基于發(fā)光細(xì)菌的細(xì)顆粒物(PM2.5)可溶性提取液綜合生物效應(yīng)測試方法及其應(yīng)用

孫成華， 石愛軍,*， 劉保獻(xiàn)， 張大偉， 陳添， 劉建武， 劉康， 周健楠， 洪姍姍

1.北京市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測中心，北京 100048

2.大氣顆粒物監(jiān)測技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100048

3.北京師范大學(xué)核科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100875

4.北京市環(huán)境保護(hù)局，北京 100048

基于發(fā)光細(xì)菌的細(xì)顆粒物(PM2.5)可溶性提取液綜合生物效應(yīng)測試方法及其應(yīng)用

孫成華1,2， 石愛軍1,2,*， 劉保獻(xiàn)1,2， 張大偉1,2， 陳添4， 劉建武3， 劉康1,2， 周健楠1,2， 洪姍姍1,2

1.北京市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測中心，北京 100048

2.大氣顆粒物監(jiān)測技術(shù)北京市重點實驗室，北京 100048

3.北京師范大學(xué)核科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100875

4.北京市環(huán)境保護(hù)局，北京 100048

為科學(xué)評估PM2.5對生物體綜合生物效應(yīng),研究建立了利用費(fèi)氏弧菌檢測PM2.5水溶性提取液的毒性測試方法,確立了PM2.5樣品提取液發(fā)光細(xì)菌毒性測試實驗質(zhì)量控制辦法。對春節(jié)煙花爆竹燃放和沙塵污染過程的PM2.5實樣測試表明:煙花爆竹燃放期間的PM2.5樣品提取液發(fā)光抑制率值與微量金屬元素等有毒有害組分濃度顯著相關(guān)；沙塵污染期間的PM2.5樣本提取液中地殼元素濃度和發(fā)光抑制率值顯著不相關(guān)。

發(fā)光細(xì)菌；生物毒性測試；發(fā)光抑制率；PM2.5

顆粒物(particulate matter,PM)特指懸浮在空氣中的固體顆粒或液滴,是空氣污染的主要來源之一。顆粒物能夠在大氣中停留很長時間,并可隨呼吸進(jìn)入體內(nèi),粒徑大小不同被吸入并沉積在呼吸系統(tǒng)的部位不同,對機(jī)體的危害也有明顯差異?？諝鈩恿W(xué)直徑小于或等于2.5μm的顆粒物稱為細(xì)顆粒物(PM2.5),與較粗的大氣顆粒物相比,PM2.5粒徑小,相對表面積大,活性強(qiáng),易附帶有毒、有害物質(zhì)(例如,重金屬、微生物等),且在大氣中的停留時間長、輸送距離遠(yuǎn),因而對人體健康和大氣環(huán)境質(zhì)量的影響更大。

PM2.5會對呼吸道及肺產(chǎn)生氧化損傷,引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)與神經(jīng)調(diào)節(jié)改變,從而影響呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。流行病學(xué)研究表明心律失常、心肌梗死、心力衰竭、動脈粥樣硬化、冠心病等都與PM2.5暴露有關(guān)[6]。目前應(yīng)用在PM2.5生物效應(yīng)測試的毒理學(xué)實驗方法主要有動物體內(nèi)染毒實驗[1,7](現(xiàn)多用小鼠)和體外培養(yǎng)細(xì)胞毒性實驗[1-4,8,18-23]。動物染毒實驗所需樣本量大,且實驗周期較長。一般按動物體重選擇染毒劑量,動物個體越大所需樣本量越多,染毒時間一般在24 h以上,劉曉麗等[7]在研究PM2.5對大鼠心肺睪丸的氧化損傷作用時,選擇3個低、中、高染毒組(1.5,7.5,37.5mg·kg-1),1次實驗需要采集至少5 d以上的細(xì)顆粒物樣品,樣品經(jīng)提取濃縮凍干后配制成濃縮液,氣管滴注染毒。

