大數(shù)據(jù)時(shí)代工業(yè)酶的發(fā)掘、改造和利用

郁惠蕾?gòu)堉锯x李春秀錢(qián)小龍郭 飛許建和

（1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2 華東理工大學(xué)常熟研究院，蘇州百福安酶制劑有限公司，江蘇 215000）

大數(shù)據(jù)時(shí)代工業(yè)酶的發(fā)掘、改造和利用

許建和，本科畢業(yè)于清華大學(xué)化學(xué)系，華東理工大學(xué)與京都大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士。1995年起歷任華東理工大學(xué)助研、副研、教授。任教育部長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授, 生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，兼上海生物制造協(xié)同創(chuàng)新中心主任。亞洲生物技術(shù)聯(lián)合會(huì)執(zhí)委，第一屆亞洲生物技術(shù)大會(huì)共同主席。長(zhǎng)期從事生物催化與生物化工研究，曾主持1項(xiàng)“973計(jì)劃”課題、2項(xiàng)“863計(jì)劃”課題和7項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金。公開(kāi)發(fā)明專(zhuān)利60多項(xiàng)，授權(quán)40項(xiàng)，多項(xiàng)技術(shù)轉(zhuǎn)讓企業(yè)。

E-mail:jianhexu@ecust.edu.cn

郁惠蕾1張志鈞1李春秀1錢(qián)小龍2郭 飛2許建和1

（1 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2 華東理工大學(xué)常熟研究院，蘇州百福安酶制劑有限公司，江蘇 215000）

從當(dāng)今的生物信息大數(shù)據(jù)出發(fā)，提出有別于傳統(tǒng)方法的工業(yè)酶挖掘新思路。在此基礎(chǔ)上結(jié)合最新研究成果，簡(jiǎn)要介紹幾種典型工業(yè)酶的設(shè)計(jì)和改造新策略。

隨著資源、環(huán)境問(wèn)題的日益加劇，可持續(xù)發(fā)展已成為全社會(huì)的共同目標(biāo)。當(dāng)今社會(huì)對(duì)“可持續(xù)發(fā)展”、“綠色化學(xué)”以及“環(huán)境友好制造”的呼聲越來(lái)越高。以節(jié)能、降耗、減排和高效生產(chǎn)為目標(biāo)，基于工業(yè)酶催化劑的綠色制造過(guò)程也越來(lái)越多地受到學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注。微生物基因組學(xué)、分子與結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物信息學(xué)及計(jì)算生物學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，為酶的分子設(shè)計(jì)、高效制備以及生產(chǎn)應(yīng)用提供了科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，使得更多工業(yè)規(guī)模的生物催化合成成為可能。

大數(shù)據(jù)開(kāi)啟了一次重大的時(shí)代轉(zhuǎn)型，正在改變我們的生活和了解世界的方式，同時(shí)也成為新發(fā)明和新服務(wù)的源泉。在生物技術(shù)領(lǐng)域，由于測(cè)序技術(shù)成本的大幅下跌，人們獲得基因序列的速度是10年前無(wú)法想象的。如何才能在最短的時(shí)間內(nèi)，從海量的基因數(shù)據(jù)資源中迅速鑒別并獲得工業(yè)上有用的目標(biāo)酶基因和活性酶蛋白？基因挖掘（genomic mining）就是根據(jù)催化特定反應(yīng)的需要，從文獻(xiàn)中尋找相關(guān)酶的同源基因序列，并以此作為基因探針，在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，篩選獲得同源酶的編碼信息，繼而進(jìn)行酶的批量異源表達(dá)和高通量篩選，最終獲得催化性能更優(yōu)的新型生物催化劑（1.0版）。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的迅猛發(fā)展，人們對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)逐步加深，加上基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)所提供的大量結(jié)構(gòu)與功能信息，酶的分子改造也從以往的隨機(jī)突變，逐漸發(fā)展到半理性或理性設(shè)計(jì)等更精準(zhǔn)的方法，甚至可以利用計(jì)算機(jī)從頭設(shè)計(jì)自然界不存在的酶?？傊?，生物催化劑的設(shè)計(jì)和制備已經(jīng)變得越來(lái)越簡(jiǎn)單，從而使得各行各業(yè)對(duì)特定酶的要求也變得更加迫切和可行。

