稀有鮈鯽神經發(fā)育相關基因的克隆、同源性分析及組織分布

陳曦，洪響生，吳慧敏，查金苗，覃劍暉

1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢430070

2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京100085

稀有鮈鯽神經發(fā)育相關基因的克隆、同源性分析及組織分布

陳曦1,2，洪響生1,2，吳慧敏1,2，查金苗2,*，覃劍暉1

1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢430070

2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質學國家重點實驗室，北京100085

作為重要的本土模式魚類,稀有鮈鯽神經發(fā)育相關的生物學背景幾乎空白,導致其在神經毒性評價方面的應用受到限制。本文從稀有鮈鯽腦部克隆得到了神經發(fā)育相關的神經生長因子(nerve growth factor；ngf)、腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor；bdnf)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；gfap)、髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein；mag)、P0蛋白(myelin protein zero；mpz)、微管蛋白α1(α1-tubulin)和Y染色體性別決定基因10(SRY-box containing gene 10；sox10)等基因的片段,并對其進化樹及表達譜進行了分析。序列分析表明,bdnf的核苷酸序列與鯽魚、鯉魚的同源性最高,均為98%；gfap、ngf、mag和α1-tubulin與斑馬魚的同源性最高,分別為95%、92%、92%和96%；mpz與黑頭軟口鰷的同源性最高,為94%；sox10與鳙魚同源性最高,達97%。表達譜分析結果表明,ngf、bdnf、mag、mpz、α1-tubulin和sox10基因均在腦組織中表達量最高,gfap在脊髓中表達量最高,上述結果為這一模式魚類在神經發(fā)育學和神經毒性效應評價方面的應用奠定了基礎。

神經系統發(fā)育相關基因；稀有鮈鯽；克隆；同源性分析；組織分布

神經系統的發(fā)育主要包括特定神經元的增殖、分化、遷移以及死亡,神經突產生、突觸發(fā)生和髓鞘形成等多級過程。其中任何環(huán)節(jié)受到干擾都會產生持續(xù)的影響[1-2]。神經生長因子(nerve growth factor；ngf)、腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor；bdnf)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein；gfap)、髓鞘相關糖蛋白(myelin-associated glycoprotein；mag)、P0蛋白(myelin protein zero)、微管蛋白α1(α1-tubulin)、Y染色體性別決定基因10(SRY-box containing gene 10)是參與神經系統發(fā)育過程的重要基因。ngf是第一個發(fā)現的神經營養(yǎng)因子,具有調節(jié)神經元發(fā)育和分化的作用。bdnf是含量最豐富的神經營養(yǎng)因子,在哺乳動物腦中廣泛存在且參與多種調控過程,例如神經元的分化、突觸的形成,還與學習記憶功能密切相關[3-4]。gfap是星形膠質細胞的標志性蛋白,在神經發(fā)育和成熟中發(fā)揮重要的作用[5-6]。mag是中樞神經系統中一個小的跨膜糖蛋白,占髓鞘蛋白總量的1%左右,可以被當作少突膠質細胞的生物標志物[7],mpz為形成髓鞘的主要結構原件的調控基因,作用過程包括調控施旺細胞的細胞膜附著,包裹住軸突,形成緊湊的髓鞘,且可以刺激受傷軸突的再生,影響髓鞘的結構和功能[8]。α1-tubulin是α-tubulin基因家族的微管蛋白之一,對運動神經元功能的維持以及軸突和樹突的生長起著重要的作用。Sox10基因與神經膠質細胞的發(fā)育密切相關,在神經脊的發(fā)育神經色素的衍生方面發(fā)揮重要作用[9]。

