他克莫司口服復(fù)合物膠束的制備及其體外釋藥特性觀察

焦艷，李凌冰，牟燕，徐巍

(1山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250012；2山東省千佛山醫(yī)院)

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他克莫司口服復(fù)合物膠束的制備及其體外釋藥特性觀察

焦艷1，李凌冰1，牟燕2，徐巍2

(1山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250012；2山東省千佛山醫(yī)院)

目的 制備載他克莫司的口服復(fù)合物膠束，觀察其理化性質(zhì)及體外釋藥特征。方法 采用薄膜超聲法以普朗尼克F127-殼聚糖聚合物(F127-CS)和脫氧膽酸鈉(DCA)為材料制備他克莫司口服大分子復(fù)合物膠束，采用單因素考察和均勻設(shè)計(jì)篩選最優(yōu)制備工藝；透視電鏡下觀察膠束外觀形態(tài)，激光散射粒度儀測(cè)定粒徑、Zeta電位，HPLC法測(cè)定載藥量，熒光探針法測(cè)定臨界膠束濃度，用動(dòng)態(tài)膜透析法測(cè)定其在人工胃液和腸液中的體外釋放情況。結(jié)果 電鏡照片顯示，他克莫司口服膠束圓整均勻、不粘連，粒徑為(55.77±2.23)nm，Zeta電位為(-6.38±0.47)mV，載藥量為8.93%±0.20%，臨界膠束濃度為2.65×10-3mol/L。體外釋放結(jié)果顯示，他克莫司F127-CS/DCA膠束在人工腸液中的釋放速率高于人工胃液。結(jié)論 F127-CS/DCA口服膠束具有較高的載藥量和pH依賴釋放特性，適合作為他克莫司口服給藥系統(tǒng)。

他克莫司；復(fù)合物膠束；普朗尼克F127-殼聚糖；制備工藝；體外實(shí)驗(yàn)

他克莫司(FK506)作為第2代免疫抑制劑廣泛用于抗移植排斥[1]，因其具有不溶于水的性質(zhì)，嚴(yán)重限制了其胃腸道吸收，口服吸收個(gè)體差異很大?？诜﨔K506膠囊劑，肝移植患者平均生物利用度(F)約22%、腎移植患者約20%、健康志愿者僅15%。FK506在血液中與紅細(xì)胞、血漿蛋白和淋巴細(xì)胞的結(jié)合率分別為85%、14%、0.5%[2]。因此，克服其水溶性低、增加口服吸收是一個(gè)重要課題。膠束是近年來給藥系統(tǒng)領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)，特別是聚電解質(zhì)復(fù)合物膠束。它是由帶電的親水共聚物與帶相反電荷的疏水化合物通過正負(fù)電結(jié)合形成的納米制劑。其中疏水鏈構(gòu)成內(nèi)核，疏水性藥物可包裹到膠束內(nèi)核中，增加其在水中的溶解度[3]。脫氧膽酸鈉(DCA)是膽酸鹽的一種,對(duì)疏水性藥物能起到增溶效果[4]。普朗尼克F127(F127)是兩親性嵌段共聚物，因其特有的生物相溶性，已獲FDA批準(zhǔn)作為藥用輔料[5]。殼聚糖(CS)是幾丁質(zhì)的脫乙酰產(chǎn)物。作為自然界存在的惟一一種堿性多糖，其具有安全性、可微生物降解性、生物相容性等特點(diǎn)，加之其來源廣泛及CS衍生物制備簡(jiǎn)單，使其作為藥物緩控釋材料得到廣泛研究[6]。2015年3～12月，我們制備帶正電荷的F127-CS聚合物[7]，與DCA通過正負(fù)電結(jié)合，將疏水藥物FK506包裹，制備膠束；并利用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，對(duì)其各項(xiàng)理化性質(zhì)和體外釋放特征進(jìn)行了觀察。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 RG-18磁力攪拌器(上海瑪尼儀器設(shè)備有限公司)；AV400核磁共振譜儀(Bruker公司, 瑞士)；傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)； FD1A-50 冷凍干燥機(jī)(上海豫明冷凍干燥機(jī)廠)。F127(BASF公司，美國(guó))；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC，Sigma-Aldrich公司，美國(guó))；丁二酸酐 (上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品)；二甲亞砜、三乙胺(上海統(tǒng)亞化工科技發(fā)展有限公司)；CS(Mw≤3 000 Da，浙江金殼生物技術(shù)有限公司)；其他試劑均購(gòu)自濟(jì)南化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 F127-CS聚合物的制備[7]取3.810 g純化后的F127、0.045 g丁二酸酐、0.055 g二甲基氨基吡啶(DMAP)及0.060 g三乙胺，溶于1,4-二氧六環(huán)30 mL中，25 ℃下攪拌后避光反應(yīng)24 h。圓底燒瓶收集反應(yīng)后溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，沉淀物用過量乙醚洗滌(重復(fù)3次)，25 ℃下真空干燥12 h，即得F127-COOH。將F127-COOH溶于PBS(pH 5)30 mL中，先加入0.087 g EDC，然后按照順序加入0.052 g N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、1.35 g CS，25 ℃下攪拌后避光反應(yīng)24 h。反應(yīng)所得裝入透析袋(Mw=6 000～10 000 Da)，室溫重蒸水透析24 h，凍干，即得到F127-CS聚合物。所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通過紅外光譜和1H-NMR光譜驗(yàn)證。