1　酶資源信息庫(kù)

目前已有眾多的數(shù)據(jù)庫(kù)公布了酶的基因序列、蛋白質(zhì)序列、蛋白質(zhì)性質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等信息，首先簡(jiǎn)單介紹一下這些可用于工業(yè)酶挖掘和改造的“大數(shù)據(jù)”。

1.1酶基因序列庫(kù)

根據(jù)基因組測(cè)序計(jì)劃統(tǒng)計(jì)網(wǎng)站GOLD（http://www.genomesonline.org/）截止到2016年1月9日的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，已有7826種生物的全基因組完成測(cè)序，有33 630個(gè)全基因組測(cè)序項(xiàng)目在進(jìn)行中；另有626個(gè)宏基因組測(cè)序項(xiàng)目正在進(jìn)行或已完成。截止到2015年12月，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站登記的基因序列有1.89億條，堿基數(shù)量累計(jì)達(dá)到了2039億對(duì)（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank/statistics）。而全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)（whole genome shotgun, WGS）記錄的來(lái)自個(gè)體和宏基因組的序列已有3.17億條，堿基數(shù)量累計(jì)1.2978萬(wàn)億對(duì)。在如此龐大的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)疑包含著海量的工業(yè)酶基因資源。

1.2酶蛋白質(zhì)信息庫(kù)

根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www. uniprot.org）的統(tǒng)計(jì)，截至2016年1月，已有明確功能標(biāo)注的蛋白質(zhì)序列數(shù)目達(dá)到55萬(wàn)條，未標(biāo)注的蛋白質(zhì)序列超過(guò)了5527萬(wàn)條（表1），由此可知其中標(biāo)注功能的蛋白質(zhì)僅占約1%，而絕大多數(shù)（約99%）蛋白質(zhì)的功能尚屬未知，有待研究解析。在已有明確功能標(biāo)注的蛋白質(zhì)序列中，屬于六大酶類(lèi)的序列約有26.5萬(wàn)條，其中 氧化還原酶3.9萬(wàn)條，轉(zhuǎn)移酶9.1萬(wàn)條，水解酶6.5萬(wàn)條，裂合酶2.4萬(wàn)條，異構(gòu)酶1.4萬(wàn)條，連接酶3.1萬(wàn)條。在未標(biāo)注功能的蛋白質(zhì)中，被預(yù)測(cè)為六大酶類(lèi)的共約715.1萬(wàn)條，其中氧化還原酶172.3萬(wàn)條，轉(zhuǎn)移酶218.0萬(wàn)條，水解酶159.0萬(wàn)條，裂合酶61.6萬(wàn)條，異構(gòu)酶43.4萬(wàn)條，連接酶60.8萬(wàn)條。其中每一類(lèi)還有各種亞類(lèi)的統(tǒng)計(jì)，例如圖1是預(yù)測(cè)的氧化還原酶亞類(lèi)的分布情況。

表1　Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中統(tǒng)計(jì)的蛋白質(zhì)序列數(shù)

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KAZLAUSKAS R J, BORNSCHEUER U T. Finding better protein engineering strategies. Nature Chem Biol, 2009, 5(8): 526-529.

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HILVERT D, HOUK K N, STODDARD B L, et al. De novo computational design of retro-aldol enzymes. Science, 2008, 319 (5868): 1387-1391.

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GIGER L, CANER S, OBEXER R, et al. Evolution of a designed retro-aldolase leads to complete active site remodeling. Nature Chem Biol, 2013, 9(8): 494-498.

