RNA干擾下調(diào)CD98hc表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、轉(zhuǎn)移的影響

苗銳　趙耀　楊榮軍　高興春　郭娜

1.陜西省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西西安710005；2.西安醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,陜西西安710021

RNA干擾下調(diào)CD98hc表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、轉(zhuǎn)移的影響

苗銳1趙耀1楊榮軍1高興春2郭娜2

1.陜西省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,陜西西安710005；2.西安醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,陜西西安710021

目的觀察下調(diào)CD98hc對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞體外增殖、遷移及侵襲的影響。方法應(yīng)用siRNA技術(shù)干涉U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞CD98hc的表達(dá),篩選并獲得CD98hc低表達(dá)的U251細(xì)胞株（U251KD)及陰性對(duì)照細(xì)胞（U251NC)。流式細(xì)胞技術(shù)及Western blot鑒定CD98hc的表達(dá)下調(diào)情況。應(yīng)用CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室分別檢測(cè)兩組細(xì)胞的遷移及侵襲能力；Western blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9的表達(dá)。結(jié)果與陰性對(duì)照U251NC組相比,U251KD細(xì)胞中CD98hc水平明顯下調(diào)（P＜0.01),U251KD細(xì)胞的增殖和遷移、侵襲能力均顯著受抑（P＜0.05),MMP-2、MMP-9的表達(dá)也明顯降低（P＜0.01)。結(jié)論下調(diào)CD98hc的表達(dá)能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的體外增殖、遷移及侵襲,其機(jī)制可能與MMP-2、MMP-9的下調(diào)相關(guān)。CD98hc分子可作為膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

CD98分子;膠質(zhì)瘤;細(xì)胞增殖;細(xì)胞侵襲

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是好發(fā)于成人的一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,50%以上的膠質(zhì)瘤具有分化程度低、侵襲性強(qiáng)、惡性程度高等特點(diǎn),臨床預(yù)后較差[1]。臨床膠質(zhì)瘤的治療多采用手術(shù)并輔以放/化療的綜合治療方式[2],但患者的生存期仍然較短,效果并不理想[3-4],這主要與膠質(zhì)瘤復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明,神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多階段的過(guò)程,因此,闡明其發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)膠質(zhì)瘤的治療具有重要的指導(dǎo)意義。

CD98分子是由CD98重鏈（CD98hc、4F2hc)與LAT-1、LAT-2等6種輕鏈中的一條組成的異源二聚體,在細(xì)胞氨基酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮著重要的作用[5]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),CD98hc在多種腫瘤細(xì)胞表面呈高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[6]。在人腦膠質(zhì)瘤中CD98hc的表達(dá)明顯高于正常腦組織,并且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)呈顯著正相關(guān)[7]。但是CD98hc在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制目前尚未見報(bào)道。本文主要通過(guò)干涉CD98hc的表達(dá),觀察其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251的增殖和運(yùn)動(dòng)能力的影響,并初步探討其機(jī)制,旨在為膠質(zhì)瘤的基因治療提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

U251細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM（美國(guó)Hyclone)；小牛血清（四季青)；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒及CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所)；Transwell小室（Corning公司)；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司)；鼠抗CD98單克隆抗體、鼠抗MMP-2抗體、兔抗MMP-9抗體（Abcam)；抗人βactin小鼠單克隆抗（Santa Cruz)；羊抗鼠FITC（中杉公司)；二抗（Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)U251細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、2% L-谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,適時(shí)更換培養(yǎng)基和傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞2× 105接種于6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng),待融合度達(dá)80%左右,按質(zhì)粒（μg):脂質(zhì)體（μL)=1:2的比例轉(zhuǎn)染CD98hcsiRNA、空白對(duì)照（control siRNA),具體操作按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,分別獲得CD98下調(diào)的U251KD細(xì)胞株和陰性對(duì)照U251NC細(xì)胞株。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot和流式細(xì)胞技術(shù)鑒定,鑒定成功后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Western blot檢測(cè)收集待檢測(cè)細(xì)胞,RIPA裂解提取蛋白,BCA蛋白定量后進(jìn)行10%SDSPAGE凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后,應(yīng)用5%脫脂牛奶封閉1 h,一抗4℃孵育過(guò)夜,PBST洗膜3次后加入二抗,室溫孵育1 h后,洗膜3次,化學(xué)發(fā)光,采集圖像。

