菌酶協(xié)同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的研究

趙小惠，吳麗娜，楊宇杰，方旭波，2*，余輝，袁高峰，張銀照

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316022；3.浙江豐宇海洋生物制品有限公司，浙江舟山316104）

菌酶協(xié)同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的研究

趙小惠1，吳麗娜1，楊宇杰1，方旭波1，2*，余輝1，袁高峰1，張銀照3

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山316022；3.浙江豐宇海洋生物制品有限公司，浙江舟山316104）

本試驗(yàn)以金槍魚暗色肉為原料，主要研究了枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同發(fā)酵制備飼用肽的最佳工藝條件。以飼用肽的小肽含量為指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、加酶量等因素對(duì)飼用肽中小肽含量的影響。最佳菌酶協(xié)同工藝為：發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時(shí)間48 h、接種量2%（V/m）、加酶量200 U/g。在此條件下，小肽含量從28.89 mg/g提高到了185.59 mg/g，氨基酸組成平衡，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在6.5～14.4 kD，大分子蛋白得到有效降解。

金槍魚暗色肉；菌酶協(xié)同處理；飼用肽

金槍魚在加工過程中會(huì)產(chǎn)生高達(dá)三成以上的魚肉、魚骨、魚皮和內(nèi)臟等下腳料，其中暗色肉占50%以上。但是由于加工技術(shù)滯后，小部分下腳料只能通過壓榨、烘干，被簡(jiǎn)單加工成魚粉飼料；也有部分被直接丟棄，這既造成資源浪費(fèi)，又污染了環(huán)境，導(dǎo)致產(chǎn)品資源利用率和附加值較低（胡靜，2015）。目前，對(duì)于金槍魚暗色肉等下腳料的高值化加工利用主要通過酶解法制備飼料肽，對(duì)金槍魚暗色肉的微生物發(fā)酵研究較少。研究表明，采用微生物發(fā)酵法制備肽能夠提高飼用肽的適口性，提高小肽含量和蛋白質(zhì)含量，提高消化吸收利用率，而且省去了肽酶和脫苦的成本，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工序（楊虹坤等，2015；劉峰等，2012）。應(yīng)用較廣泛的蛋白飼料發(fā)酵菌種包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌等，其中枯草芽孢桿菌作為益生菌能通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、防止腹瀉、提高免疫力等作用，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高生產(chǎn)性能（祝天龍等，2015）。但是單純依靠微生物發(fā)酵作用所得的小肽含量并不高，而且發(fā)酵周期較長(zhǎng)（張吉鹍，2010）。因此本試驗(yàn)針對(duì)金槍魚下腳料暗色肉的原料特性，優(yōu)化枯草芽孢桿菌和中性蛋白酶協(xié)同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的工藝條件，以提高飼用肽的利用率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為實(shí)際生產(chǎn)飼用肽提供理論指導(dǎo)與技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料金槍魚熟制暗色肉，由浙江豐宇海洋生物制品有限公司提供；中性蛋白酶，由廣西南寧龐博生物工程有限公司提供；枯草芽孢桿菌，由浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院菌種保藏室提供；分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品：維生素B12（Mr1335，上海伯奧生物科技有限公司）、抑肽酶（Mr6500，美國(guó)Sigma公司）、細(xì)胞色素C（Mr14400，美國(guó)Sigma公司）、牛血清白蛋白（Mr66700，華美生物工程有限公司）。其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海棱光技術(shù)有限公司；BS110電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；四方均質(zhì)器，鐵道部電化院四方電氣設(shè)備廠；DGC-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京林茂科技有限公司；HYP-1004消化爐，上海纖檢儀器有限公司；KDN-9140MBE自動(dòng)定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；UV-6000紫外分光光度計(jì)，蘇州江東精密儀器有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫有限公司；AKTA Purification10蛋白純化系統(tǒng)，瑞典安瑪西亞公司。