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NI Y, LI C X, ZHANG J, et al. Efficient reduction of ethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate at 620 g/L by a bacterial reductase with broad substrate spectrum. Adv Synth Catal, 2011, 353(8): 1213-1217.

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NI Y, LI C X, WANG L J, et al. Highly stereoselective reduction of prochiral ketones by a bacterial reductase coupled with cofactor regeneration. Org Biomol Chem, 2011, 9(15): 5463-5468.

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NI Y, PAN J, MA H M, et al. Bioreduction of methyl o-chlorobenzoylformate at 500 g/L without external cofactors for efficient production of enantiopure clopidogrel intermediate. Tetrahedron Lett, 2012, 53(35): 4715-4717.

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ZHANG Y J, ZHANG W X, ZHENG G W, et al. Identification of an ε-keto ester reductase for the efficient synthesis of an (R)-α-Lipoic acid precursor. Adv Synth Catal, 2015, 357: 1697-1702.

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ZHANG C S, ZHANG Z J, LI C X, et al. Efficient production of (R)-o-chloromandelic acid by deracemization of o-chloromandelonitrile with a new nitrilase mined from Labrenzia aggregate. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 95(1): 91-99.

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HOHNE M, SCHATZLE S, JOCHENS H, et al. Rational assignment of key motifs for function guides in silico enzyme identification. Nat Chem Biol, 2010, 6(11): 807-813.

另外，Brenda （http://www.brendaenzymes.org）是一個(gè)用戶友好的酶數(shù)據(jù)庫(kù)（圖2）。可以用目標(biāo)酶的名字、酶學(xué)委員會(huì)（EC）編號(hào)或者序列搜索，進(jìn)入與目標(biāo)酶屬于同一EC編號(hào)的酶數(shù)據(jù)集，其中包含該酶的各種來(lái)源信息、最適pH、最適溫度、動(dòng)力學(xué)參數(shù)、催化反應(yīng)和三維結(jié)構(gòu)鏈接，甚至還有已報(bào)道的突變體等信息。

圖1　預(yù)測(cè)的氧化還原酶的亞類(lèi)分布情況

1.3酶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)

圖2　Brenda酶綜合信息系統(tǒng)主頁(yè)

根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB（http:// www.rcsb.org/pdb/home/home.do）統(tǒng)計(jì)，截止到2015年12月，已公布的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)總數(shù)已達(dá)到114 741個(gè)，其中絕大多數(shù)（102 306個(gè)，約89%）是通過(guò)X射線衍射法獲得的，其次是通過(guò)核磁共振譜（11 145個(gè)，約10%）和冷凍電鏡法（926個(gè)，約1%）獲得。按六大 酶類(lèi)分別統(tǒng)計(jì)，各類(lèi)酶的已知結(jié)構(gòu)數(shù)總計(jì)60 443個(gè)，按Uniprot名字刪除重復(fù)和其突變體結(jié)構(gòu)后總數(shù)為6525個(gè)，占已標(biāo)注酶蛋白質(zhì)總數(shù)的2.46%。六大酶類(lèi)已有結(jié)構(gòu)信息公開(kāi)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，其中以水解酶、轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶這三類(lèi)酶為主。這些結(jié)構(gòu)信息的公布，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究和理性設(shè)計(jì)改造提供了重要信息。

2　基因挖掘策略

在筆者前一綜述文章“后基因組時(shí)代工業(yè)酶資源的挖掘和應(yīng)用”（參見(jiàn)《生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)》2011年01期）中已經(jīng)介紹，基因挖掘是一種后基因組時(shí)代更加快速、高效地獲取新酶的方法，它極大地縮短了新酶的開(kāi)發(fā)周期，從常規(guī)的2～3年可縮短至2～3個(gè)月，甚至2～3周。下面具體介紹幾種酶的基因挖掘策略。

