高效液相色譜蒸發(fā)光散射法測(cè)定食品中糖醇含量的研究

唐治玉,傅博強(qiáng),盛靈慧,王 晶

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)與生物計(jì)量研究所,北京 100029)

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唐治玉,傅博強(qiáng),盛靈慧,王 晶

(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)與生物計(jì)量研究所,北京 100029)

針對(duì)口香糖、餅干、面包、飲料等食品中添加的代糖成分赤蘚糖醇、木糖醇、山梨糖醇和麥芽糖醇的檢測(cè),建立了水和乙腈為流動(dòng)相,等度洗脫,氨基色譜柱分離,蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)食品中添加的糖醇含量的高效液相色譜方法。赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇的線性工作范圍分別為0.14～0.49、0.10～0.35、0.10～0.35和0.10～0.35 mg/mL,線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998、0.999、0.999和0.999,對(duì)不同類型的食品,四種糖醇的回收率在91.9%～105.2%之間,方法準(zhǔn)確度高。室內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)一般都低于5%,室間再現(xiàn)性變異系數(shù)一般都低于10%,說明方法的重復(fù)性和再線性良好。該方法簡(jiǎn)單、便于操作,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,適于復(fù)雜食品基質(zhì)中糖醇含量的測(cè)定。

食品,糖醇,高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法,含量測(cè)定

糖醇是醛糖或酮糖的羧基被還原成羥基的多元羥基化合物,糖醇雖然不是糖,但是具有某些糖的屬性,采用糖醇代替蔗糖的食品的形狀和口感與使用蔗糖類似,但總熱量和甜度減少,因此糖醇取代天然甜味劑蔗糖已成為當(dāng)今國(guó)際食品市場(chǎng)的消費(fèi)熱點(diǎn)和開發(fā)重點(diǎn)[1]。目前人工合成的用于食品工業(yè)的糖醇包括山梨醇、甘露糖醇、赤蘚糖醇、乳糖醇、木糖醇、麥芽糖醇等。

目前常用的糖醇檢測(cè)方法有氣相色譜法[2],氣相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法[3],陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法[4,5],離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6],選擇性衍生-毛細(xì)管電泳檢測(cè)法[7],高效液相色譜法[8-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]等。其中基于氣相色譜、氣相色譜質(zhì)譜和毛細(xì)管電泳檢測(cè)的方法,前處理需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化,步驟繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng)?；陔x子色譜和質(zhì)譜的方法雖然靈敏度高于液相色譜法,但對(duì)普通檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的儀器配備提出更高要求。

目前我國(guó)測(cè)定食品中糖醇的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 22222-2008《食品中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的測(cè)定高效液相色譜法》[13],采用等度洗脫,示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。該方法的靈敏度相對(duì)較低,基線穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)。隨著越來(lái)越多基體非常復(fù)雜的食品添加多種糖醇,該標(biāo)準(zhǔn)方法出現(xiàn)了一定的不適用性,需要采用梯度洗脫排除基質(zhì)成分的干擾,并進(jìn)一步提高靈敏度。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可以使用梯度洗脫,靈敏度比示差折光檢測(cè)器高一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此,結(jié)合國(guó)家衛(wèi)計(jì)委下達(dá)的針對(duì)GB/T 22222-2008的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)整合項(xiàng)目,本研究建立了多類食品中4種糖醇的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)分析方法,并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)和室間的方法驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三氯乙酸 純度≥99.0% Sigma公司;無(wú)水碳酸鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇 純度≥99% 美國(guó)SUPELCO公司;乙腈 色譜純,Fisher 公司;口香糖、乳酸菌飲料、燕麥餅干、野生藍(lán)莓汁、夾心餅干和發(fā)酵面包樣品 市售產(chǎn)品,購(gòu)自北京市某超市。

Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)(配有四元高壓輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、ChemStation色譜工作站和35900E 數(shù)模轉(zhuǎn)換器)美國(guó)Agilent公司;Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、AlltechPrevailTMCarbohydrate ES氨基色譜柱 美國(guó)Grace公司;空氣壓縮機(jī) 北京中惠普分析技術(shù)研究所;BS323S電子天平 感量1 mg,德國(guó)Sartorious公司;XP504電子天平 感量0.1 mg,瑞士METTLER TOLEDO公司;(10～100) μL可調(diào)移液器和(100～1000)μL可調(diào)移液器 德國(guó)Ephendof公司;EYELA OSB-2100水浴鍋 上海愛明儀器有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Sigma公司;Milli-Q超純水制備系統(tǒng) 美國(guó)MILLIPORE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制 碳酸鈉溶液(21.2 g/L):稱取2.12 g碳酸鈉,加水溶解并定容至100 mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。三氯乙酸溶液(100 g/L):稱取10 g三氯乙酸,加水溶解并定容至100 mL。