1.2.4流式細(xì)胞染色收集轉(zhuǎn)染后的U251細(xì)胞,制成細(xì)胞混懸液,濃度為1×106/mL,4%多聚甲醛固定20 min后,1%BSA室溫封閉20 min,加入鼠抗CD98單抗室溫孵育1 h,PBS洗3次后加入羊抗鼠FITC室溫1 h, PBS漂洗后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖收集轉(zhuǎn)染后的U251細(xì)胞,每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,于固定時(shí)間點(diǎn)（6、12、24、48、72、96 h)向每孔中分別加入10 μL CCK-8溶液孵育,1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。

1.2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞,在12孔板中每孔加入4×105個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后用中槍頭比著直尺呈45°劃痕。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次,去除劃下的細(xì)胞,加入無(wú)血清培養(yǎng)基,分別在培養(yǎng)的0、12、24 h拍照。計(jì)算2次拍照間的距離差,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均值。

1.2.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)無(wú)血清培養(yǎng)基按1:4稀釋Matrigel膠,加入小室上室,每個(gè)小室100 μL,37℃孵育4 h。加入細(xì)胞前先水化基底膜。消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),濃度為1×105/mL,加入100 μL于小室上室。在小室的下室24孔板內(nèi)加入400 μL含10%血清的培養(yǎng)基,37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h。每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔。取出小室,棄去培養(yǎng)基,置于未用過(guò)的24孔中,95%乙醇固定后加入DAPI染色10 min,10×熒光顯微鏡下觀察,拍照。計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Student's t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1U251細(xì)胞表面CD98hc的下調(diào)表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,U251KD細(xì)胞CD98的表達(dá)明顯下調(diào),蛋白抑制率達(dá)56.9%,顯著低于陰性對(duì)照U251NC細(xì)胞（P＜0.001),見圖1A；同時(shí),流式結(jié)果顯示,U251KD細(xì)胞表面CD98表達(dá)量亦明顯低于U251NC細(xì)胞（P＜0.001),見圖1B。

2.2下調(diào)表達(dá)CD98分子抑制U251細(xì)胞增殖

應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)CD98分子對(duì)U251細(xì)胞的增殖影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),U251KD細(xì)胞增殖活性與U251NC細(xì)胞相比,24 h后兩組細(xì)胞OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05),見圖2。提示CD98分子可顯著抑制U251細(xì)胞的體外增殖。

2.3下調(diào)表達(dá)CD98分子抑制U251細(xì)胞遷移

體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)CD98的表達(dá)后,U251細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)能力明顯受抑。U251KD細(xì)胞與U251NC細(xì)胞相比,在12 h即表現(xiàn)出顯著的遷移抑制（P＜0.05),24 h作用更加明顯（P＜0.001)。見圖3。

2.4下調(diào)表達(dá)CD98分子抑制U251細(xì)胞侵襲

分別將U251KD細(xì)胞與U251NC細(xì)胞接種于Transwell小室上室培養(yǎng)24 h,DAPI染色后于顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)兩組均有細(xì)胞穿過(guò)小室濾膜。U251KD細(xì)胞與U251NC細(xì)胞相比,穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。提示下調(diào)U251細(xì)胞的CD98表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞的侵襲能力存在一定的抑制作用。見圖4。

2.5下調(diào)CD98分子抑制U251細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)

圖1　Western blot及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞CD98干涉情況

圖2　CCK-8檢測(cè)CD98分子對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制作用

圖3　干涉CD98顯著抑制U251細(xì)胞的遷移能力

圖4　下調(diào)CD98顯著抑制U251細(xì)胞侵襲能力

進(jìn)一步收集轉(zhuǎn)染后的U251NC和U251KD細(xì)胞,檢測(cè)其MMP-2和MMP-9表達(dá),結(jié)果顯示,下調(diào)CD98后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)均明顯下調(diào),與陰性對(duì)照U251NC細(xì)胞相比,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)。見圖5。