1.2.2 F127-CS/DCA載藥膠束的制備 采用透析法制備[8,9]。稱取15 mg DCA、8 mg FK506和15 mg F127-CS聚合物溶于適量甲醇中，裝入透析袋中。用pH 6.5的蒸餾水透析24 h， 以3 000 r/min 離心30 min后，取上清液即得F127-CS/DCA膠束溶液[3]。

1.2.3 載藥量和包封率測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法測(cè)定膠束載藥量[10]。儀器：Agilent高效液相色譜儀；色譜柱：ODS(DiamonsilTMC18,250 mm ×4.6 mm)；流動(dòng)相：乙腈∶水∶H3PO4=70∶30∶0.1(V/V/V)；流速1.0 mL/min；柱溫60 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL。峰面積(A)與濃度(C)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線為C=0.000 32A-0.025 (R2=0.998 7)。將10 mg F127-CS/DCA FK506大分子復(fù)合物膠束溶液加于小試管中，用移液槍精密加入一定體積乙腈渦旋破解，超聲完全溶解，微孔濾膜(0.22 μm)過濾；HPLC法測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算FK506的濃度，進(jìn)而計(jì)算出載藥量和包封率。載藥量=測(cè)量所得膠束內(nèi)藥物量/(載體材料量+測(cè)量所得藥物量)×100%；包封率=膠束包裹的藥物量/投藥總量×100%。

1.2.4 F127-CS/DCA膠束制備工藝的優(yōu)化 采用均勻設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝。選擇F127-CS/DCA質(zhì)量比(X1)、FK506投藥量(X2)、透析樣品體積(X3)、透析液溫度(X4)以及透析時(shí)間(X5)進(jìn)行優(yōu)化篩選。每個(gè)因素選取4個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)3次。按均勻設(shè)計(jì)U9(34)表安排實(shí)驗(yàn)，見表1。最優(yōu)處方的驗(yàn)證：以載藥量、粒徑、Zeta電位為指標(biāo)，制備3批F127-CS/DCA載藥膠束，分別對(duì)其進(jìn)行考察。

表1 基于均勻設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)安排表

1.2.5 膠束外觀形態(tài)觀察 將膠束滴于電鏡銅網(wǎng)上，1.5%的磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡觀察形態(tài)。

1.2.6 膠束的粒徑分布及Zeta電位測(cè)定 采用激光粒度分布儀測(cè)定粒徑大小及Zeta電位。

1.2.7 臨界膠束濃度(CMC)測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)采用熒光探針法測(cè)定CMC[11,12]。將適量芘丙酮溶液轉(zhuǎn)移到一系列刻度管中，氮?dú)鈸]干。將系列不同濃度的空白膠束溶液加入到含芘丙酮的刻度管中，使芘丙酮的最終濃度為2.0×10-6mol/L，搖勻，室溫下平衡過夜。在激發(fā)光波長(zhǎng)334 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)350～500 nm下測(cè)定熒光光譜，繪制發(fā)射圖譜第1峰與第3峰的比例隨聚合物濃度的變化曲線，從曲線拐點(diǎn)求CMC。