1.2.2 糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取木糖醇25 mg、山梨醇25 mg、麥芽糖醇25 mg,赤蘚糖醇35 mg,精確至0.1 mg,加水定容至10 mL,每毫升溶液含相當(dāng)于3.5 mg赤蘚糖醇、2.5 mg木糖醇、2.5 mg山梨醇、2.5 mg麥芽糖醇,作為儲(chǔ)備液,放置4 ℃密封可貯藏1個(gè)月。

用移液器分別準(zhǔn)確移取各種糖醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液40、60、80、100、120、140 μL于液相色譜樣品瓶中混合,用移液器補(bǔ)加水至1 mL,赤蘚糖醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.14、0.21、0.28、0.35、0.42、0.49 mg/mL的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mg/mL的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱:AlltechPrevailTMCarbohydrate ES氨基色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),保護(hù)柱(4.6 mm×20 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:乙腈∶水=80∶20。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,漂移管溫度83.5 ℃,霧化氣流速2.2 mL/min。

1.2.4 試樣制備

1.2.4.1 口香糖 取口香糖樣品至少20 g,用刀片切成小碎塊,置于密閉的容器內(nèi)混勻。準(zhǔn)確稱取2 g左右切碎的樣品,置于50 mL旋蓋離心管中,加入40 mL水,混勻后置于80 ℃水浴鍋中加熱20 min,每隔5 min振蕩混勻,取出后9000 r/min離心10 min。取8 mL上清液置于10 mL容量瓶中,加水定容、搖勻,0.22 μm濾膜過濾后,稀釋后上機(jī)測(cè)試。

1.2.4.2 飲料 對(duì)非蛋白飲料類,取樣品200 mL,充分混勻,置于密閉的容器內(nèi)。稱取10 g飲料于50 mL容量瓶中,加水定容至50 mL,搖勻,0.22 μm濾膜過濾后,稀釋后上機(jī)測(cè)試。對(duì)蛋白飲料類,取樣品至少200 mL,置于密閉的容器內(nèi)混勻。稱取樣品5 g,置于50 mL容量瓶中,加入35 mL水,搖勻后超聲30 min,每隔5 min振蕩混勻,取出后9000 r/min離心10 min。

沉淀蛋白質(zhì):上清液中加入三氯乙酸溶液5 mL,搖勻后室溫放置30 min,9500 r/min離心10 min。取8 mL上清液于10 mL容量瓶中并加水定容,搖勻后取濾液850 μL,加入21.2 g/L碳酸鈉溶液150 μL中和,搖勻。0.22 μm濾膜過濾,稀釋后上機(jī)測(cè)試。

1.2.4.3 餅干、糕點(diǎn) 取樣品至少200 g,用粉碎機(jī)粉碎,置于密閉的容器內(nèi)混勻。稱取粉碎的樣品1～5 g,置于50 mL旋蓋離心管中,加入40 mL水,搖勻后超聲30 min,每隔5 min振蕩混勻,取出后9000 r/min離心10 min。

沉淀蛋白質(zhì):上清液中加入三氯乙酸溶液5 mL,搖勻后室溫放置30 min,9500 r/min離心10 min。取8 mL上清液于10 mL容量瓶中并加水定容,搖勻后取濾液850 μL,加入碳酸鈉溶液150 μL中和,搖勻;或取10 mL上清液加入20 mL的乙腈,搖勻后室溫放置30 min,9500 r/min離心10 min,上清定容至50 mL,搖勻。0.22 μm濾膜過濾后,稀釋后上機(jī)測(cè)試。

1.2.5 方法準(zhǔn)確度 稱取適量食品樣品,添加等量的4種糖醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按1.2.4的方法進(jìn)行提取。方法準(zhǔn)確度的計(jì)算:由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出加標(biāo)后的食品中糖醇含量,扣除由1.2.4測(cè)定得到的對(duì)應(yīng)食品中糖醇含量的平均值,得到糖醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加量的計(jì)算值,將其與糖醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的添加量(稱量值)相比,計(jì)算得到加標(biāo)回收率,用回收率表示方法的準(zhǔn)確度。