1.3培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)液

1.3.1斜面培養(yǎng)基蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，MnSO4·H2O 5 mg，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.3.2搖瓶培養(yǎng)基蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.3.3營(yíng)養(yǎng)液2%（NH4）2·SO4，0.5%葡萄糖，0.4%KH2PO4，0.1%MnSO4。

1.4方法

1.4.1種子液的制備參照孫宏（2013）的方法，從斜面培養(yǎng)基挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌接入40 mL搖瓶培養(yǎng)基中，在250 mL的三角瓶中于37～40℃溫度下培養(yǎng)20～24 h，即得到種子液。

1.4.2飼用肽的制備精確稱取50 g金槍魚暗色肉，于121℃條件下滅菌15 min，冷卻到40～50℃。在無菌操作下添加一定量的種子液和一定量的中性蛋白酶，并加入50 mL的營(yíng)養(yǎng)液調(diào)節(jié)物料含水量至30%～40%(m/m)?；旌暇鶆蚝髮⑽锪戏盅b入若干個(gè)三角瓶中，用六層紗布封口。置于恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵一定時(shí)間后取出，50℃烘干，粉碎過80目篩后即得飼用肽，備用待測(cè)。

1.4.3菌酶協(xié)同工藝的單因素試驗(yàn)

1.4.3.1發(fā)酵溫度對(duì)飼用肽的小肽含量的影響在發(fā)酵時(shí)間36 h，接種量1%（V/m），加酶量250 U/g條件下發(fā)酵，溫度分別選擇21、30、37、44℃，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定飼用肽的小肽含量。

1.4.3.2發(fā)酵時(shí)間對(duì)飼用肽的小肽含量的影響在發(fā)酵溫度30℃，接種量1%（V/m），加酶量250 U/g條件下，分別發(fā)酵12、24、36、48、60 h，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定飼用肽的小肽含量。

1.4.3.3接種量對(duì)飼用肽的小肽含量的影響在發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，加酶量250 U/g條件下，分別接種0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%（V/m）的種子液，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定飼用肽的小肽含量。

1.4.3.4加酶量對(duì)飼用肽的小肽含量影響在發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，接種量1%（V/m）條件下，分別添加中性蛋白酶0、100、150、200、250、300、350 U/g，發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定飼用肽的小肽含量。

1.4.4菌酶協(xié)同工藝的正交優(yōu)化試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量、加酶量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為試驗(yàn)因子，進(jìn)行四因素三水平L9（34）的正交優(yōu)化試驗(yàn)，以飼用肽的小肽含量為指標(biāo)，篩選出優(yōu)化組合。

1.4.5飼用肽的測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.5.1飼用肽常規(guī)成分分析粗蛋白質(zhì)含量依據(jù)GB/T 5009.5—2010凱氏定氮法測(cè)定；粗脂肪含量依據(jù)GB/T 5512—2008測(cè)定；粗灰分含量依據(jù)GB/T 6438—2007測(cè)定。

1.4.5.2小肽含量測(cè)定飼用肽測(cè)定參照陳升軍等（2008）的方法。

1.4.5.3氨基酸成分分析氨基酸測(cè)定參照胡燃等（2015）的方法。

1.4.5.4飼用肽的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定菌酶協(xié)同發(fā)酵后的金槍魚暗色肉蛋白經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)凝膠色譜柱分離后，與標(biāo)準(zhǔn)品比較。選用牛血清白蛋白、細(xì)胞色素C、抑肽酶、維生素B12作為相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品。AKTA蛋白純化系統(tǒng)凝膠條件為流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.2；分析柱：Superdex75 10/300 GL預(yù)裝柱；色譜設(shè)備：AKTA蛋白純化系統(tǒng)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1不同發(fā)酵溫度對(duì)小肽含量的影響由圖1可知，在23、30、37、44℃條件下發(fā)酵時(shí)，飼用肽的小肽含量分別較未發(fā)酵提高72.17、121.07、132.35、121.45 mg/g。在37℃下發(fā)酵時(shí)，小肽含量提高幅度最大，此時(shí)小肽含量為161.24 mg/g。當(dāng)溫度為44℃時(shí)，小肽含量較37℃下降10.9 mg/g，這可能是由于溫度過高會(huì)影響枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖，從而減小產(chǎn)酶量和減弱了蛋白酶的活力，同時(shí)影響中性蛋白酶的活力，因此飼用肽的小肽含量呈下降趨勢(shì)。所以可確定較佳的發(fā)酵溫度為37℃（圖1）。