1.2.8 體外釋放行為觀察 采用膜透析法[13,14]。所用釋放介質(zhì)是含1%吐溫-80的人工胃液和人工腸液，依據(jù)中國(guó)藥典2015版第二部配制釋放介質(zhì)。分別吸取1.5 mL(含藥500 μg)FK506注射劑，DCA膠束溶液及F127-CS/DCA膠束溶液置于夾緊一端的截留分子量為3 500 Da的透析袋中，小心排出氣泡；夾緊另一端，放入50 mL含1%吐溫-80的人工胃液(pH 1.2)及人工腸液(pH 6.8)中，100 r/min 37 ℃恒溫水浴振蕩。分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h取樣2 mL，并補(bǔ)加等量溫度相同的介質(zhì)。采用HPLC法測(cè)定，依據(jù)公式[13,14]計(jì)算累計(jì)釋放百分率，繪制釋放曲線。

2 結(jié)果

2.1 F127-CS驗(yàn)證結(jié)果 紅外光譜示，F(xiàn)127-CS聚合物出現(xiàn)了一個(gè)羰基伸縮振動(dòng)峰，而F127和CS沒有此峰,表明CS以酰氨鍵與F127連接[15]。F127-CS聚合物的1H-NMR光譜圖中有F127、CS的特征峰，說明F127與CS成功聯(lián)接。

2.2 F127-CS/DCA膠束制備工藝最優(yōu)處方驗(yàn)證結(jié)果 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),選擇載藥量為指標(biāo)，對(duì)各因素各水平進(jìn)行二項(xiàng)式回歸，確定F127-CS/DCA FK506大分子復(fù)合物膠束制備的最優(yōu)處方為X1=1∶1、X2=8 mg、X3=25 ℃、X4=8 mL、X5=15 h。為驗(yàn)證最優(yōu)處方的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，制備3批載藥膠束，測(cè)定其載藥量、粒徑及Zeta電位，其預(yù)期結(jié)果分別為8.65%、56.40 nm、-6.54 mV，實(shí)際測(cè)量結(jié)果為8.93%±0.20%、(55.77±2.23)nm、(-6.38±0.47)mV。

2.3 膠束的外觀形態(tài)、粒徑、CMC 透射電鏡照片可見，F(xiàn)127-CS/DCA膠束圓整均勻，成形良好，少有粘連，粒徑為(55.77±2.23)nm?？瞻譌127-CS/DCA膠束和空白DCA膠束的CMC分別在2.65×10-3mol/L和1.8×10-2mol/L?？瞻譌127-CS/DCA膠束CMC顯著降低，說明引入合成的F127-CS后，膠束的穩(wěn)定性得到較好提升，具備更優(yōu)良的抗體液稀釋能力。

表2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 體外釋放行為 在兩種釋放介質(zhì)中，F(xiàn)K506注射液以近乎勻速緩慢釋放，12 h累計(jì)釋放量均不足40%；而F127-CS/DCA膠束和DCA膠束表現(xiàn)出先快后慢的釋放特性。其中，在人工胃液中，F(xiàn)127-CS/DCA膠束的釋放比在人工腸液中釋放的慢，12 h累計(jì)釋放量分別為58.74%±2.52%和81.73%±3.25%。見圖1。

圖1 F127-CS/DCA膠束(■)、DCA膠束(◆)及FK506注射液(▲)在人工胃液(A)及人工腸液(B)中體外釋藥曲線

3 討論

FK506是第二代免疫抑制劑中應(yīng)用較為廣泛的抗移植排斥藥物。FK506具有不溶于水的性質(zhì)，嚴(yán)重限制了其胃腸道吸收，且口服吸收有很大的個(gè)體差異。因此，提高溶解度是提高FK506口服制劑生物利用度的關(guān)鍵所在。

DCA是膽酸鹽的一種，對(duì)疏水性物質(zhì)起到增溶作用。但是，單純的DCA膠束由于其剛性結(jié)構(gòu)限制其聚集在一起，因此載藥量很低，不能滿足臨床要求。同時(shí)這也導(dǎo)致DCA膠束在體液中不穩(wěn)定，容易被稀釋后分解。因此，本實(shí)驗(yàn)首先合成帶正電荷的F127-CS聚合物，再通過正負(fù)電荷的吸引作用與DCA結(jié)合，使DCA聚集成膠束。以FK506為模型藥物，制備載藥的膠束。