目前神經發(fā)育相關基因的研究還處于初級階段,大多集中在表達水平和功能上的研究。Fan等[10]采用定量PCR技術,構建了斑馬魚α1-tubulin、bdnf等基因的早期發(fā)育階段表達譜,揭示了早期發(fā)育過程中,發(fā)育時間與基因表達的關系。Bernardos[11]發(fā)現斑馬魚在12 hpf時就可以檢測到gfap。新生大鼠暴露一定濃度的毒死蜱,ngf基因mRNA的表達水平受到強烈抑制,mag的表達量在出生后7 d(PND7)顯著升高[12]；Capiotti等[13]對斑馬魚研究發(fā)現,腺苷受體、DARPP-32和bdnf表達于斑馬魚發(fā)育早期,受到咖啡因作用后,由于機體補償機制,腺苷受體和基因表達的上調；Wang[14]研究了尼古丁對新生大鼠神經營養(yǎng)因子bdnf和ngf的影響,bdnf和ngf表達于海馬體和額皮質,尼古丁暴露后,與對照組相比,所有實驗組的神經營養(yǎng)因子表達量都顯著降低。然而多個神經發(fā)育相關基因的系統研究基本上未見報道,大大限制了神經發(fā)育功能標志物以及相關機制的研究。

本研究中,使用我國特有的一種小型鯉科魚類——稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)作為研究對象。稀有鮈鯽主要分布于我國長江上游地區(qū),它體積小,易于培養(yǎng),性成熟快,繁殖周期短,在實驗室條件下可以周年繁殖,產卵多、孵化率高,是一種理想的實驗材料[15-16]?；谙∮絮L鯽為我國特有魚類,全基因組缺乏,特別是對于神經發(fā)育相關基因研究基本上處于空白,因此本文采用RT-PCR的方法,克隆了稀有鮈鯽神經系統發(fā)育相關的7個基因的片段,開展了同源性分析,同時構建相應定量PCR方法,確定了上述基因在稀有鮈鯽不同組織表達分布特征,為神經系統發(fā)育的研究提供了分子生物學資料,同時也為外源性化合物對魚類神經系統發(fā)育的毒理學影響等方面的研究提供了研究方法和基礎資料。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

Trizol reagent、反轉錄酶 M-MLV、Oligo(dT)、dNTP、Rnasin、純化試劑盒等均購于美國Promega公司。其他常用試劑均為國產分析純。

1.2 稀有鮈鯽的飼養(yǎng)

所用稀有鮈鯽均飼養(yǎng)于本實驗室。養(yǎng)殖用水為曝氣除氯并且經過活性炭過濾的自來水(pH=7.2～7.6),硬度為44.0～61.0mg CaCO3·L-1,溫度為(25± 1)℃,光照周期為16 h:8 h(晝:夜)。每天投喂新孵化的豐年蟲(Artemia nauplii)和水蚯蚓。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

取稀有鮈鯽于冰上麻醉,迅速解剖取出腦、肝臟、鰓等組織,使用Trizol法提取組織總RNA并置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

按照promega公司M-MLV的逆轉錄說明書合成cDNA第一鏈,所有試劑均購自美國promega公司。總RNA 2μg,Oligo(dT)2μL,無核酸酶水補齊至15μL混勻,于70℃溫育5 min,迅速于冰中冷卻。然后依次加入:5μL 5x Reaction Buffer MMLV,1.25μL dNTP mix,1μL RNAasin,2μL MMLV和ddH2O 0.75μL,總共25μL體系,整個過程在冰上進行?；靹蚝笾糜?2℃溫育1 h,并于-20℃凍存。

1.4 基因克隆

根據GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中與稀有鮈鯽親緣關系較近的已知魚類的目的基因序列,利用DNAMAN6.0.40軟件進行比對,選擇其保守區(qū)設計引物,以腦組織cDNA為模板,進行PCR擴增。PCR總反應體系為25μL:1μL cDNA模板、1μL上游引物、1μL下游引物、12.5μL mastermix和9.5μL ddH2O。PCR擴增條件為: 94℃預變性5 min；94℃ 30 s,57℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環(huán)；最后延伸10 min。PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并將產物送去北京生工工程技術有限公司進行測序。

