Alpha-突觸核蛋白寡聚體致帕金森病小鼠模型的行為學(xué)變化

王 鵬 歷 春 王海鵬 蓋曉東

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

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Alpha-突觸核蛋白寡聚體致帕金森病小鼠模型的行為學(xué)變化

王 鵬 歷 春1王海鵬 蓋曉東1

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

目的 觀察家族型帕金森病(PD)alpha-突觸核蛋白(α-Syn)突變體A53T和A30P寡聚體導(dǎo)致小鼠PD模型的行為學(xué)變化，探討α-Syn寡聚體在體內(nèi)的神經(jīng)毒性作用。方法 制備野生型α-Syn、家族型突變體A53T和A30P的聚集體，對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行紋狀體注射。培養(yǎng)至第30、60天，進(jìn)行爬桿實(shí)驗(yàn)、懸吊實(shí)驗(yàn)、滾軸實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)估行為學(xué)改變。免疫組織化學(xué)方法檢測黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元改變。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)鼠紋狀體α-Syn寡聚體注射后30 d出現(xiàn)PD樣運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)，紋狀體注射30 d和60 d后，各組小鼠的爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與對(duì)照組無差異(P>0.05)。注射30 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)、滾軸實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組無差異(P>0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木時(shí)間比對(duì)照組長(P<0.05)，滾軸上時(shí)間比對(duì)照組小鼠縮短(P<0.05)，懸掛評(píng)分比對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，與野生型α-Syn寡聚體組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。注射60 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實(shí)驗(yàn)平均通過時(shí)間比對(duì)照組小鼠長(P<0.05)、懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分較對(duì)照組小鼠降低(P<0.05)；A53T和A30P組小鼠各項(xiàng)行為學(xué)評(píng)估與對(duì)照組小鼠差異顯著(P<0.01)、與野生型α-Syn寡聚體組相比有差異(P<0.05)。A53T和A30P組小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目下降(P<0.05)。結(jié)論 紋狀體注射α-Syn突變體A53T和A30P寡聚體,模型小鼠出現(xiàn)PD樣行為學(xué)改變和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少。

帕金森?。籥lpha-突觸核蛋白；寡聚體

帕金森病(PD)是以神經(jīng)元內(nèi)路易體(LB)為主要病理特征的神經(jīng)變性病〔1〕。而alpha-突觸核蛋白(α-Syn)作為LB的主要成分，被認(rèn)為是引起PD發(fā)病的關(guān)鍵性蛋白〔2〕。研究證實(shí)，存在于LB中的α-Syn大部分發(fā)生錯(cuò)誤折疊而聚集〔3〕。外源性α-Syn的寡聚體進(jìn)入神經(jīng)元后，可引起進(jìn)一步聚集，形成不可溶的淀粉樣變性包涵體〔4〕。一些家族性PD患者α-Syn基因突變引起α-Syn錯(cuò)譯發(fā)生結(jié)構(gòu)變化而易于聚集，其中以第88位堿基發(fā)生G-C突變，導(dǎo)致氨基酸序列第30位丙氨酸變成脯氨酸(A30P)，第209位核苷酸發(fā)生G-A突變，使氨基酸序列中第53位丙氨酸變成蘇氨酸(A53T)最常見〔5，6〕。我們已證實(shí)α-Syn突變型A53T和A30P的寡聚體可以進(jìn)入神經(jīng)元，并較野生型α-Syn寡聚體對(duì)神經(jīng)元的毒性更大、在神經(jīng)元內(nèi)形成LB樣嗜酸性包涵體。如能利用其神經(jīng)毒性制作動(dòng)物模型，對(duì)PD的發(fā)病機(jī)制研究意義重大。本研究利用α-Syn寡聚體神經(jīng)元感染的特點(diǎn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行紋狀體注射，觀察其行為學(xué)變化，探討在短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建PD動(dòng)物模型的可能，并進(jìn)一步研究α-Syn 家族型突變體A53T和A30P寡聚體在體內(nèi)的神經(jīng)毒性作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 組織包埋劑(SAKURA Tissue-Tek?O.C.T.Compound)，購自美國SAKURA公司；α-Syn 單克隆抗體(ab138501)，購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物有限公司；TH抗體，購自美國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，重18～22 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2013-0001。動(dòng)物訂購后，在26 cm×18 cm×18 cm籠箱內(nèi)、每籠5只適應(yīng)性培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行體重測量和紋狀體注射的預(yù)實(shí)驗(yàn)操作。之后進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作和按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行正常飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作流程經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物試驗(yàn)操作者持有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人員崗位證書，證書編號(hào)39749。共4組，假手術(shù)組、野生型α-Syn寡聚體組、A53T寡聚體組、A30P寡聚體組。每組8只。均采用左側(cè)紋狀體側(cè)注射。實(shí)驗(yàn)組每只注射5 μg寡聚體〔7〕，體積為2 μl，假手術(shù)組注射2 μl PBS。