PM2.5通過對呼吸道細(xì)胞及心血管系統(tǒng)氧化應(yīng)激作用產(chǎn)生活性氧(ROS),刺激炎癥因子的產(chǎn)生是目前被普遍接受的細(xì)顆粒物致病機(jī)理模式。體外培養(yǎng)細(xì)胞的毒性實驗主要針對這一機(jī)制開展研究[1-4,8,18-23],這些研究多數(shù)采用部分顆粒物提取物、高劑量染毒,分別針對顆粒物的某一方面的毒性作用評價其對健康的危害,同樣需要采集數(shù)天細(xì)顆粒物(PM2.5)樣品,提取濃縮凍干后配制成不同濃度溶液再開展實驗,樣品提取過程會造成部分揮發(fā)性有機(jī)物組分的損失[2]。體外細(xì)胞培養(yǎng)對實驗環(huán)境要求較高,操作技術(shù)復(fù)雜,實驗染毒時間同樣需要24 h以上。另外針對氧化應(yīng)激效應(yīng),二硫蘇糖醇(DTT)氧化能力實驗[2-3,5]、質(zhì)粒DNA評價法[24-25]也逐漸應(yīng)用于定量評估顆粒物(PM)對體外細(xì)胞的氧化性損傷。

細(xì)顆粒物的生物效應(yīng)研究多是針對其中某些組分(如金屬成分或有機(jī)提取成分)[5]進(jìn)行毒性評價,不能全面反映PM2.5對機(jī)體的毒性效應(yīng)；不同環(huán)境空氣中的細(xì)顆粒物其組成成分是不同的,眾多的大氣污染物可聯(lián)合作用于呼吸系統(tǒng)。部分組分的毒性評價不能完全準(zhǔn)確反映細(xì)顆粒物對機(jī)體危害的總體效應(yīng),同時由于細(xì)顆粒物本身的特性及其吸附成分的復(fù)雜性,且每種組分的毒性機(jī)制又各不相同,因此即便是具有相同濃度的兩份樣品,其生物學(xué)效應(yīng)可能差異很大。如何模擬細(xì)顆粒物的整體暴露試驗來研究其綜合毒性作用機(jī)制是目前顆粒物毒性測試的一個難點。

發(fā)光細(xì)菌毒性檢測基于在一定實驗條件下發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度恒定,毒性物質(zhì)能抑制其正常代謝,導(dǎo)致其發(fā)光強(qiáng)度的減弱,毒性越強(qiáng),對代謝的抑制作用越強(qiáng)。生物發(fā)光抑制原理是目前國際上研究較多的生物毒性檢測技術(shù)之一,國際、國內(nèi)均有相應(yīng)的測試標(biāo)準(zhǔn)方法[9-17]。ISO11348-3費(fèi)氏弧菌凍干法是目前比較成熟的發(fā)光細(xì)菌生物毒性測試方法,主要應(yīng)用于飲用水、水體沉積物浸出液的急性毒性監(jiān)測。與小鼠染毒、體外培養(yǎng)細(xì)胞毒性實驗相比,發(fā)光細(xì)菌生物毒性檢測方法具有樣本量小,測試速度快的特點,每次測試僅需1 mL樣本,可以采集每日顆粒物,樣品直接超聲提取后即開展毒性實驗,減少了部分揮發(fā)性組分的損失。菌種復(fù)蘇15 min即可開始實驗,與樣本接觸15 min即可迅速得出實驗結(jié)果,可同時測試出顆粒物各組分之間的協(xié)同、拮抗等綜合毒性作用。為探索細(xì)顆粒物的簡易快速毒性測試方法,我們研究應(yīng)用費(fèi)氏弧菌建立了PM2.5提取物的發(fā)光細(xì)菌的毒性測試方法,并對煙花爆竹燃放和沙塵污染天的PM2.5提取液進(jìn)行了實樣測試。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

MicroTox稀釋液,MicroTox滲透壓調(diào)節(jié)液,MicroTox補(bǔ)充液,實驗用小玻璃試管,費(fèi)氏弧菌凍干粉(批號13L4152)(美國Modern Water公司)。10～100μL可調(diào)節(jié)取樣槍,100～1 000μL可調(diào)節(jié)取樣槍(吉爾森)。苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)號GSB07-1281-2000,批號102309,環(huán)保部標(biāo)樣所)。七水硫酸鋅(分析純,北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)。

Microtox Model 500毒性檢測系統(tǒng)(美國Modern Water公司),儀器配備了30孔溫控培養(yǎng)室,溫度控制在(15±0.5)℃；恒溫調(diào)節(jié)溫控菌種培養(yǎng)槽,溫度控制在(5.5±1)℃；實驗樣品測試井,溫度控制于(15±1.0)℃。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集方法