1.5 序列分析及系統發(fā)育樹的構建

所測序列在 NCBI(http://www.ncbi.nih.gov/ BLAST/)上進行BLAST分析,判定是否為目的基因,同時將序列提交至GenBank數據庫。

將基因序列利用DNAman軟件分析,推導出氨基酸序列。從GenBank上下載不同物種基因的氨基酸序列,利用Clustal X 1.81軟件進行序列的比較,并用Mega 5.1軟件構建系統發(fā)育樹。

1.6 熒光定量PCR

熒光定量PCR采用熒光定量PCR儀7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems,USA),內參基因使用管家基因β-actin,根據測序得到的序列設計定量PCR引物。定量PCR反應體系為:2μL cDNA模板、0.4μL正向引物、0.4μL反向引物、10μL GoTaq?qPCR Master Mix和7.2μL ddH2O。PCR反應程序為95℃,10 min；40個循環(huán):95℃ 15 s,57℃ 40 s,72℃ 30 s；最后1個循環(huán)做出熔解曲線:95℃ 30 s,57℃30 s,72℃ 60 s。每個樣品3次重復。目的基因的相對表達量根據2–ΔΔCt法計算。

1.7 數據處理與分析

所有數據均通過SPSS16.0(SPSS,Chicago,IL, USA)分析處理。熒光定量PCR結果均表示為平均值±標準偏差(means±S.E.),作圖軟件使用Origin-Pro 8.0。

2 結果(Results)

2.1 稀有鮈鯽神經發(fā)育相關基因的克隆

采用RT-PCR技術對稀有鮈鯽腦組織中與神經發(fā)育相關的7個基因(ngf、bdnf、gfap、mag、mpz、α1-tubulin、sox10)進行克隆,片段大小分別為281,413, 554,260,283,368和393 bp。電泳結果表明,各個PCR產物均為單一明亮的條帶(圖1),且實驗重復性較好,可以滿足接下來實驗的要求。將測序得到的片段序列提交至GenBank數據庫,獲得登錄序列號(表1)。

圖1 稀有鮈鯽各基因片段瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of gene segments ofGobiocypris rarus

將序列在NCBI上做Blastn分析,與其他典型魚類的同源性分析結果統計于表2?？梢钥闯?bdnf的核苷酸序列與鯽魚、鯉魚的同源性最高,均為98%；gfap、ngf、mag和α1-tubulin與斑馬魚的同源性最高,分別為95%、92%、92%和96%；mpz與黑頭軟口鰷的同源性最高,為94%；sox10與鳙魚同源性最高,達97%。

將獲得的7個基因的核苷酸序列開展了Blastp分析,結果發(fā)現與稀有鮈鯽bdnf基因相似的魚類數量最多,因此以bdnf為例,運用軟件Mega5.1構建了基因序列的核苷酸系統發(fā)育進化樹(圖2)。由圖可知,稀有鮈鯽與斑馬魚、鯽魚等鯉科魚類親緣關系最接近,與大鼠等哺乳類關系較遠。

表1 PCR所用的引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

表2 稀有鮈鯽與其他已知魚類相應核苷酸序列的同源性比較Table 2 Homology comparison of nucleotide sequences betweenGobiocypris rarusand other fish species