表2　PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中六大酶類(lèi)蛋白結(jié)構(gòu)公布的情況

2.1從已測(cè)序的微生物基因組中挖掘目標(biāo)酶基因

隨著基因測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的微生物基因組被測(cè)序，其中有一部分基因的開(kāi)放閱讀框所編碼的酶潛在功能已被預(yù)測(cè)，但可能未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)；另有大量開(kāi)放閱讀框所編碼的酶信息仍未被注釋或?qū)嶒?yàn)研究。一方面可以直接將已注釋的假想酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并通過(guò)活力檢測(cè)來(lái)獲得所需的候選生物催化劑；另一方面還可通過(guò)對(duì)未注釋酶的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行比對(duì)分析，并與已報(bào)道類(lèi)似酶的保守序列進(jìn)行比較，找到具有潛在功能的目標(biāo)新酶編碼序列，進(jìn)而通過(guò)克隆表達(dá)來(lái)獲得結(jié)構(gòu)/功能全新的目標(biāo)生物催化劑。后者的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較大（成功率較低），但創(chuàng)新性更強(qiáng)，比較容易獲得知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

例如，倪燕等通過(guò)對(duì)Bacillus sp.的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有13個(gè)潛在的羰基還原酶開(kāi)放閱讀框，通過(guò)對(duì)這些潛在的酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)酶（FabG）能夠?qū)⒏邼舛龋?20g/L）的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯高立體選擇性地還原為光學(xué)純（S）-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯（光學(xué)純度＞99%）。另外一個(gè)還原酶（yueD）則對(duì)4-氯-3-羰基丁酸乙酯表現(xiàn)出很高的催化活性，通過(guò)在兩相反應(yīng)體系中進(jìn)行分批補(bǔ)料反應(yīng)，濃度高達(dá)215 g/L（1.3mol/L）的底物可被完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物（R）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的得率和對(duì)映體光學(xué)純度分別為97.3%和99.6%。還有一個(gè)還原酶（YtbE）能夠耐受高濃度的鄰氯苯甲酰甲酸甲酯，并將500g/L的底物完全轉(zhuǎn)化為光學(xué)純（R）-鄰氯扁桃酸甲酯，后者是世界第二大暢銷(xiāo)藥氯吡格雷的關(guān)鍵手性中間體。

2.2基于探針酶序列的基因挖掘

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MAK W S, TRAN S, MARCHESCHI R, et al. Integrative genomic mining for enzyme function to enable engineering of a non-natural biosynthetic pathway. Nature Commun, 2015, 6: 10005.

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SAVILE C K, JANEY J M, MUNDORFF E C, et al. Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture. Science, 2010, 329(5989): 305-309.

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ALVIZO O, NGUYEN L J, SAVILE C K, et al. Directed evolution of an ultrastable carbonic anhydrase for highly efficient carbon capture from flue gas. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 46(111): 16436-16441.

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WARDEN A C, WILLIAMS M, PEAT T S, et al. Rational engineering of a mesohalophilic carbonic anhydrase to an extreme halotolerant biocatalyst. Nature Commun, 2015, 6: 10278.

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KONG X D, LI L, CHEN S, et al. Engineering of an epoxide hydrolase for efficient bioresolution of bulky pharmaco substrates. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111 (44): 15717-15722.