1.2.6 方法的精密度

1.2.6.1 室內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 以口香糖、野生藍(lán)莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干、全麥吐司面包和乳酸菌飲料六個(gè)樣品為驗(yàn)證樣品,按1.2.4中的方法進(jìn)行處理,每個(gè)樣品做6個(gè)平行,計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù),作為室內(nèi)重復(fù)性的精密度。

1.2.6.2 室間再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 以口香糖、野生藍(lán)莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干和乳酸菌飲料為驗(yàn)證樣品,選取4家食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室均按照1.2.4的方法進(jìn)行樣品處理和樣品測(cè)試,每個(gè)樣品做三個(gè)平行,取平均值為各實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的樣品含量,計(jì)算4家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)作為室間再現(xiàn)性的精密度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent ChemStation for LC 3D systems(Rev. B. 04.02)數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)色譜峰進(jìn)行面積積分。標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。每種檢測(cè)樣品均做三個(gè)平行,取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

將10 μL標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀中,測(cè)定系列糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的響應(yīng)值(峰面積),以濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),糖醇峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),分別繪制4種糖醇的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜見圖1～圖4。

圖1 赤蘚糖醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Curve of erythritol standard

圖2 木糖醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Curve of xylitol standard

圖3 山梨醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Curve of sorbitol standard

圖4 麥芽糖醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Curve of maltitol standard

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,赤蘚糖醇在0.35～1.35 mg/L,木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇在0.25～0.95 mg/L范圍時(shí),標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998、0.999、0.999和0.999,濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.2 液相色譜分析結(jié)果

將10 μL試樣溶液注入高效液相色譜儀中,測(cè)定試樣的響應(yīng)值(峰面積)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇、赤蘚糖醇的濃度?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)和典型樣品的液相分析色譜圖見圖5～圖7。

圖5 赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇混合標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograph of erythlitol,xylitol,sorbitol and maltitol mixture standard

圖6 口香糖樣品的液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograph of chewing gum

圖7 糖醇全麥面包樣品的液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatograph of whole wheat bread with xylitol

2.3 檢出限和定量限

依據(jù)The Fitness for Purpose of Analytical Methods—A Laboratory Guide to Method Validation andRelated Topics,對(duì)方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)進(jìn)行計(jì)算,赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇和麥芽糖醇的檢出限分別為0.04、0.01、0.02和0.03,定量限分別為0.12、0.03、0.05和0.07 g/100 g。

2.4 準(zhǔn)確度

采用添加糖醇標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定回收率的方法計(jì)算方法的準(zhǔn)確度,分別測(cè)定口香糖、野生藍(lán)莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干、全麥吐司面包和活性乳酸菌飲料樣品中糖醇測(cè)定的加標(biāo)回收率,結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)表明,赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的回收率在91.9%～105.2%之間,說明該方法準(zhǔn)確度好。

表2 食品樣品中四種糖醇含量測(cè)定的回收率(n=3)

表1 四種糖醇的檢出限和定量限結(jié)果

表3 食品樣品中四種糖醇含量測(cè)定的室內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(g/100 g)

表4 食品樣品中糖醇含量測(cè)定的室間再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(g/100 g)

表5 方法的重復(fù)性限和再現(xiàn)性限

2.5 方法的精密度實(shí)驗(yàn)

2.5.1 室內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 以口香糖、野生藍(lán)莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干、全麥吐司面包和乳酸菌飲料六個(gè)樣品為驗(yàn)證樣品,由本實(shí)驗(yàn)室完成了驗(yàn)證,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

2.5.2 室間再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 以口香糖、野生藍(lán)莓汁、高纖燕麥餅干、夾心餅干和乳酸菌飲料為驗(yàn)證樣品,4家有資質(zhì)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室完成了方法的實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

由表5可見,所有樣品的重復(fù)性和再現(xiàn)性變異系數(shù)都低于10%,重復(fù)性和再現(xiàn)性良好。在不同實(shí)驗(yàn)室,由不同操作者使用不同的設(shè)備,按相同的分析方法,對(duì)同一樣品獨(dú)立進(jìn)行測(cè)試獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過表5中列出的再現(xiàn)性限R的10%。

3 結(jié)論

本研究建立的高效液相色譜方法可以將赤蘚糖醇、木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇與復(fù)雜食品中的干擾成分如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖等糖類和其他雜質(zhì)在色譜柱上實(shí)現(xiàn)有效分離。方法簡(jiǎn)單、易于掌握,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確,可以滿足食品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制和質(zhì)檢部門進(jìn)行市場(chǎng)監(jiān)管的需求。形成的檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)將為食品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽中4種糖醇含量的測(cè)定提供檢測(cè)依據(jù)。

[1]王成福,趙光輝,孫魯,等. 功能糖醇的生產(chǎn)與應(yīng)用[J]. 中國(guó)食品添加劑,2012,s1:182-186.