采用武漢天虹TH-16A型四通道采樣器,應(yīng)用2張石英膜和2張?zhí)馗积?46.2 mm,Whatman,PTFE)濾膜,以16.7 L·min-1的流量在車公莊地區(qū)連續(xù)進(jìn)行采樣,每12 h更換1張濾膜。樣品采集前后,將濾膜放置在溫度為25℃和相對濕度45%的恒溫恒濕條件下平衡24 h,然后用精密度為0.01mg的Mettler A型天平測量采樣前后的濾膜重量,獲得PM2.5的質(zhì)量濃度。

1.2.2 樣品提取方法

將1 d 2個取樣時段的2張?zhí)馗积垶V膜放入一次性聚乙烯超聲瓶中,加入相同體積高純水,加蓋密封,分別超聲振蕩10～60 min,溶液用0.45μm微孔濾膜過濾后,部分提取液用于發(fā)光細(xì)菌毒性測試,其余提取液用于顆粒物可溶性組分分析。同時,將空白濾膜和超純水分別放入超聲瓶進(jìn)行超聲提取以進(jìn)行對照實驗。其余通道采樣膜同步提取分析有機(jī)和無機(jī)組分。

1.2.3 發(fā)光細(xì)菌復(fù)蘇前準(zhǔn)備

將凍干細(xì)菌小瓶從-20℃的冷凍柜中取出,輕輕叩擊瓶壁使凍干菌落入瓶底,回升溫度到4℃左右。在恒溫調(diào)節(jié)溫控菌種培養(yǎng)槽的(5.5±1)℃孔中放置一個測試試管,如復(fù)蘇小支菌粉,在管中加入1 mL MicroTox稀釋液。如復(fù)蘇大支菌粉,在管中加入1 mL MicroTox補(bǔ)充液,使其恒溫保持在(5.5±1)℃。

1.2.4 樣品測試準(zhǔn)備

根據(jù)待測樣品數(shù)量準(zhǔn)備實驗試管,插入溫控培養(yǎng)室試管井中,A、C、E排試管用于待測樣品,A1加入1 mL MicroTox稀釋液作為對照,A2-A5、C1-C5、E1-E5管中加入1 mL待測樣品和0.1 mL MicroTox滲透壓調(diào)節(jié)液,混勻保持在(15±1)℃。

B、D、F排實驗前每支試管內(nèi)加入0.1 mL復(fù)蘇好的發(fā)光菌懸浮液。

1.2.5 凍干菌粉復(fù)蘇

在回升溫度到4℃左右的菌粉瓶中加入(5.5±1)℃的稀釋液或補(bǔ)充液,小包裝菌粉每支加入0.3～0.4 mL稀釋液,用旋渦混合器振蕩混勻,置于(15±1)℃試管井復(fù)蘇15 min開始實驗,大包裝菌粉每支加入1 mL MicroTox補(bǔ)充液混勻制成發(fā)光細(xì)菌濃縮液,使其恒溫保持在(5.5±1)℃復(fù)蘇5 min,實驗時取濃縮菌液,按1:10比例用MicroTox稀釋液稀釋置于(15±1)℃試管井復(fù)蘇15 min開始實驗。

1.2.6 樣品測試

Model 500毒性檢測系統(tǒng)設(shè)置了不同的操作程序,按照儀器操作程序指示在發(fā)光菌復(fù)蘇15 min后開始實驗,先測試0.1 mL發(fā)光菌初始發(fā)光值,然后往每只菌液試管加入0.9 mL已恒溫在(15±1)℃的稀釋液或調(diào)整好滲透壓的樣品溶液,混勻,計時,然后測試發(fā)光強(qiáng)度的變化(見圖1)。

圖1 PM2.5提取液對發(fā)光細(xì)菌毒性試驗流程圖Fig.1 Flow chart of luminescent bacteria acute toxicity test on PM2.5extracting solution

1.2.7 質(zhì)量控制方法

為保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠,每個樣品均進(jìn)行平行雙樣測試,結(jié)果取兩者平均值,實驗過程中:每批次測定時,應(yīng)用菌種稀釋液做空白及標(biāo)準(zhǔn)毒性參照物溶液同步測試以控制菌液質(zhì)量；同時測試空白膜提取液和萃取用水的發(fā)光抑制率作為背景參考值,以判定樣品提取液對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制是否全部來自PM2.5(見圖2)。