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當(dāng)催化某類(lèi)反應(yīng)的相關(guān)酶（或多肽）基因序列已有文獻(xiàn)報(bào)道后，就可以利用此序列作為基因探針（或稱(chēng)模板）在公共基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，找到與探針序列具有一定同源性的候選酶基因，進(jìn)而根據(jù)檢索到的基因序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增法獲得編碼這些酶的DNA，并將它們進(jìn)行克隆表達(dá)，最后通過(guò)目標(biāo)底物進(jìn)行活性篩選，即可能獲得所需要的具有特定催化功能的生物催化劑（圖3）。例如，筆者所在實(shí)驗(yàn)室從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挑選、規(guī)劃了1000多種結(jié)構(gòu)多樣、功能各異的醇脫氫酶/羰基還原酶（圖4），目前已經(jīng)成功制備了600多種凍干酶制劑，可以滿足我國(guó)醫(yī)藥化工企業(yè)對(duì)部分工業(yè)生物催化劑的定制服務(wù)需求。最近，利用上述酶庫(kù)為（R）-硫辛酸生產(chǎn)企業(yè)量身定制的ε-羰基還原酶，可高效催化還原330g/L的8-氯-6-羰基辛酸乙酯，產(chǎn)物光學(xué)純度＞99%，已申請(qǐng)國(guó)際專(zhuān)利（PCT/CN2015/073615），并成功實(shí)現(xiàn)技術(shù)轉(zhuǎn)移和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

又如，為了尋找能夠催化鄰氯扁桃腈水解制備鄰氯扁桃酸的腈水解酶，張陳勝等以扁桃腈水解酶基因的保守序列為探針在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)篩選，選取序列同源性在40%～70%的基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并根據(jù)它們對(duì)鄰氯扁桃腈的活力和對(duì)映選擇性進(jìn)行篩選，最終獲得的重組腈水解酶能夠耐受300mmol/L鄰氯扁桃腈，產(chǎn)物的得率和光學(xué)純度分別為94.5%和96.5%。

圖3　基于探針序列信息從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘新酶的技術(shù)路線

圖4　醇脫氫酶/羰基還原酶“千酶庫(kù)”的分子進(jìn)化樹(shù)

2.3基于序列和結(jié)構(gòu)信息相結(jié)合的新酶基因挖掘

從已測(cè)序微生物基因組中直接克隆酶的基因并進(jìn)行異源表達(dá)，或者基于探針酶的序列在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘目標(biāo)酶的技術(shù)業(yè)已成熟并取得了較好的應(yīng)用效果，不過(guò)其前提條件是未知酶的功能已經(jīng)被預(yù)測(cè)注釋?zhuān)蛘叽呋囟ǖ孜镛D(zhuǎn)化的酶基因序列已經(jīng)公開(kāi)報(bào)道。然而，針對(duì)某些特定的底物，僅僅基于催化類(lèi)似反應(yīng)的酶的序列信息所挖掘得到的酶，往往無(wú)法催化目標(biāo)底物的轉(zhuǎn)化，或者雖能催化反應(yīng)卻不能達(dá)到預(yù)期的效果。如果能將基因挖掘和結(jié)構(gòu)分析等相關(guān)信息結(jié)合起來(lái)，將有望顯著提高基因挖掘的效率。

由于轉(zhuǎn)氨酶在有機(jī)合成領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用，近年來(lái)這類(lèi)酶受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，然而大多數(shù)已報(bào)道的轉(zhuǎn)氨酶都是S-選擇性的，而R-選擇性的轉(zhuǎn)氨酶則非常少。德國(guó)Born scheuer等為了獲得R-選擇性的轉(zhuǎn)氨酶，首先對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的S-選擇性轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，找到可將S-選擇性轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)變?yōu)镽-選擇性轉(zhuǎn)氨酶所需要的突變位點(diǎn)和替代氨基酸，根據(jù)這些相關(guān)信息在基因數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索已經(jīng)含有這些氨基酸突變位點(diǎn)的基因序列，將這些潛在的目標(biāo)酶基因在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)，并基于對(duì)目標(biāo)底物的催化效果進(jìn)行篩選，最終得到17個(gè)能催化合成一系列（R）-胺的R-選擇性轉(zhuǎn)氨酶，產(chǎn)物的對(duì)映體過(guò)量值達(dá)到99%以上。