圖2 基于NJ(neighbor-joining)法構建的稀有鮈鯽與其他物種bdnf基因的核苷酸系統樹注:涉及物種包括半滑舌鰨(XP_008308227.1),大黃魚(KKF28103.1),Paralichthys olivaceus牙鲆(AAL71888.1),埃氏擬麗魚(AEY99594.1),青鳉(XP_004067087.1),虹鱒(ACY54685.1),墨西哥麗脂鯉(XP_007246974.1),斑馬魚(NP_571670.2),鯽魚(ACF35050.1),鯉魚(Q90322.1),金色大鼠(ACN32758.1),毛足鼠(BAO51936.1),褐家鼠(ACU43589.1),美洲海牛(AEY99501.1)。Fig.2 Phylogenetic tree ofbdnf gene sequence betweenGobiocypris rarusand other species based on NJ(neighbor-joining)methodNote:Cynoglossus semilaevis(XP_008308227.1),Larimichthys crocea(KKF28103.1),Paralichthys olivaceus(AAL71888.1),Maylandia estherae (AEY99594.1),Oryzias latipes(XP_004067087.1),Oncorhynchus mykiss(ACY54685.1),Astyanax mexicanus(XP_007246974.1),Danio rerio(NP_ 571670.2),Carassius auratus(ACF35050.1),Cyprinus carpio(Q90322.1),Mesocricetus auratus(ACN32758.1),Phodopus sungorus(BAO51936.1),Rattus norvegicus(ACU43589.1),Trichechus manatus(AEY99501.1).

基于獲得的序列片段,使用Primer Premier 5.0軟件,設計定量PCR引物,引物序列見表3,并構建相應定量PCR方法,測定了 ngf、bdnf、gfap、mag、mpz、α1-tubulin和sox10基因在稀有鮈鯽腦、脊髓、眼睛、肝臟、性腺、鰓和肌肉7個組織中的mRNA表達量(圖3)。ngf基因在成魚不同組織的的表達量表現為:在腦中表達量最高,性腺、眼和脊髓中也有一定表達,在鰓和肌肉中表達量較低；bdnf基因在成魚不同組織的的表達量表現為:在腦中高表達,其他6個組織中幾乎不表達；gfap基因在成魚不同組織的的表達量表現為:在腦、脊髓和眼中表達水平較高,其余組織中幾乎不表達；mag基因在成魚不同組織的的表達量表現為:在腦中出現大量表達,脊髓中表達較低,其他組織中幾乎不表達；α1-tubulin基因在成魚不同組織的的表達量表現為:在腦、脊髓和眼中均有所表達,在肝臟、性腺、鰓、肌肉中表達極少；mpz除了在腦中表達,脊髓中表達量也相對較高,其他組織中幾乎不表達；sox10在脊髓中表達,表達量明顯低于腦中,同時在眼和肌肉中也可以檢測到,但表達量低于脊髓。結果表明7個基因在腦中表達量相對最高,其他組織中表達存在顯著的差異。

表3 qRT-PCR所用的引物序列Table 3 Primer sequences used for qRT-PCR

圖3 ngf、bdnf、gfap、mag、α1-tubulin、mpz和sox10基因在稀有鮈鯽組織中的表達Fig.3 Expression ofngf,bdnf,gfap,mag,α1-tubulin,mpzandsox10mRNA in a panel tissues of rare minnow

3 討論(Discussion)

稀有鮈鯽作為我國特有的一種小型鯉科魚類,基于個體小、繁殖快、基因純等多個優(yōu)點,越來越多的應用于遺傳、生理和環(huán)境科學等研究領域。然而目前稀有鮈鯽背景分子生物基礎相對薄弱,尤其是神經系統發(fā)育相關的基礎研究處于空白階段。本文克隆了稀有鮈鯽神經系統發(fā)育相關的7個基因:ngf、bdnf、gfap、mag、mpz、α1-tubulin和sox10。序列比對發(fā)現,稀有鮈鯽與斑馬魚的同源性較好,所有基因都和斑馬魚相應的核苷酸序列的同源性超過90%。