圖5　干涉CD98后對(duì)U251細(xì)胞系MMP-2、MMP-9的影響

3　討論

CD98分子最早被認(rèn)為是一種淋巴細(xì)胞表面抗原,與T細(xì)胞和B細(xì)胞的激活相關(guān)[8]。后來(lái)研究發(fā)現(xiàn),CD98廣泛表達(dá)于除血小板以外的所有細(xì)胞,并且在處于增殖狀態(tài)的正常組織中呈高表達(dá)。對(duì)增殖活躍的腫瘤細(xì)胞而言,CD98分子已被證實(shí)高表達(dá)于肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中,這種高表達(dá)與患者的病情及預(yù)后密切相關(guān)[9-11]。在膠質(zhì)瘤中,也有類似的研究,這些研究提示CD98hc高表達(dá)于腦膠質(zhì)瘤中,而瘤旁組織則無(wú)明顯表達(dá),并且其高表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)和惡性增殖顯著相關(guān)[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn),抑制CD98hc的表達(dá)可以明顯抑制U251細(xì)胞的增殖,這和在其他腫瘤上的研究結(jié)果基本一致[14-16],提示CD98hc在人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用,可作為腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

侵襲性生長(zhǎng)是腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一個(gè)非常顯著的特點(diǎn),這也成為膠質(zhì)瘤治療中需要克服的一個(gè)瓶頸。本研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)CD98分子可以顯著降低U251細(xì)胞的遷移及侵襲能力,進(jìn)一步分析其具體機(jī)制發(fā)現(xiàn),CD98的下調(diào)可引起基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP)-2和MMP-9的表達(dá)降低,提示CD98分子在膠質(zhì)瘤的侵襲擴(kuò)散中起到了非常重要的作用。有研究表明,隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加,MMP-2的表達(dá)及活性也明顯增加,并與膠質(zhì)瘤的侵襲直接相關(guān)[17]。然而CD98分子如何參與MMPs的表達(dá)調(diào)控目前還不清楚,筆者推測(cè)可能與CD147分子有一定的聯(lián)系。CD147分子又稱為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑,可以在腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)MMPs的分泌,從而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。有文獻(xiàn)報(bào)道,CD147和CD98hc可能作為一個(gè)分子復(fù)合體而存在于胞膜表面相互作用,組成CD147-CD98hc復(fù)合體進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的糖和氨基酸代謝,從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用[19-20]。CD98分子可能通過(guò)調(diào)控CD147分子的功能進(jìn)而影響MMPs的分泌,參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲擴(kuò)散,至于其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,下調(diào)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞CD98分子的表達(dá)可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,其抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的機(jī)制可能與MMP-2和MMP-9的表達(dá)減少有關(guān)。本文從細(xì)胞水平證實(shí)了CD98分子在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,為以CD98為靶點(diǎn)的膠質(zhì)瘤基因治療提供了初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of RNA interference down-regulation of CD98hc on proliferation, migration of U251 cells

MIAO Rui1ZHAO Yao1YANG Rongjun1GAO Xingchun2GUO Na2
1.Department of Neurology,the Second People's Hospital of Shaanxi Province,Xi'an710005,China;2.Department of Immunology,Xi'an Medical University,Shaanxi Province,Xi'an710021,China

Objective To observe the effect of down-regulation of CD98hc on proliferation,migration and invasion of U251 cells.Methods siRNA technology was used to interference CD98hc in U251 cells.CD98hc low expression U251 cells(U251KD)and the negative control cells(U251NC)were obtained.FCM and Western blot were used to verify the down-regulation of CD98hc.CCK-8 assay was used to test the cell proliferation of both U251KD and U251NC cells. Wound scratch assay and Transwell assay were conducted to determine the migration and invasion potency of U251KD and U251NC cells.Western blot was used to detect the expression of MMP-2 and MMP-9.Results Compared to that of U251NC cells,CD98hc was down-regulated significantly in U251KD cells(P＜0.01).The cell proliferation,migration and invasion potency were significantly inhibited in U251KD cells(P＜0.05);suppressing CD98hc expression also down-regulated the expression of MMP-2 and MMP-9(P＜0.01).Conclusion Knocking down of CD98hc inhibits the proliferation,migration and invasion of U251 cells in vitro,and the mechanism may be associated with the down-regulation of MMP-2 and MMP-9.CD98hc can act as a potential target in glioma therapy.

CD98;Glioma;Cell proliferation;Cell invasion

R730.23

A

1673-7210(2016)06(b)-0016-05

西安醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2015DOC 08)；西安醫(yī)學(xué)院分子免疫學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)。

苗銳（1980-),男,碩士研究生；研究方向:腦血管疾病的防治。

郭娜（1982-),女,博士研究生,副教授；研究方向:腫瘤生物學(xué)。

（2016-03-11本文編輯:程銘)