2.1.2不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)小肽含量的影響由圖2可知，在發(fā)酵12、24、36、48、60 h后，飼用肽的小肽含量分別較未發(fā)酵提高59.97、93.9、121.07、130.1、126.49 mg/g。發(fā)酵48 h時(shí)小肽含量提高幅度最大，小肽含量高達(dá)159.05 mg/g。發(fā)酵60 h后小肽含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)可能是部分小肽分解成為游離氨基酸；也可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏影響枯草芽孢桿菌代謝活動(dòng)，大大減少蛋白酶的生成；也可能是發(fā)酵時(shí)間過長(zhǎng)容易感染一些其他雜菌，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會(huì)影響發(fā)酵環(huán)境。從生產(chǎn)成本考慮，確定48 h是較佳的發(fā)酵時(shí)間。

圖2　不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)小肽含量的影響

2.1.3不同接種量對(duì)小肽含量的影響從圖3可知，在接種量為0.5%、1.0%、2%、3%、4%（V/m）條件下發(fā)酵，飼用肽的小肽含量分別較發(fā)酵前提高73.67、121.07、131.36、130.24、129.25 mg/g。在2%時(shí)，飼用肽的小肽含量提高幅度最大，小肽含量達(dá)到160.25 mg/g。不斷接種種子液，小肽含量變化呈先增加、后平緩的趨勢(shì)，說明初始發(fā)酵環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較充足，增大接種量會(huì)提高小肽含量；隨著接種量進(jìn)一步的增大，金槍魚暗色肉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗大半，枯草芽孢桿菌菌種代謝受到抑制，從而導(dǎo)致小肽含量有所下降。所以本試驗(yàn)選擇2%（V/m）作為較佳的接種量。

圖3　不同接種量對(duì)小肽含量的影響

2.1.4不同加酶量對(duì)小肽含量的影響蛋白酶可將多種蛋白質(zhì)水解為小分子的肽類及氨基酸，因此加酶量是影響菌酶協(xié)同制備飼用肽的重要變量之一。由圖4可知，當(dāng)加酶量為100、150、200、250、300、350 U/g時(shí)，飼用肽的小肽含量分別較發(fā)酵前提高了71.66、111.39、119.28、122.07、120.96、119.56 mg/g。所以當(dāng)添加250 U/g的蛋白酶時(shí)，小肽含量提高最大，小肽含量達(dá)到最高，為149.96 mg/g。在繼續(xù)添加中性蛋白酶，小肽含量的變化不大，這說明一定范圍內(nèi)的加酶量能有效提高小肽含量，再添加蛋白酶出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)檫^量的蛋白酶把小肽進(jìn)一步水解為游離氨基酸。所以本試驗(yàn)確定250 U/g作為較佳的加酶量。

圖4　不同加酶量對(duì)小肽含量的影響

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以飼用肽的小肽含量為考察指標(biāo)，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量、加酶量為考察因子，進(jìn)行四因素三水平L9（34）的正交優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1所示。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)榻臃N量>加酶量>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間，接種量、加酶量較發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)小肽含量影響大。較佳菌酶協(xié)同組合為A2B2C2D2即發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，接種量2.0%（V/m），加酶量200 U/g，此組合與單因素試驗(yàn)得出菌酶協(xié)同組合A2B3C2D2相比，加酶量不同。對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析可知，加酶量有一個(gè)逐漸飽和的趨勢(shì)，之后繼續(xù)提高加酶量，小肽含量有下降趨勢(shì)。因此對(duì)這兩個(gè)組合分別進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得小肽含量分別為（185.28±0.31）mg/g和（182.59±0.27）mg/g。結(jié)果表明A2B3C2D2組合沒有A2B2C2D2組合小肽含量高。所以從生產(chǎn)成本和效率考慮，確定發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，接種量2.0%（V/m），加酶量200 U/g為最佳菌酶協(xié)同工藝。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3飼用肽的主要成分