神經元是構成神經系統的基本單位,α1-tubulin是合成細胞骨架、維持神經元運動的一種重要的微管蛋白,ngf和bdnf是維持和促進神經元發(fā)育和分化的重要的兩個神經營養(yǎng)因子。ngf是從小鼠下頜中分離得到的,是人們發(fā)現的第一個神經營養(yǎng)因子[17],隨后人們相繼獲得了多種動物的ngf基因片段,序列比較發(fā)現,在不同的物種間,ngf的氨基酸和mRNA序列高度保守[18]；bdnf是含量最豐富的神經營養(yǎng)因子。Leibrock等[19]首次從豬腦中克隆出bdnf基因,1994年余云開等[20]完成了人和豬腦組織中bdnf片段的克隆和序列測定,此外,還進行了爬行類[21]、鳥類[22]及其他哺乳動物[23-24]bdnf基因的序列測定和分析。研究發(fā)現,bdnf在哺乳類甚至整個脊椎動物中高度保守。本研究中,bdnf與鯽魚的同源性最高,達到98%,α1-tubulin、ngf和bdnf與斑馬魚的同源性分別為96%、92%和97%,提示上述基因在稀有鮈鯽與其他魚類中高度保守。每個神經元都有且只有一條軸突,它在離開神經元胞體一定距離后會生成髓鞘,mag和mpz在髓鞘的形成和維持、髓鞘化的啟動過程中發(fā)揮了至關重要的作用,在受到外界干擾時,基因的表達量會降低[12]。

神經膠質細胞是神經系統中數量最多的細胞,約占腦體積的一半以上。gfap和sox10均參與星形膠質細胞的發(fā)育過程,sox基因家族成員都含有一個保守的HMG(High mobility group)盒[25],sox10是sox基因家族的一員,它不但能夠促進神經膠質發(fā)育,而且能影響感覺神經元和自主神經的分化[26],本研究結果顯示,稀有鮈鯽gfap與鯽魚和斑馬魚的基因同源性分別達到94%和93%,其sox10基因與鳙魚的同源性為97%,表明它們在稀有鮈鯽與其他魚類中具有較高的保守型。上述基因的克隆為我們進一步研究它們在遺傳學、基因的表達和調控方面提供了數據,也為稀有鮈鯽在生態(tài)毒理學和風險評價方面的應用奠定了基礎。

本文我們提取了腦、脊髓、眼、肝臟、性腺、鰓和肌肉7個組織,對基因進行了組織表達分布研究。結果表明,bdnf和mag在腦組織中高表達,在其他組織表達量很少甚至不表達,具有組織表達特異性。gfap在稀有鮈鯽脊髓中表達量最高,其次是腦和眼組織。gfap是構成膠質細胞支架的主要部分,其表達量的高低與膠質細胞的活性狀態(tài)密切相關[27],文獻報道gfap參與西加那利蜥蜴(Gallotia gallotia)中樞神經系統的再生過程[28],視網膜是中樞神經系統的外周組織,同樣gfap在視網膜細胞中檢測到了的表達[29]。另外在壁虎研究中發(fā)現同樣gfap主要表達于腦和脊髓中[30]。脊髓是控制軀體及內臟運動和感覺的低級中樞,它聯系了腦與外周神經系統,控制著基本的神經反射。本文gfap基因表達結果表明稀有鮈鯽與蜥蜴、壁虎相類似,表達于腦、脊髓和視網膜中。提示gfap在稀有鮈鯽體內與其他物種有類似功能。對于ngf的研究僅局限于神經系統,但是最近在生殖系統等非神經系統中也檢測到了ngf的表達,表明ngf對生殖系統的生長發(fā)育產生作用[31]。Ren等[32]在山羊卵巢的顆粒細胞、膜細胞、間質細胞及黃體細胞中都檢測到了ngf的表達,表明ngf在卵泡發(fā)育和黃體功能中發(fā)揮重要作用。Shi[33]在金倉鼠子宮進行研究,結果顯示,ngf在子宮內膜上皮細胞、腺細胞中有表達。本文對于ngf表達檢測發(fā)現,除腦、脊髓和眼之外,ngf在稀有鮈鯽的性腺組織中也有較高的表達,表明ngf不僅與神經發(fā)育相關,同時可能與性腺細胞發(fā)育相關。