2.4計(jì)算介導(dǎo)的基因挖掘

在構(gòu)建非天然長(zhǎng)鏈醇的生物合成途徑中，Siegel等提供了一種新的生物信息學(xué)和分子模擬相結(jié)合的功能酶基因組挖掘方法。通過(guò)這種計(jì)算介導(dǎo)的基因挖掘方法獲得的酶GEO175是常規(guī)篩選所得酶活力的75倍，該計(jì)算介導(dǎo)的基因組功能酶挖掘新方法如圖5所示，包括以下幾個(gè)步驟：①通過(guò)序列比對(duì)得到2082個(gè)酮異戊酸脫羧酶（KIVD）的同源酶（genomic enzyme orthologues，GEOs），剔除彼此同源性大于90%及真核來(lái)源的GEOs，以增加候選酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)概率；②用Rosetta Comparative Modeling同源建模，用TMalign算法進(jìn)一步篩選后共獲得239個(gè)GEOs，這239個(gè)序列間同源性約20%；③將這239個(gè)GEOs與C8底物進(jìn)行分子對(duì)接，顯示GEO175酶的界面能（interface energy）最低，即最有可能催化C8底物；④根據(jù)界面能及同源性高低，挑選10個(gè)GEOs進(jìn)行動(dòng)力學(xué)表征，結(jié)果6個(gè)酶獲得了可溶蛋白，3個(gè)酶對(duì)酮酸具有可檢測(cè)的活性。

3　酶的分子改造策略

近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生物科學(xué)尤其是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的快速發(fā)展，定向進(jìn)化與理性設(shè)計(jì)相結(jié)合的半理性分子設(shè)計(jì)方法陸續(xù)出現(xiàn)（圖6），例如對(duì)鄰近有限位點(diǎn)進(jìn)行組合隨機(jī)突變的CASTing方法、QSAR、外顯子改組等。大量計(jì)算方法如ProSAR、SCHEMA、Rosseta等的應(yīng)用，大大提高了突變體設(shè)計(jì)分析的效率和準(zhǔn)確性。同時(shí)，在突變體文庫(kù)的構(gòu)建方面也出現(xiàn)了迭代飽和突變、簡(jiǎn)化密碼子表、基于簡(jiǎn)并密碼子的限制性文庫(kù)方法等。這些技術(shù)在增加酶的底物多樣性和改變酶的各種性能方面已獲得許多成功應(yīng)用。

圖5　計(jì)算介導(dǎo)基因組功能酶挖掘流程

在酶的分子改造中最具代表性的案例之一，是糖尿病藥物西他列汀合成用酶的分子改造?；诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)，通過(guò)分子模擬和點(diǎn)飽和突變對(duì)節(jié)桿菌轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，最終通過(guò)多輪特定環(huán)境下的定向進(jìn)化所獲得的突變酶有27個(gè)突變位點(diǎn)，具有較廣的底物適應(yīng)范圍、較高的活性和很強(qiáng)的環(huán)境耐受能力（反應(yīng)溫度45～50℃、50% DMSO、底物濃度200g/L），而傳統(tǒng)的定向進(jìn)化方法幾乎不可能得到具備如此多性能優(yōu)勢(shì)的酶。該酶替代了原有工藝中的貴金屬釕催化劑，解決了高壓生產(chǎn)過(guò)程的危險(xiǎn)性和高成本等問(wèn)題，使現(xiàn)有設(shè)備的生產(chǎn)能力提高56%，反應(yīng)產(chǎn)率提高10%～13%，廢物的產(chǎn)生量降低了19%。Merck和Codexis公司也因此獲得了2010年美國(guó)總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。