[2]張雅珩,周圍,李斌. 衍生化毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)測(cè)定無(wú)糖食品中的多種糖醇類甜味劑[J]. 分析化學(xué),2013,41(6):911-916.

[3]周洪斌,熊治渝,余楊,等. 醋酸酐衍生-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定葡萄酒中的糖醇[J]. 色譜,2013,31(8):786-790.

[4]周帥,薛俊杰,劉艷芳,等. 高效陰離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法分析食用菌中海藻糖、甘露醇和阿糖醇[J]. 食用菌學(xué)報(bào),2011,18(1):49-52.

[5]唐坤甜,林立,梁立娜,等. 無(wú)糖和低糖食品中的糖和糖醇同時(shí)分析的陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法研究[J]. 食品科學(xué),2008,29(6):327-331.

[6]周洪斌,熊治渝,李平,等. 離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)食品中的糖醇[J]. 色譜,2013,31(11):109-1101.

[7]張培,應(yīng)津津,田艷萍.糖醇的選擇性衍生-毛細(xì)管電泳檢測(cè)法[J]. 廣州化工,2014,42(18):156-158.

[8]李黎,劉玉峰,唐華澄,等.高效液相色譜法測(cè)定食品中的糖醇[J]. 食品科學(xué),2007,28(06):278-280.

[9]黃蕊,吳光斌,陳發(fā)河.高效液相色譜法測(cè)定水果中常見的4種糖和糖醇[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,19(3):179-184.

[10]林慧,顏春榮,徐春祥,等. HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定食品中的10種糖和糖醇[J]. 食品科學(xué),2013,34(12):286-291.

[11]丁洪流,李燦,金萍,等. 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)定食品中的單糖、雙糖、低聚果糖和糖醇[J]. 色譜,2013,31(8):804-808.

[12]馬書民,王明泰,韓大川,等. 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中甘露糖醇、麥芽糖、木糖醇、山梨糖醇[J]. 中國(guó)食品添加劑,2011(5):206-210.

[13]中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院. GB/T 22222-2008食品中木糖醇、山梨醇、麥芽糖醇的測(cè)定高效液相色譜法[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

Study on the determination of sugar alcohols in foods by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection

TANG Zhi-yu,FU Bo-qiang+,SHENG Ling-hui,WANG Jing*

(Division of Medical and Biological Measurements,National Institute of Metrology,Beijing 100029,China)

A high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection(HPLC-ELSD)method had been developed for the determination of erythritol,xylitol,sorbitol and maltitolinchewing gum,biscuits,bread and beverage. The sugar alcohols in foods were separated on amino column by isocratic elution with acetonitrile-water solution(80∶20,V∶V). The linear range of standard working curve for erythritol,xylitol,sorbitol and maltitol were 0.14～0.49 mg/mL,0.10～0.35 mg/mL,0.10～0.35 mg/mL and 0.10～0.35 mg/mL,with linear correlation coefficient(R2)of 0.998,0.999,0.999 and 0.999,respectively.For different kinds of food,the recovery of four kinds of sugar alcohols were in the range of 91.9%～105.2%. The coefficient of variations of intra-laboratory repeatability and inter-laboratory reproducibility were less than 5% and 10%,respectively. This method was simple,easy to grasp and accurate in the determination of sugar alcohols in complex food matrix.

foods;sugar alcohols;high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection;determination

2016-03-11 +并列第一作者

唐治玉(1979-),女,碩士,工程師,研究方向:生物計(jì)量,E-mail:tangzhy@nim.ac.cn。

傅博強(qiáng)(1975-),男,博士,副研究員,研究方向:生物計(jì)量,E-mail:fubq@nim.ac.cn。

國(guó)家衛(wèi)計(jì)委食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)整合項(xiàng)目(ZHENGHE-2014-308)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000

*通訊作者:王晶(1968-),女,博士,研究員,研究方向:生物計(jì)量,E-mail:wj@nim.ac.cn。