本文獲得了ngf、bdnf、gfap、mag、mpz、α1-tubulin和sox10基因序列信息和組織中分布,為補充和完善背景生物學信息以及深入研究神經系統的發(fā)育機制提供基礎,同時為進一步研究環(huán)境污染物神經毒性作用機制提供了分子生物學基礎。

[1]Cowden J,Padnos B,Hunter D,et al.Developmental exposure to valproate and ethanol alters locomotor activity and retino-tectal projection area in zebrafish embryos[J]. Reproductive Toxicology,2012,33(2):165－173

[2]Selderslaghs I W,Hooyberghs J,Blust R,et al.Assessment of the developmental neurotoxicity of compounds by measuring locomotor activity in zebrafish embryos and larvae[J].Neurotoxicology and Teratology,2013,37:44－56

[3]Cunha C,Brambilla R,Thomas K L.A simple role for BDNF in learning and memory?[J].Frontiers in Molecular Neuroscience,2010,3(1):1－14

[4]Park H,Poo M M.Neurotrophin regulation of neral cir-cuit development and function[J].Nature Reviews Neuroscience,2013,14(1):7－23

[5]Gomes F C,Garcia-Abreu J,Galou M,et al.Neurons induce GFAP gene promoter of cultured astrocytes from transgenic mice[J].Glia,1999,26(2):97－108

[6]Nielsen A L,Jorgensen A L.Structural and functional characterization of the zebrafish gene for glial fibrillary acidic protein,GFAP[J].Gene,2003,310:123－132

[7]Arquint M,Roder J,Chia L S,et al.Molecular cloning and primary structure of myelin-associated glycoprotein [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1987,84(2):600－604

[8]Zhao L,Liu Q J,Chen H,et al.The effect of 2,5-hexanedione on myelin protein zero expression,and its mitigation using ginkgo biloba extract[J].Biomedical and Environmental Sciences,2011,24(4):374－382

[9]Kelsh R N.Sorting out Sox10 functions in neural crest development[J].BioEssays,2006,28(8):788－798

[10]Fan C Y,Cowden J,Simmons S O,et al.Gene expression changes in developing zebrafish as potential markers for rapid developmental neurotoxicity screening[J].Neurotoxicology and Teratology,2010,32(1):91－98

[11]Bernardos R L,Raymond P A.GFAP transgenic zebrafish [J].Gene Expression Patterns,2006,6(8):1007－1013

[12]Betancourt A M,Burgess S C,Carr R L.Effect of developmental exposure to chlorpyrifos on the expression of neurotrophin growth factors and cell-specific markers in neonatal rat brain[J].Toxicological Sciences,2006,92(2): 500－506

[13]Capiotti K M,Menezes F P,Nazario L R,et al.Early exposure to caffeine affects gene expression of adenosine receptors,DARPP-32 and BDNF without affecting sensibility and morphology of developing zebrafish(Danio rerio) [J].Neurotoxicology and Teratology,2011,33(6):680－685

[14]Wang X Y.The exposure to nicotine affects expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)and nerve growth factor(NGF)in neonate rats[J].Neurological Sciences,2015,36(2):289－295

[15]Liang X F,Wang M,Chen X,et al.Endocrine disrupting effects of benzotriazole in rare minnow(Gobiocypris rarus)in a sex-dependent manner[J].Chemosphere,2014, 112:154－162

[16]曹文宣,王劍偉.稀有鮈鯽—一種新的魚類實驗動物[J].實驗動物科學與管理,2003,20(S1):96－99 Cao W X,Wang J W.Rare minnow:A new laboratory animal in China[J].Laboratory Animal Science and Management,2003,20(S1):96－99(in Chinese)

[17]Cohen S,Levi-Montalcini R,Hamburger V.A nerve growth-stimulating factor isolated from sarcom as 37 and 180[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1954,40(10):1014－1018

[18]Scott J,Selby M,Urdea M,et al.Isolation and nucleotide sequence of a cDNA encoding the precursor of mouse nerve growth factor[J].Nature,1983,302(5908):538－540