圖2 PM2.5提取液對發(fā)光細(xì)菌毒性試驗質(zhì)量控制措施Fig.2 Quality control measures of luminescent bacteria acute toxicity test on PM2.5extracting solution

圖3 PM2.5提取液對發(fā)光細(xì)菌毒性試驗空白均值比較及質(zhì)控樣均值Fig.3 The comparison by mean luminous inhibition rate of blank sample and the average of the quality control sample in luminescent bacteria acute toxicity test on PM2.5extracting solution

2 結(jié)果(Results)

2.1 空白參照系的質(zhì)量控制

共測試了26個批次的230個PM2.5膜提取液樣本,在測試樣本的同時測試了63個菌種稀釋液空白、90個空白膜提取液、30個萃取用水空白樣,73個毒性參照物樣本。

各項空白的發(fā)光抑制率均控制在-10%～10%之間。稀釋液空白均值為-2.70%±1.18%,萃取水空白均值為-1.93%±1.66%,膜空白均值為-1.05%± 1.36%。應(yīng)用SPSS19進(jìn)行均值T檢驗,3組空白值之間無顯著差異(P＜0.05)。說明樣品提取液對費(fèi)氏弧菌產(chǎn)生的發(fā)光抑制均來自顆粒物樣本。各空白均值比較見圖3。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)毒性參照物的質(zhì)量控制

26批次實驗所帶毒性參照物分別為10mg·L-1、16mg·L-1、20mg·L-1的七水硫酸鋅和70mg·L-1的苯酚溶液。70mg·L-1的苯酚溶液發(fā)光抑制率均值為70.9%±1.21%,10mg·L-1七水硫酸鋅發(fā)光抑制率均值為88.4%±1.03%,16mg·L-1七水硫酸鋅發(fā)光抑制率均值為92.3%±6.17%,20mg·L-1七水硫酸鋅發(fā)光抑制率均值為94.2%±0.56%,結(jié)果相對穩(wěn)定,表明樣品測試結(jié)果穩(wěn)定可靠。

實驗中為保證菌種質(zhì)量,在更換每批次的菌液時,重新繪制標(biāo)準(zhǔn)毒性參照物曲線。全部實驗過程中共繪制了8條苯酚曲線、5條硫酸鋅曲線,苯酚曲線的相關(guān)系數(shù)值分別為 0.9809、0.9968、0.9848、 0.9950、0.9839、0.9884、0.9854和0.9915,苯酚的EC50分別為31.4、27.7、27.7、23.8、24.6、22.9、22.9和29.0mg·L-1,硫酸鋅曲線的相關(guān)系數(shù)值分別為0.9721、0.9841、0.9391、0.9581和0.9762,硫酸鋅的EC50分別為1.95、2.86、3.83、4.04和3.56mg·L-1,符合方法規(guī)定要求。

圖4 春節(jié)期間PM2.5主要組分濃度與月平均值比較Fig.4 The comparison of the concentrations of the component of PM2.5between the Spring Festival and monthly average

2.3 實樣測試結(jié)果

2.3.1 煙花爆竹燃放物的生物效應(yīng)

