映RA的所有屬性,不同的RA動物模型可能只代表RA發(fā)病特點的某一個或某幾個方面。其次,RA患者臨床表現的局部疼痛、全身發(fā)熱、活動情況、飲食改變等都能通過患者的主訴反映出來,但RA動物模型的所有這些指標卻無法客觀反映出來。因此,建立與人類臨床及病理表現相似的動物模型,可為探討RA的病因、發(fā)生機制、病理進程,進一步尋找有效的治療手段奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 一般材料 5周齡雌性Wistar大鼠40只,體質量為(175.3±15.8)克。購自華北理工大學實驗動物中心(動物合格證號SCXK(軍)2014-0001),適應性喂養(yǎng)1周(動物房許可證號SYXK(冀)2015-0038)。隨機分為兩組,佐劑型關節(jié)炎模型組和正常對照組,每組20只。造模后所有動物均在同等條件下喂養(yǎng),自由飲水進食,普通飼料定時、定量喂養(yǎng),選擇光線充足,通風良好的實驗環(huán)境下飼養(yǎng)。

    1.2 儀器與試劑 卡介苗購自上海瑞楚生物科技有限公司;羊毛脂購自中國嘉定華亭羊毛脂廠;液體石蠟購自天津市大茂化學試劑廠;75%酒精;白細胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒,96人份購自聯科生物技術有限公司(批號231041231);白細胞介素-17(IL-17)ELISA試劑盒,96人份購自美國eBioscience公司(批號109559013);促凝管(生化用)購自上??迫A檢驗醫(yī)學產品有限公司;SL-N電子天平購自上海民橋精密科學儀器有限公司;游標卡尺購自深圳市新德亞精密儀器有限公司;酶標儀購自美國伯樂Bio-RAD公司。

    1.3 方法

    1.3.1 佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)模型制備。福氏完全佐劑(complete frennd's adjuvant,CFA)的配制:取羊毛脂16克與液體石蠟(72mL)加溫后置于研缽中,然后將卡介苗62毫克滴加入研缽(逐滴加入),充分研磨均勻后分裝至1.5mLEP管中,置8磅高壓20分鐘。

    模型組大鼠用75%酒精對大鼠右足趾進行消毒,將CFA 0.15mL注射于大鼠右足趾皮下,對照組不經任何處理。在實驗后的第7、14、21、28天分四批次處死動物,每次每組隨機取5只。觀察記錄不同發(fā)病階段大鼠一般狀況,包括毛發(fā)整齊、光澤度、體質量、行動遲緩度、精神狀態(tài)等;觀察耳、尾、足是否出現關節(jié)紅腫及其他炎癥反應。對兩組大鼠進行關節(jié)炎評分,測量每組大鼠右足趾關節(jié)腫脹度;分離脾臟并制備脾細胞懸液,計算脾細胞增殖率; ELISA法檢測血清中IL-10與IL-17的含量。

    1.3.2 關節(jié)炎評分。根據關節(jié)炎發(fā)病大鼠的關節(jié)紅腫程度和范圍以及關節(jié)腫脹變形情況,按0~4級進行評分如下:0分,正常;1分,踝關節(jié)有紅斑及輕微腫脹;2分,踝關節(jié)至趾關節(jié)或掌關節(jié)有紅斑及輕微腫脹;3分,踝關節(jié)至掌關節(jié)或趾關節(jié)有紅斑及中度腫脹;4分,踝關節(jié)至趾關節(jié)有紅斑及重度腫脹。每只足趾單獨評分,將四肢評分相加作為關節(jié)炎評分,每只大鼠最高16分。

    1.3.3 ELISA方法檢測大鼠血清中IL-10、IL-17水平。心臟采血2mL,3000r/min離心15分鐘,留取血清于-20℃保存,應用ELISA法檢測大鼠RA模型血清中IL-10、IL-17的含量。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

    1.3.4 脾細胞增殖率。手術摘取大鼠脾臟,將大鼠脾臟放入平皿中置于細胞篩上,倒入生理鹽水研磨,取懸液滴在玻片上,待玻片干燥后進行瑞氏染色,計數100個細胞中陽性的個數。陽性細胞表現為體積增大、胞漿有空泡或細胞可見核仁。

    1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 11.5 軟件進行統(tǒng)計學分析。組內均數比較采用方差分析,組間比較采用t檢驗。檢驗水準取雙側α=0.05。

    2 結果

    2.1 模型組造模后表現 模型組動物造模后食量減退,行動遲緩,精神不振,皮毛失去光澤,體質量輕微下降。致炎后7天左右右足趾腫脹達峰值,持續(xù)3天后逐漸減輕;14天后再度腫脹,表現為對側和前足腫脹,且呈進行性加重,行動不便;于21天左右出現皮膚潰瘍,28天后潰瘍面進一步擴大。

    2.2 模型組不同時期各指標結果比較 經方差分析,模型組脾細胞增殖率在各階段差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);右足趾關節(jié)腫脹度、關節(jié)炎評分、血清中IL-10和IL-17濃度在各階段差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。進一步對脾細胞增殖率在組內各階段的差異進行兩兩比較,第14天大鼠脾細胞增殖率高于第7天和第21天,且其與第7天、第21天比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

    表1 模型組不同時期大鼠各指標結果比較

    2.3 模型組與對照組不同時期各指標結果比較 經t檢驗,大鼠第14、21天右足趾關節(jié)腫脹度高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);第7、14、21、28天關節(jié)炎評分和脾細胞增殖率均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);第7、14、28天血清中IL-10與IL-17的含量高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2~6。