[19]Leibrock J L F,Hohn A,Hofer M,et al.Molecular cloning and expression of brain-drived neurotrophic factor [J].Nature,1989,341:149－152

[20]余云開,華仲慰,郭建榮,等.人及豬腦源性神經營養(yǎng)因子基因克隆[J].科學通報,1994,39(1):76－78 Yu Y K,Hua Z W,Guo J R,et al.Cloning of brain-derived neurotrophic factor gene of human and pigs[J]. Chinese Science Bulletin,1994,39(1):76－78(in Chinese)

[21]曹玫,楊玉華,張義正.大涼疣螈腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)基因的克隆與序列分析[J].應用與環(huán)境生物學報,2002,8(3):314－316 Cao M,Yang Y H,Zhang Y Z.Cloning and sequence analysis of brain-derived neurotrophic factor gene ofTylototriton taliangensis[J].Chinese Journal of Applied and Environmental Biology,2002,8(3):314－316(in Chinese)

[22]楊光,陳紅衛(wèi),楊玉華,等.四川山鷓鴣腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)基因的擴增與序列分析[J].四川大學學報:自然科學版,2000,37:195－198 Yang G,Chen H W,Yang Y H,et al.The amplification and sequence analysis of the brain derived neurotophic factor(BDNF)gene form Sichuan Partridge[J].Journal of Sichuan University:Natural Science Edition,2000,37: 195－198(in Chinese)

[23]林峰,楊玉華,張義正,等.小熊貓腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)基因的克隆與序列分析[J].四川大學學報:自然科學版,1997,34(3):367－370 Lin F,Yang Y H,Zhang Y Z,et al.Molecular cloning and sequencing of the brain derived neurotrophic factor(BDNF)gene from lesser panda[J].Journal of Sichuan University:Natural Science Edition,1997,34(3):367－370(in Chinese)

[24]林峰,楊玉華,張義正,等.馬來熊腦源性神經營養(yǎng)因子基因編碼區(qū)的克隆與序列分析[J].動物學報,1998, 44(1):102－106 Lin F,Yang Y H,Zhang Y Z,et al.Molecular cloning and sequence of the coding region of brain derived neurotrophic factor(BDNF)gene fromHelarctos malayanus[J]. Acta Zoologica Sinica,1998,44(1):102－106(in Chinese) [25]Rehberg S,Lischka P,Glaser G,et al.Sox10 is an activenucleocytoplasmic shuttle protein,and shuttling is crucial for sox10-mediated transactivation[J].Molecular and Cellular Biology,2002,22(16):5826－5834

[26]章卓,蘇建明,肖調義.Sox10在感覺神經元發(fā)育中的作用[J].中南林業(yè)科技大學學報,2010,30(10):94－106 Zhang Z,Su J M,Xiao T Y.A genetic investigation of the role of sox10 in sensory neuron development[J].Journal of Central South University of Forestry&Technology, 2010,30(10):94－106(in Chinese)

[27]Bigini P,Bastone A,Mennini T.Glutamate transporters in the spinal cord of the wobbler mouse[J].Neuroreport, 2001,12(9):1815－1820

[28]Romero-Alemán M M,Mo'nzon-Mayor M,Yanes C,et al.Radial glial cells,proliferating periventricular cells,and microglia might contribute to successful structural repair in the cerebral cortex of the lizardGallotia galloti[J].Experimental Neurology,2004,188(1):74－85

[29]Sassoe P M,Panzanelli P,Artero C,et al.Comparative study of glial fibrillary acidic protein(GFAP)-like immunoreactivity in the retina of some representative vertebrates[J].European Journal of Histochemistry,1992,36 (4):467－477

[30]高德宏.多疣壁虎GFAP基因的克隆及其脊髓橫斷損傷后GFAP的表達變化[D].武漢:華中科技大學,2010 Gao D H.The molecular cloning of glial fibrillary acidic protein in Gekko japonicus and its expression changes after spinal cord transection[D].Huazhong University of Science and Technology,2010(in Chinese)