針對煙花爆竹產(chǎn)生的污染,選取了2014年2月春節(jié)期間樣品開展的顆粒物提取液毒性實驗表明:煙花爆竹產(chǎn)生的PM2.5對費(fèi)氏弧菌的發(fā)光具有明顯的抑制作用。春節(jié)期間,除夕和元宵節(jié)為2次較為集中的煙花爆竹的燃放時段,煙花爆竹集中燃放時段的PM2.5中NO-3、SO2-4、微量金屬元素等組分增加明顯,其中微量金屬元素濃度水平是平時的11倍(見圖4),煙花爆竹燃放過程中產(chǎn)生的微量元素中主要以K、Cl-、Mg為主,Cl-是月均值的3～4倍,K、Mg分別是月均值的10～12倍(見圖5)。2月14、15、16日3 d的樣品提取液發(fā)光抑制率值均在30%以上,對費(fèi)氏弧菌的發(fā)光產(chǎn)生明顯抑制作用,特別是15日(元宵節(jié))PM2.5提取液的發(fā)光抑制率達(dá)37.3%,為當(dāng)月最高值,應(yīng)用SPSS19,將顆粒物提取液發(fā)光抑制率與PM2.5日均值濃度以及同步采樣分析的得到的PM2.5微量金屬元素、NO-3、SO2-4濃度進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析,每日樣品提取液的發(fā)光抑制率值與PM2.5日均值濃度顯著相關(guān)(相關(guān)系數(shù):0.767,P＜0.01,n= 24),發(fā)光抑制率值與微量金屬元素、總有機(jī)物(OM)、NO-3、SO2-4等有毒有害組分濃度同樣顯著相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為:0.784、0.769、0.767、0.759,P＜0.01, n=24)。可溶性提取液中微量元素K+、Cl-、Mg2+濃度與發(fā)光抑制率值的相光系數(shù)分別為0.747、0.770、0.639,P＜0.01,n=24。Charrier和Anastasio[5]研究加利福尼亞圣華金河谷PM2.5對DTT氧化效應(yīng)時發(fā)現(xiàn),大約80%的DTT氧化損失來自于樣品中金屬組分。說明細(xì)顆粒物(PM2.5)中微量金屬組分的影響不容忽視。

圖5 春節(jié)期間PM2.5主要微量元素組分濃度日變化趨勢Fig.5 The daily variation trend of composition concentration of the component trace element of PM2.5during Spring Festival

Liu等[3]研究北京城區(qū)和郊區(qū)PM2.5樣品DTT氧化損失和活性氧產(chǎn)生能力并解析了不同來源組分與活性氧產(chǎn)生能力的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)二次來源的顆粒組分、Zn、Al、Pb、Fe和沙塵源顆粒組分是引起細(xì)胞氧化損傷和產(chǎn)生炎性因子重要因素。我們的分析中,春節(jié)時段二次來源的NO-3、SO2-4(相關(guān)系數(shù):0.769、0.767),微量金屬中的Pb、Cd、Mn、Se、Cu、As、Zn等組分濃度與發(fā)光抑制率同樣相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為: 0.827、0.802、0.754、0.731、0.730、0.583,0.569,P＜0.01,n=24)。與他們結(jié)果不同,我們發(fā)現(xiàn)Al、Fe這些代表地殼元素的組分濃度與發(fā)光抑制率顯著不相關(guān)(地殼元素相關(guān)系數(shù):0.219,P＞0.05,n=24)。產(chǎn)生這一差異的原因可能是供試實驗物種以及樣品采集季節(jié)不同導(dǎo)致的組分濃度差異造成的。

2.3.2 沙塵污染的生物效應(yīng)

2014年非采暖季北京共發(fā)生13 d局地?fù)P塵或外來沙塵污染,其PM2.5濃度為50～121μg·m-3,樣品提取液均未檢出對發(fā)光細(xì)菌的明顯抑制效應(yīng),與非沙塵天相同濃度提取液相比,低濃度PM2.5對發(fā)光細(xì)菌的光抑制效應(yīng)差別不大,隨著PM2.5濃度增加,非沙塵天樣品提取液對發(fā)光細(xì)菌的光抑制效應(yīng)略高于沙塵天樣品(見表1,明顯抑制作用判定標(biāo)準(zhǔn):發(fā)光抑制率＞20%)。應(yīng)用SPSS19,將2014年1～10月發(fā)光抑制率值與提取液中地殼元素濃度進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析,結(jié)果表明:樣本提取液中地殼元素濃度和發(fā)光抑制率值顯著不相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為:0.123,P＞0.05,n=159)。中國礦業(yè)大學(xué)邵龍義等[24]應(yīng)用DNA質(zhì)粒評價法開展的顆粒物生物效應(yīng)實驗發(fā)現(xiàn):沙塵暴期間大氣顆粒物的氧化性損傷低于非沙塵暴樣品。Schwartz等[26]對美國六城市的流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)以地殼元素為主的細(xì)粒子與總死亡率沒有相關(guān)性,與我們實驗結(jié)果不同,Liu等[3]2012年觀察到北京郊區(qū)PM2.5樣品中地殼元素組分對DTT氧化損失的貢獻(xiàn)占47%。我們實驗樣品取自城市中心區(qū),城區(qū)樣品PM2.5組分與郊區(qū)樣品組分存在一定的差異。Wang等[2]研究北京不同粒徑的顆粒物特點時發(fā)現(xiàn),隨著粒徑的增大,地殼元素的濃度增加,地殼元素主要集中在粗顆粒(PM2.5-10)中。北京空氣質(zhì)量指數(shù)AQI_PM2.5歷史數(shù)據(jù)顯示:沙塵發(fā)生時段,PM10日均值濃度增加較多。Wang等[2]體外細(xì)胞毒性實驗顯示:相同顆粒物對不同的細(xì)胞系產(chǎn)生炎性因子的影響差異較大,范蘭蘭等[21]在實驗中發(fā)現(xiàn)相同劑量的顆粒物對不同細(xì)胞的生物效應(yīng)存在差異,黃雪蓮等[23]觀察到PM10對巨噬細(xì)胞分泌炎性因子的作用大于PM2.5。發(fā)光細(xì)菌毒性測試結(jié)果與Liu等[3]實驗結(jié)果的差異可能緣于顆粒物來源、實驗物種以及的取樣地點和實驗方法的差異造成的。