1.3 方法

1.3.1 紋狀體注射 小鼠稱重，10%水合氯醛0.004 ml/g體重進(jìn)行腹腔注射麻醉。將小鼠頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，距離前囟冠狀位中線向前0.8 mm、前囟外側(cè)緣2.0 mm、距離硬腦膜深約3.0 mm、開骨窗，注射樣品，用牙托粉封閉顱骨孔。然后縫合筋膜和皮膚，并于腹腔注射氨芐青霉素8萬U，術(shù)后小鼠包被保暖，清醒后置于籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。

1.3.2 動(dòng)物行為學(xué)觀察 通過爬桿實(shí)驗(yàn)、懸吊實(shí)驗(yàn)、滾軸實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn)反映肌力、平衡和協(xié)調(diào)能力。分別在實(shí)驗(yàn)前先訓(xùn)練大鼠3 d，然后開始正式實(shí)驗(yàn)。在紋狀體注射前、注射第30、60天由經(jīng)過正式培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員通過雙盲原則完成行為學(xué)測試。

1.3.2.1 爬桿實(shí)驗(yàn) 參照Ogawa等〔8〕的測試方法，自制直徑0.8 cm、高60 cm 的直木桿，桿頂部有一小木球，外面覆蓋紗布以防止小鼠打滑。小鼠被頭向上放于桿頂端，記錄動(dòng)物從開始運(yùn)動(dòng)到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時(shí)間和它們下到桿底的時(shí)間。

1.3.2.2 懸掛實(shí)驗(yàn) 參照Kuribara等〔9〕的測試方法，自制懸掛桿，水平放置，距地面30 cm。實(shí)驗(yàn)中小鼠懸掛于金屬桿上，如小鼠用兩后爪計(jì)3分，如用一后爪抓住電線計(jì)2分，如小鼠兩后爪均抓不住電線計(jì)1 分，最后計(jì)算得分情況，測5次取平均值。

1.3.2.3 滾軸實(shí)驗(yàn) 采用小鼠電動(dòng)轉(zhuǎn)軸儀(Rotamex-5，Columbus Instruments)，滾軸直徑6 cm，轉(zhuǎn)速20 r/min，連續(xù)測20次取平均值〔10〕。

1.3.2.4 平衡木實(shí)驗(yàn) 105 cm × 4 cm × 3 cm長木桿，木桿離地80 cm，兩端由木架支撐。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠放在起始區(qū)面對(duì)鼠籠方向，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄小鼠走過起始區(qū)的時(shí)間(潛伏期)和小鼠走過整個(gè)平衡桿的時(shí)間〔11〕。先訓(xùn)練3次，然后開始正式實(shí)驗(yàn)。走3次取平均值。

1.3.3 免疫組織化學(xué)方法 將實(shí)驗(yàn)小鼠灌注取腦，制備腦組織冰凍切片。將組織切片放入含0.3% Triton X-100的PBS中，4℃浸泡2～4 d；將組織切片在含有0.5% H2O2的PBS中處理30 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。在含1% 山羊血清中封閉30 ～ 60 min。加入TH抗體(1∶1 000)，4℃過夜。PBST沖洗后，加入生物素化的山羊抗小鼠IgG，1∶1 000，室溫孵育2 h。將切片用Tris-HCl緩沖液漂洗后，放入含有DAB和H2O2的顯色劑中顯色。顯色完成后，將切片移入Tris-HCl緩沖液中終止顯色。貼片上，低溫烤干或自然干燥，然后在不同濃度的乙醇中逐次脫水，每次5 min，然后移入二甲苯中透明，每次3 min。準(zhǔn)備好蓋玻片，封片劑封片。晾干后，觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析，并用Sigma-plot繪圖軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠給予α-Syn寡聚體后的一般表現(xiàn) 紋狀體注射30 d后小鼠開始出現(xiàn)輕微震顫、運(yùn)動(dòng)減少，個(gè)別出現(xiàn)后肢張開、豎毛等改變；注射A53T和A30P組小鼠運(yùn)動(dòng)能力下降明顯，震顫增多，肢體僵硬，個(gè)別小鼠有步態(tài)不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩的PD樣運(yùn)動(dòng)障礙表現(xiàn)。