[31]李犇,李秀雯,宋默識,等.神經生長因子及其受體在雌性哺乳動物生殖系統中的作用[J].科技咨詢,2009, 3:9－10 Li B,Li X W,Song M S,et al.The effects of nerve growth factor and its receptors in female mammalian reproductive system[J].Science&Technology Information, 2009,3:9－10(in Chinese)

[32]Ren L,Mohamed S M,Weng Q,et al.Immunolocalization of nerve growth factor(NGF)and its receptors(TrkA and p75LNGFR)in the reproductive organs of Shiba goats[J].The Journal of Reproduction and Development, 2005,51(3):399－404

[33]Shi Z.Studies on expression and regulation of nerve growth factor and inhibin/activin in reproductive organs of the female golden hamster[D].Tokyo:Tokyo University of Agricuture and Technology,2004

Cloning,Homology Analysis,and Distribution of Neural Development Related Genes of Chinese Rare Minnow(Gobiocypris rarus)

Chen Xi1,2,Hong Xiangsheng1,2,Wu Huimin1,2,Zha Jinmiao2,*,Qin Jianhui1,2
1.College of Fishery,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China
2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085,China

15 May 2015 accepted 1 June 2015

The poverty in knowledge of neurodevelopment of Chinese rare minnow(Gobiocypris rarus)limited its application as a native model fish in neurotoxicital studies and risk assessment.In this case,partial of nerve growth factor(ngf),brain-derived neurotrophic factor(bdnf),glial fibrillary acidic protein(gfap),myelin-associated glycoprotein(mag),myelin protein zero(mpz),α1-tubulin and SRY-box containing gene 10(sox10)were cloned frombrain of rare minnow,and their sequences and transcriptional profile were also studied.Blasting results demonstrated that the sequences of gfap,ngf,mag and α1-tubulin in rare minnow shared the highest identities with those of zebrafish(Danio rerio)(95%,92%,92%and 96%,respectively).bdnf gene shared the highest homology with the nucleotide sequence ofCarassius auratusandCyprinus carpio(98%),whereas mpz and sox10 were more homogenous with the nucleotide sequence ofPimephales promelas(94%)andHypophthalmichthys nobilis(97%)respectively.Besides,the transcriptional profile revealed highest abundance of ngf,bdnf,mag,mpz,α1-tubulin and sox10 mRNA in the brain and of gfap in the spinal cord of Chinese rare minnow.These results provided a foundation for future studies in neurodevelopment and neurotoxicity assessment using rare minnow as a native model fish.

neurodevelopment related genes;rare minnow(Gobiocypris rarus);clone;homology analysis;transcriptional profile

2015-05-15 錄用日期:2015-06-01

1673-5897(2016)1-173-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150515001

陳曦,洪響生,吳慧敏,等.稀有鮈鯽神經發(fā)育相關基因的克隆、同源性分析及組織分布[J].生態(tài)毒理學報,2016,11(1):173-181

Chen X,Hong X S,Wu H M,et al.Cloning,homology analysis,and distribution of neural development related genes of Chinese rare minnow(Gobiocypris rarus)[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(1):173-181(in Chinese)

陳曦(1989-),女,碩士,研究方向為漁業(yè)資源,E-mail:chen_xi0309@sina.com；

),E-mail:jmzha@rcees.ac.cn

簡介:查金苗(1975-)，男，博士，研究員，主要研究興趣包括水生生物模型體系的構建和發(fā)展、水環(huán)境生物毒性測試方法、環(huán)境內分泌干擾物的篩選技術研究、環(huán)境污染物對水生生物分子毒理機制和水生態(tài)系統完整性評估方法等，在國內外學術刊物上發(fā)表高水平論文70余篇，SCI論文40余篇。