表1 2014年沙塵污染天PM2.5樣品發(fā)光抑制率統(tǒng)計表Table 1 The luminous inhibition rate of PM2.5samples from the dust pollution days during 2014

2.3.3 與其他細(xì)胞水平毒性實驗結(jié)果的比較

按照膜的稱重結(jié)果,計算提取液的濃度,按照樣品發(fā)光抑制率＞20%為樣品對費(fèi)氏弧菌發(fā)光具有顯著抑制效應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計得到:樣品發(fā)光抑制值＞20%的樣本提取液的濃度,介于14.2μg·mL-1～186μg·mL-1之間,并呈濃度效應(yīng)關(guān)系(r=0.3619,P＜0.05,n=225,見圖6)。由于PM2.5樣本取自一年中不同的季節(jié),受氣象因素和不同季節(jié)污染排放源的變化影響,相同質(zhì)量濃度樣本各季節(jié)的組分的差異較大,導(dǎo)致相同質(zhì)量濃度樣品在不同季節(jié)的發(fā)光抑制率差異較大,從而削弱了PM2.5提取液質(zhì)量濃度與發(fā)光抑制的效應(yīng)關(guān)系,但隨著PM2.5提取液質(zhì)量濃度增加,仍可觀察到發(fā)光抑制率增加的趨勢。鄭燦軍等[8]曾分別提取石英膜上全顆粒組分、水溶性成分、有機(jī)成分和不溶成分,得到PM2.5全顆粒物中水溶性成分、有機(jī)成分分別占65.1%,19.7%,不溶性成分為15.2%。按這個比例估算:對費(fèi)氏弧菌發(fā)光具有明顯抑制的可溶性提取液樣本的濃度大約為:9.22μg·mL-1～121μg·mL-1。龍放等[18]應(yīng)用PM2.5與肺上皮MLE-12細(xì)胞進(jìn)行實驗,實驗觀察到濃度為100和200μg·mL-1的PM2.5溶液暴露處理肺上皮MLE-12細(xì)胞24 h,細(xì)胞存活率明顯降低,分別降低28%和33%(P＜0.01)；濃度為25～200μg·mL-1的PM2.5溶液暴露處理細(xì)胞48 h,細(xì)胞存活率均明顯下降(P＜0.01),并呈濃度效應(yīng)關(guān)系(r=0.4940,P＜0.01)。我們的實驗中,對費(fèi)氏弧菌發(fā)光產(chǎn)生明顯抑制的樣品提取液濃度低于上述實驗,與其他顆粒物體外細(xì)胞毒理學(xué)[19-21]實驗相比,這些實驗中對細(xì)胞產(chǎn)生毒理效應(yīng)的濃度范圍比對費(fèi)氏弧菌發(fā)光產(chǎn)生明顯抑制效應(yīng)的濃度稍高,表明費(fèi)氏弧菌對顆粒物的影響比較敏感。

圖6 PM2.5提取液濃度與發(fā)光抑制率的相關(guān)性曲線Fig.6 The correlation between PM2.5extracting solution concentration and luminous inhibition rate