    表2 兩組大鼠不同時期右足趾關節(jié)腫脹度(mm)結果比較

    表3 兩組大鼠不同時期關節(jié)炎評分結果比較

    表4 兩組大鼠不同時期脾細胞增殖率(%)結果比較

    表5 兩組大鼠不同時期血清IL-10濃度結果比較

    表6 兩組大鼠不同時期血清IL-17濃度結果比較

    3 討論

    RA是一種自身免疫性疾病,成功的動物模型是研究RA發(fā)生機制及防治的基礎。目前RA動物模型根據構建方法大體可分為兩大類,即誘導性關節(jié)炎模型和自發(fā)性關節(jié)炎模型。用于實驗的主要是誘導性關節(jié)炎模型,包括佐劑性關節(jié)炎模型、膠原誘導性關節(jié)炎模型、卵蛋白誘導的關節(jié)炎模型、病證結合模型等。這些動物模型雖然均有關節(jié)炎表現,但迄今尚沒有任何一種動物模型能完全模擬人類RA的病理、病程及免疫學變化。 本研究采用雌性Wistar大鼠,通過注射福氏完全佐劑造模[4~7],觀察完全佐劑型造模效果。結果表明:模型發(fā)病機制主要表現為早期致炎部位的炎癥反應,致炎后7天,IL-10和IL-17升高,右足趾關節(jié)腫脹度開始增高,關節(jié)炎評分開始增高,且呈進行性加重,行動不便;第14天左右右足趾關節(jié)腫脹度達到峰值,持續(xù)7天再度腫脹,IL-10和IL-17第14天左右達峰值后開始降低,持續(xù)7天再度升高,于28天左右達峰值。實驗結果表明大鼠不同時期脾細胞增殖率高于對照組,免疫學改變?yōu)镮L-10和IL-17升高。這些表現接近人類RA。AA大鼠與RA患者在關節(jié)腫脹方面具有某些相似性,但AA大鼠存在明顯的細胞免疫異常,表現出較為明顯的免疫功能紊亂現象,而RA患者多同時表現出體液和細胞免疫功能的異常,這可能是AA大鼠免疫功能紊亂與RA患者的不同之處。

    本研究造模方法簡單易操作,造模效果穩(wěn)定,且臨床病理與病程表現及免疫學改變類似于人類RA,是比較理想的類風濕關節(jié)炎動物模型。這能為類風濕關節(jié)炎發(fā)生機制及治療效果評價等相關研究中動物模型的應用提供實驗依據。

    [1] 肖楚吟,潘云峰,吳玉瓊,等.類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞體外增殖活性的研究[J].中華關節(jié)外科雜志,2010,4(5):631-636

    [2] 陸再英,鐘南山.內科學[M].第7版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.848

    [3] 薛盟舉.類風濕關節(jié)炎的中醫(yī)實驗動物模型及評價[J].中醫(yī)雜志,2012,53(17):1512-1515

    [4] Greish S,Abogresha N,Abdel-Hady Z,et al.Human umbilical cord mesenchymal stem cells as treatment of adjuvant rheumatoid arthritis in a rat model[J].World Journal of Stem Cells,2012,4(10):101-109

    [5] 彭傳玉,羅 磊,胡 玲,等.不同劑量弗氏完全佐劑對類風濕關節(jié)炎模型大鼠復制的影響[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(1):1-3

    [6] 李艷玲,祁 芳,許 明,等.常用類風濕關節(jié)炎動物模型研究概況及展望[J].湖南中醫(yī)藥大學學報,2015,35(4):63-66

    [7] 佟 麗,辛增輝,陳育堯,等.Mtb誘導的SD大鼠佐劑性關節(jié)炎模型的建立及評價[J].中國藥理學通報,2009,25(2):259-263

    (2016-04-26 收稿)(庫雪飛 編輯)

    Study on animal model of rheumatoid arthritis with frennd's complete adjuvant in Wistar rats

    ZHUYufang,PEIYinhui,ZHOUFangyuan,etal

    (NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

    Objective To explore the effect of adjuvant rheumatoid arthritis model in Wistar rats,and provide experimental evidence for the application of animal models in the study of the mechanism of rheumatoid arthritis and the evaluation of therapeutic effect.Methods The rats were randomly divided into two groups,model group and normal control group,20 in each group.Rats in model group were injected with CFA 0.15mL.Then respectively to arthritis score of each group rats,measure the joint swelling of rats in each group,and calculate the spleen cell proliferation rate at the 7,14,21 and 28 days.Meanwhile heart blood and serum was separated to detect the content of serum IL-10 and IL-17 with ELISA method.Results Rats in model group induced inflammation after about 7 days the right toe swelling reached the peak.Then the right toe swelling agained about 14 days.The skin ulcer in rats occurred around 21 days.At 28 days,further pathological changed and ulcer surface to further expanded.In model group,The 14 days rats’ spleen cell proliferation rate was higher than 7 days and 21 days,and the difference was significant (P<0.05).The rats’ spleen cell proliferation rate in model group was higher than that in control group at different times,and the difference was significant (P<0.05).The rats’ arthritis score in model group at 7 days and 28 days was higher than the control group,and the difference was significant (P<0.05).The content of serum IL-10 and IL-17 at 7,14 and 28 days were higher than the control group,the difference was significant (P<0.05).

    Rheumatoid arthritis.Wistar rats.Animal model.Frennd's complete adjuvant

    朱玉芳(1987-),女,碩士研究生。研究方向:醫(yī)學檢驗。

    裴銀輝。

    R 392.9

    A

    2095-2694(2016)05-337-04

    Conclusion The rats’ joint swelling of model group is obvious,and the performance of rats is closer to human RA.Then the modeling process is simple and stable, which is an ideal animal model of rheumatoid arthritis.

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