2.3.1飼用肽的常規(guī)成分表2的結(jié)果表明，與原金槍魚暗色肉相比，飼用肽的粗蛋白質(zhì)含量和小肽含量較高，分別較發(fā)酵前提高11.2 mg/g和156.7 mg/g；粗脂肪、灰分含量有所下降，分別較未發(fā)酵前下降2.01 mg/g和2.26 mg/g。

表2　飼用肽的常規(guī)成分測(cè)定mg/g

2.3.2飼用肽的氨基酸組成經(jīng)過酸處理后，總氨基酸含量較未發(fā)酵前提高7.19 g/100 g；各氨基酸中增加幅度最大的氨基酸是谷氨酸，較未發(fā)酵前提高1.31 g/100 g；必需氨基酸中賴氨酸的含量增加最多，較未發(fā)酵提高0.41 g/100 g；呈味氨基酸中，甘氨酸含量較未發(fā)酵前提高0.82 g/100 g，天冬氨酸含量較未發(fā)酵前提高0.93 g/100 g，谷氨酸含量較未發(fā)酵前提高1.31 g/100 g，從而能有效減少飼用肽的苦味。可見，經(jīng)菌酶協(xié)同處理后，飼用肽中各種氨基酸組成比例平衡，必需氨基酸種類豐富。

表3　飼用肽的氨基酸組成分析g/100 g

2.3.3飼用肽的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布菌酶協(xié)同處理后的金槍魚暗色肉蛋白經(jīng)AKTA蛋白純化系統(tǒng)凝膠色譜柱分離后，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行比較，其蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大部分集中在6.5～14.4 kD，小于1.3 kD也占部分，說明飼用肽中的大部分蛋白質(zhì)得到有效降解，以多肽、小肽或氨基酸形式存在（圖5）。由此可見，經(jīng)菌酶協(xié)同處理后，提高了飼用肽的吸收利用率，有效提升了飼用肽的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

圖5　飼用肽的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布

3　結(jié)論

經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定了菌酶協(xié)同處理金槍魚暗色肉制備飼用肽的最佳發(fā)酵工藝為發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，接種量2.0%（V/m），加酶量200 U/g。在此條件下，小肽含量從28.89 mg/g提高到185.59 mg/g；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量集中在6.5～14.4 kD，說明經(jīng)菌酶協(xié)同處理后的大分子蛋白得到良好的降解，飼用肽的利用率得到提高；對(duì)氨基酸組成分析可知飼用肽的總氨基酸含量豐富，氨基酸比例適當(dāng)，且必需氨基酸含量平衡。

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An orthogonal experiment was conducted to investigate the optimal conditions of tuna dark meat fermentation by bacillus subtilis and a neutral protease for small peptides production.With the yield of small peptides as index，fermentation temperature，fermentation time，inoculation and additive amount of enzyme were determined，through single-factor and orthogonally experiment.The optimal fermentation methods were obtained：fermentation temperature was 37℃，fermentation time was 48 h，inoculums size of bacillus subtilis was 2.0%,and 200 U/g of neutral protease.Under these conditions，the content of small peptides increased from 28.89 mg/g to 185.59 mg/g，amino acid composition was balanced，protein molecular weight mainly was 6.5～14.4 kD，and macromolecular protein was effectively degraded away.

tuna dark muscle；bacteria and neutral enzyme synergy fermentation；feed peptide

S816.7

A

1004-3314（2016）10-0019-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161006

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C32034）；國(guó)家級(jí)大創(chuàng)項(xiàng)目（14131062713）