本文提出的PM2.5提取液生物效應(yīng)的測試方法和實樣測試結(jié)果表明:(1)PM2.5提取液的發(fā)光細(xì)菌毒性測試方法是一種綜合毒理效應(yīng)敏感、簡便易實施的顆粒物的生物效應(yīng)暴露試驗方法。研究提出的測試方法可行有效、質(zhì)控措施嚴(yán)謹(jǐn),具有操作簡單快速,易于應(yīng)用推廣的特點,可在1 h內(nèi)測試出顆粒物各組分之間的協(xié)同、拮抗等綜合生物毒性。(2)實樣測試表明:PM2.5提取液中微量金屬元素等有毒有害組分濃度與發(fā)光抑制率值顯著相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為: 0.784,P＜0.01,n=24),地殼元素濃度與發(fā)光抑制率值顯著不相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為:0.123,P＞0.05,n=159)；(3)與其它細(xì)顆粒物細(xì)胞毒性實驗方法相比,具有相近的實驗靈敏度。

通過有效的質(zhì)量控制手段可以獲得具有可比性的每日細(xì)顆粒物提取液的發(fā)光抑制率值,建立起每日細(xì)顆粒物濃度與發(fā)光抑制效應(yīng)結(jié)果之間的關(guān)系,并能夠進(jìn)一步分析生物效應(yīng)與顆粒物各組分日平均濃度之間的相關(guān)性,解析PM2.5來源。建議將實驗方法應(yīng)用于PM2.5日常監(jiān)測中,逐步建立起生物效應(yīng)動態(tài)評估背景數(shù)據(jù)庫,為大氣污染治理提供參考。

雖然煙花爆竹引起的重污染天持續(xù)時間不長,但其在短時間內(nèi)排放的含有大量有毒有害物質(zhì)的PM2.5不僅造成了感官上的空氣質(zhì)量污染,而且對費(fèi)氏弧菌的發(fā)光抑制作用明顯增加,危害很大,建議從多角度宣傳煙花爆竹燃放排放對人體健康的危害,提倡科學(xué)的生活、過節(jié)方式,盡量減少煙花爆竹燃放。

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Application of Luminescent Bacteria in the Acute Toxicity Test of the Water-Soluble Constituents of PM2.5

Sun Chenghua1,2,Shi Aijun1,2,*,Liu Baoxian1,2,Zhang Dawei1,2,Chen Tian4,Liu Jianwu3,Liu Kang1,2,Zhou Jiannan1,2,Hong Shanshan1,2
1.Beijing Municipal Environmental Monitoring Center,Beijing 100048,China
2.Beijing Key Laboratory of Airborne Particulate Matter Monitoring Technology,Beijing 100048,China
3.The College of Nuclear Science and Technology of Beijing Normal University,Beijing 100875,China
4.Beijing Environmental Protection Agency,Beijing 100048,China

26 May 2015 accepted 20 July 2015

The fine particulate matter(PM2.5)can be breathed into lungs and threatens human health.For scientific assessment of the comprehensive biological effects of PM2.5,a simple method with the laboratory quality control standards for testing the toxicity of the PM2.5water-soluble components was established by usingVibrio fischerias an indicator bacterium.A series of toxicity tests performed on this luminescent bacterium were carried out with thePM2.5samples from the Spring Festival fireworks and the dust pollution,respectively.Our results showed that the luminous inhibition rate had a significant correlation with the concentrations of poisonous and harmful trace metal elements discharged by the fireworks and crackers during the Spring Festival,whereas the luminous inhibition rate was not associated with the concentrations of the earth’s crust elements in the PM2.5extracting solution.

luminescent bacteria;bio-toxicity test;luminous inhibition rate;fine particulate matter

2015-05-26 錄用日期:2015-07-20

1673-5897(2016)1-353-09

X171.5

A

10.7524/AJE.1673-5897.20150526001

孫成華,石愛軍,劉保獻(xiàn),等.基于發(fā)光細(xì)菌的細(xì)顆粒物(PM2.5)可溶性提取液綜合生物效應(yīng)測試方法及其應(yīng)用[J].生態(tài)毒理學(xué)報,2016,11(1):353-361

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北京市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測中心自籌經(jīng)費(fèi)課題(2014-017)

孫成華(1969-),女,學(xué)士,高級工程師,研究方向為環(huán)境生物監(jiān)測,E-mail:sunchenghua@bjmemc.com.cn

),E-mail:cems@bjmemc.com.cn

簡介:石愛軍(1972-)，男，碩士，教授級高工，研究方向為環(huán)境監(jiān)測。