同時(shí)對(duì)膠束的理化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，F(xiàn)127-CS/DCA膠束載藥量約為8.93%；F127-CS/DCA膠束和DCA膠束的CMC分別為2.65×10-3mol/L和1.8×10-2mol/L，F(xiàn)127-CS/DCA膠束體系的穩(wěn)定性比DCA增大。

體外釋放試驗(yàn)在DCA載藥膠束、F127-CS/DCA載藥膠束及FK506注射液組3種不同制劑之間對(duì)照進(jìn)行，分別考察它們?cè)谌斯の敢汉腿斯つc液2種模擬人工介質(zhì)中的釋放情況。結(jié)果表明，相比FK506注射液，2種載藥膠束制劑釋放速度均先快后慢，顯示出一定的緩釋效果;而F127-CS/DCA載藥膠束在2種模擬介質(zhì)中的釋放速度略有不同，這是由于聚電解質(zhì)復(fù)合物膠束的形成及解聚受環(huán)境pH影響較大所致。原因可能是由于在弱堿性條件下，F(xiàn)127-CS/DCA膠束體系中的殼聚糖去質(zhì)子化，顯中性;導(dǎo)致與帶負(fù)電的DCA結(jié)合力減弱，膠束解體，F(xiàn)K506釋放,表現(xiàn)出一定程度的pH依賴釋放特性。而DCA膠束的釋放與此相反。

總之，F(xiàn)127-CS/DCA復(fù)合物膠束能夠有效荷載疏水性藥物，使藥物在體液中免受消化酶、吞噬系統(tǒng)、pH等的影響，能有效運(yùn)送藥物到達(dá)吸收部位，釋放藥物，促進(jìn)藥物吸收，是一種比較好的口服給藥系統(tǒng)。

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Preparation of Tacrolimus-loaded polyion complex micelles and their release characteristics in vitro

JIAOYan1,LILingbing,MUYan,XUWei

(1SchoolofPharmacy,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

Objective To prepare the Tacrolimus-loaded polyion complex micelles and observe their release characteristics in vitro.Methods Tacrolimus-loaded polyion complex micelles were prepared by film-ultrasonic method with Pluronic F127-chitosan (F127-CS) polymer and sodium deoxycholate (DCA). Preparation technique and optimal formulation were selected via single factor investigation and uniform design. Morphology of polyion micelles was observed by transmission electron microscope. Diameter distribution and zeta potential of polyion micelles were measured by using laser size scattering determinator. Drug loading capacity (DL%) was determined with the high performance liquid chromatography (HPLC). Pyrene as a fluorescence probe was used to detect critical micelle concentration (CMC). In vitro release was evaluated with dynamic membrane dialysis.Results The electron microscope showed spherical micelles were round and uniform. The average diameter was (55.77±2.23) nm, zeta potential was (-6.38±0.47) mV, drug loading capacity (DL%) was 8.93%±0.20%, and the Critical Micelle Concentration (CMC) was 2.65×10-3mol/L.In vitro release study suggested that Tacrolimus-loaded F127-CS/DCA micelles showed a pH-dependent release, the release rate in artificial intestinal juice was higher than that in artificial gastric juice. Conclusion F127-CS/DCA polyion micelles have high drug-loading capacity and pH-dependent release characteristics, and are suitable for oral administration of Tacrolimus.

Tacrolimus; polyion complex micelles; Pluronic F127-chitosan; preparation technique; in vitro experiment

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81503261)；山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(ZR2013HQ011)；山東省濟(jì)南市科技明星計(jì)劃項(xiàng)目(201406016)。

焦艷(1990-)，女，碩士，主要研究方向?yàn)榧{米給藥系統(tǒng)。E-mail： 137038232@qq.com

簡(jiǎn)介： 徐巍(1982-)，男，副主任藥師，主要研究方向?yàn)樗幬镄聞┬?。E-mail： 13964016747@126.com

牟燕(1971-)，女，副主任藥師，主要研究方向?yàn)樗幬镄聞┬?。E-mail： yjkmy@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.42.008

R944.9

A

1002-266X(2016)42-0028-04

2015-06-30)