圖6　酶的蛋白質(zhì)工程改造策略

另一典型案例是碳酸酐酶的分子改造。為了解決氣候變暖的問(wèn)題，需要處理工業(yè)尾氣中的CO2，碳酸酐酶可顯著提高CO2的捕集效率，但其應(yīng)用仍受限于工業(yè)苛刻條件下酶的穩(wěn)定性。Alvizo等采用定向進(jìn)化技術(shù)，結(jié)合高通量篩選和ProSAR，分析識(shí)別有益突變點(diǎn)和飽和突變等策略，通過(guò)多輪突變獲得的突變體可以耐受極端高溫（107℃）和堿性條件（4.2 mol/L堿性胺溶劑、pH ＞10.0），比天然酶的穩(wěn)定性提高了4 000 000倍。在工業(yè)示范規(guī)模下，利用這一突變酶CO2的捕集效率提高了25倍。最近澳大利亞科學(xué)家通過(guò)理性設(shè)計(jì)改變碳酸酐酶Ⅱ表面的18個(gè)氨基酸殘基獲得高度耐鹽的酶變體，在高鹽條件下（＞3mol/L鈉鹽）其催化活性和解折疊溫度，比野生酶明顯增加。分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算表明，酶與鈉離子形成高度有序的鈉離子水化層，對(duì)酶在高鹽環(huán)境中的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用。這是首次通過(guò)改造普通酶而獲得極端酶的耐受性，類(lèi)似的策略對(duì)于生物催化劑的耐受性改造具有參考意義。

圖7　環(huán)氧水解酶的催化反應(yīng)及產(chǎn)物釋放通道示意

筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的巨大芽孢桿環(huán)氧水解酶BmEH，能催化苯基環(huán)氧底物制備β-阻斷劑等藥物的手性環(huán)氧中間體，但當(dāng)苯環(huán)上帶有大位阻取代基時(shí)，酶的催化活力則變得很低（＜1%），從而成為制約該酶產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的一大瓶頸問(wèn)題。為了解決上述BmEH工業(yè)化應(yīng)用的難題，筆者所在實(shí)驗(yàn)室首先解析了該酶與底物類(lèi)似物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)存在底物類(lèi)似物，其中Zone 2被確定為催化反應(yīng)位點(diǎn)，Zone 1為底物進(jìn)入通道，Zone 3為假定的釋放產(chǎn)物通道，但它在野生酶分子中被大位阻氨基酸（Met145，Phe128）所阻塞。通過(guò)將兩個(gè)關(guān)鍵的界面氨基酸突變?yōu)轶w積較小的丙氨酸，即拓展了Zone 3的產(chǎn)物通道，所得突變酶催化大位阻萘基底物的活力提高近900倍，從而證實(shí)了筆者提出的“產(chǎn)物釋放通道”假說(shuō)（圖7）。在了解環(huán)氧水解酶底物進(jìn)入、催化反應(yīng)及產(chǎn)物釋放機(jī)理的基礎(chǔ)上，筆者進(jìn)一步針對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)周?chē)陌被嵩O(shè)計(jì)了小巧的半飽和突變庫(kù)，并利用一系列臨床上有用的大位阻底物進(jìn)行活力篩選，最終達(dá)到每一種底物都能找到高活力突變體的目的（圖8）。最終，利用定點(diǎn)突變所獲得的環(huán)氧水解酶突變體，成功實(shí)現(xiàn)了一系列大位阻β-阻斷劑藥物環(huán)氧中間體的酶促水解拆分，并制備獲得了一系列洛爾類(lèi)心血管藥物的關(guān)鍵手性中間體。這一成果受到《Synfacts》期刊特邀專(zhuān)家的亮點(diǎn)評(píng)述，指出作者通過(guò)活性中心兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的微調(diào)，極大地拓展了酶的底物譜，建立了高效的環(huán)氧水解拆分反應(yīng)途徑。