圖1 C57BL/6小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察結(jié)果

2.2 行為學(xué)檢測 見圖1～圖4。紋狀體注射30 d和60 d后，各組小鼠的爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與對(duì)照組無差異(P>0.05)。注射30 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)、滾軸實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組無差異(P>0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木時(shí)間比對(duì)照組長(P<0.05)，滾軸時(shí)間比對(duì)照組小鼠縮短(P<0.05)，懸掛評(píng)分比對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，與野生型α-Syn寡聚體組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。注射60 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實(shí)驗(yàn)平均通過時(shí)間比對(duì)照組小鼠長(P<0.05)、懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分較對(duì)照組小鼠降低(P<0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木實(shí)驗(yàn)平均通過時(shí)間、懸掛實(shí)驗(yàn)評(píng)分和滾軸平衡時(shí)間均與對(duì)照組小鼠有顯著差異(P<0.01)、與野生型α-Syn寡聚體組相比有差異(P<0.05)。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與α-Syn寡聚體組比較：3)P<0.05；下圖同圖2 C57BL/6小鼠平衡木實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察結(jié)果(n=8)

圖3 C57BL/6小鼠懸掛實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察結(jié)果(n=8)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與A53T組比較：3)P<0.05圖4 C57BL/6小鼠滾筒實(shí)驗(yàn)行為學(xué)觀察結(jié)果(n=8)

2.3 黑質(zhì)多皮胺能神經(jīng)元免疫組織化學(xué)檢測 紋狀體注射第30天各組黑質(zhì)組織染色正常，未發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元減少。第60天，野生型α-Syn寡聚體組小鼠腦黑質(zhì)多皮胺能神經(jīng)元較對(duì)照組減少約26.53%(P<0.05)；A53T和A30P組與對(duì)照組相比，黑質(zhì)多皮胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少約56.34 %和53.21%(P<0.01)，存留神經(jīng)元形態(tài)皺縮，突起減少，多巴胺能神經(jīng)纖維密度減低，見圖5。

標(biāo)尺：20 μm圖5 寡聚體組小鼠腦紋狀體注射同側(cè)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元較對(duì)照組減少

3 討 論

在神經(jīng)系統(tǒng)，細(xì)胞外源性可溶α-Syn寡聚體進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)后可引起進(jìn)一步聚集，形成不可溶的淀粉樣變性包涵體〔12〕。這些變性蛋白形成的包涵體可以經(jīng)細(xì)胞間的轉(zhuǎn)運(yùn)感染正常細(xì)胞，使病變蔓延〔13〕。向PD患者腦黑質(zhì)內(nèi)移植胎兒中腦干細(xì)胞，結(jié)果顯示新移植的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)也出現(xiàn)LB樣病變〔14〕，進(jìn)一步證實(shí)了LB病變的可轉(zhuǎn)移性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在紋狀體注射的α-Syn寡聚體可以在神經(jīng)元間傳遞的方式進(jìn)入黑質(zhì)，并導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少。

本文行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型小鼠垂直運(yùn)動(dòng)能力未改變而出現(xiàn)懸掛能力減弱、滾筒保持平衡的時(shí)間縮短以及通過平衡桿時(shí)間延長等表現(xiàn)。在體內(nèi)證實(shí)家族型α-Syn突變體A53T、A30P聚集體對(duì)神經(jīng)元的毒性并具備制作PD模型的可能。良好的動(dòng)物模型是探討PD發(fā)病機(jī)制和治療方案的基礎(chǔ)。已知PD主要發(fā)病機(jī)制是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失、紋狀體多巴胺含量降低，而使膽堿能系統(tǒng)的功能相對(duì)亢進(jìn)，造成紋狀體DA和乙酰膽堿遞質(zhì)失衡。PD模型主要通過損毀的辦法破壞黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)，繼而產(chǎn)生PD樣遞質(zhì)生化改變；藥物干擾Ach和DA的平衡，直接模擬PD的遞質(zhì)變化；或通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從發(fā)病機(jī)制、生化改變以接近人PD改變。但模型均未有PD特征性的病理變化LB形成。我們利用α-Syn寡聚體和家族型α-Syn突變體A53T和A30P進(jìn)行紋狀體注射，發(fā)現(xiàn)模型小鼠出現(xiàn)PD樣行為學(xué)改變和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少，提供了PD模型制備的新方法。

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〔2015-12-19修回〕

(編輯 徐 杰)

吉林省科技廳項(xiàng)目(20150101128JC)

蓋曉東(1962-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤分子病理學(xué)研究。

王 鵬(1977-)，男，博士，講師，主要從事人體解剖學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究。

R74

A

1005-9202(2016)21-5227-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.005

1 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室