圖8　環(huán)氧水解酶及其突變體的底物譜

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)由于過(guò)量使用有機(jī)磷農(nóng)藥給食品安全和環(huán)境凈化帶來(lái)很大挑戰(zhàn)。有機(jī)磷水解酶OPHC2是β-內(nèi)酰胺酶家族的一員，但是關(guān)于它在自然進(jìn)化過(guò)程中是如何獲得磷酸三酯水解活力的問(wèn)題，目前尚未有任何報(bào)道。為了探索其所催化各種反應(yīng)之間的內(nèi)在進(jìn)化關(guān)系，筆者所在實(shí)驗(yàn)室以食油假單胞菌中的有機(jī)磷水解酶PoOPH為研究對(duì)象，該酶具有很高的酯酶和內(nèi)酯酶活力，但僅有很低的磷酸三酯水解活力。通過(guò)多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，活性口袋周?chē)?50位的組氨酸和263位的異亮氨酸在所有的有機(jī)磷水解酶中高度保守，因此筆者推測(cè)這兩個(gè)氨基酸對(duì)該類(lèi)酶的催化活力和底物專(zhuān)一性具有關(guān)鍵作用?；诖?，筆者構(gòu)建了這兩個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)飽和突變庫(kù)，并分別考察了它們的酯酶、內(nèi)酯酶和磷酸三酯酶活力，結(jié)果表明：將這兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變?yōu)槠渌?lèi)型的氨基酸均會(huì)顯著降低原有的酯酶和內(nèi)酯酶活力，而本來(lái)極低的磷酸三酯酶活力則獲得顯著的提升。特別值得一提的是，雙突變體H250I/I263W催化甲基對(duì)硫磷和乙基對(duì)氧磷的水解活力比野生酶分別提高了6962倍和106倍，而其原有的酯酶和內(nèi)酯酶活力卻顯著降低，酶的底物專(zhuān)一性發(fā)生了107倍的逆轉(zhuǎn)。

4　展 望

2015年7月，美通社在線發(fā)布《2014年全球工業(yè)酶行業(yè)研究報(bào)告及未來(lái)三年預(yù)測(cè)》。近年來(lái)，全球工業(yè)酶制劑市場(chǎng)規(guī)模逐年增加，年產(chǎn)值增長(zhǎng)率為5%，2014年已達(dá)42.2億美元的規(guī)模。目前，全球工業(yè)酶市場(chǎng)基本上是寡頭壟斷。在2014年，諾維信作為工業(yè)用酶巨頭，占據(jù)了44%的市場(chǎng)份額；而杜邦公司和DSM分別占據(jù)20%和6%的市場(chǎng)份額。全球各地區(qū)需求呈現(xiàn)較大差異，歐洲和北美地區(qū)對(duì)工業(yè)酶的需求量最大，占據(jù)80%，而中國(guó)僅占9.4%。

在市場(chǎng)需求擴(kuò)大和政策利好的雙重刺激下，2014年中國(guó)的工業(yè)酶制劑產(chǎn)量已達(dá)116.57萬(wàn)噸并保持10%年產(chǎn)量增長(zhǎng)趨勢(shì)，預(yù)計(jì)2017年產(chǎn)量將達(dá)到154.87噸。通過(guò)引進(jìn)國(guó)外先進(jìn)的設(shè)備、優(yōu)良的菌株以及新型酶制劑的開(kāi)發(fā)，中國(guó)已開(kāi)始進(jìn)入酶制劑工業(yè)的快速發(fā)展期。但在酶制劑研發(fā)的原始創(chuàng)新方面尚有一定差距，多數(shù)企業(yè)的自主開(kāi)發(fā)能力還十分有限。

若能抓住當(dāng)今大數(shù)據(jù)、互聯(lián)網(wǎng)+的時(shí)代機(jī)遇，充分利用好全球共享共用的生物信息資源，掌握工業(yè)酶設(shè)計(jì)和改造的核心技術(shù)，并將之轉(zhuǎn)化為具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的工業(yè)酶實(shí)體資源，則可望從源頭上引領(lǐng)我國(guó)生物催化學(xué)科的快速崛起，推進(jìn)生物制造產(chǎn)業(yè)的高起點(diǎn)和跨越式發(fā)展。

10.3969/j.issn.1674-0319.2016.02.006