高遷移率族蛋白N2免疫組織化學(xué)定位及其活性結(jié)構(gòu)抑菌性能的體外實驗研究

劉　奕　周榮靜　費(fèi)　偉

1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院口腔科 成都 610072；2.山東省聊城市人民醫(yī)院口腔科 聊城 252000

高遷移率族蛋白N2免疫組織化學(xué)定位及其活性結(jié)構(gòu)抑菌性能的體外實驗研究

劉奕1周榮靜2費(fèi)偉1

1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院口腔科 成都 610072；2.山東省聊城市人民醫(yī)院口腔科 聊城 252000

目的 研究高遷移率族蛋白N2（HMGN2）在豬組織中的免疫組織化學(xué)定位情況，體外評價HMGN2的活性結(jié)構(gòu)α-螺旋的抑菌性能。方法 采用免疫組織化學(xué)法，觀察HMGN2蛋白在豬組織中的表達(dá)；采用高效液相色譜法從豬的胸腺和淋巴結(jié)中分離和純化HMGN2，人工合成HMGN2的活性結(jié)構(gòu)α-螺旋，采用液體稀釋法體外評價HMGN2及HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)對變異鏈球菌、表兄鏈球菌、白假絲酵母菌及大腸桿菌的抑菌性能。結(jié)果 從豬的胸腺和淋巴結(jié)中成功分離和純化得到HMGN2，所有受檢豬組織均呈HMGN2免疫陽性反應(yīng)，且HMGN2多表達(dá)在組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中；HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)抑菌活性相當(dāng)，均對所選實驗菌株均表現(xiàn)出不同的抑菌性能。結(jié)論 HMGN2可表達(dá)在豬組織的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，HMGN2及其活性結(jié)構(gòu)α-螺旋具有較強(qiáng)的抑菌性能。

高遷移率族蛋白N2； 免疫組織化學(xué)； 抑菌性能

口腔疾病是較為常見的疾病，是危害人類健康的主要疾病之一?？咕氖巧矬w內(nèi)一類可誘導(dǎo)產(chǎn)生、分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、具有廣譜抗菌活性的可溶性多肽。高遷移率族蛋白N2（high mobility group protein N2，HMGN2）是高遷移率族蛋白家族成員，是一類普遍存在于高等真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，具有雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)的新型抗菌肽。HMGN2由90個氨基酸殘基組成，是一組與核小體結(jié)合的核蛋白，表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，其抗菌活性主要集中在α-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域[1]。本研究旨在研究新型抗菌肽HMGN2在豬組織中的免疫組織化學(xué)定位情況，體外評價HMGN2及其活性結(jié)構(gòu)α-螺旋的抑菌性能，為進(jìn)一步研究HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)口腔生態(tài)環(huán)境的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1實驗主要儀器和設(shè)備

光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本），厭氧培養(yǎng)箱DY-2（浙江義烏冷凍機(jī)總廠），CrystalSpecTM比濁儀（Becton Dickinson公司，美國），針孔式濾膜過濾器（孔徑為0.2 μm，無錫賽維商貿(mào)），兔抗人HMGN2多克隆抗體（口腔疾病研究國家重點實驗室馮云教授惠贈），免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

1.2組織標(biāo)本

選取6～8月齡豬處死，迅速摘取其新鮮組織：肝、胸腺、腎、心、肺和淋巴結(jié)，10%（體積分?jǐn)?shù)）中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片5 μm，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實驗菌株及培養(yǎng)

變異鏈球菌（ATCC25175）、表兄鏈球菌（6715）、白假絲酵母菌（ATCC10691）、大腸桿菌（ATCC25922）的實驗菌株由口腔疾病研究國家重點實驗室提供。其中，變異鏈球菌和表兄鏈球菌在TPY瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，白假絲酵母菌，大腸桿菌在普通血瓊脂培養(yǎng)基（BA培養(yǎng)基中）培養(yǎng)。

1.4 實驗方法及步驟

1.4.1免疫組織化學(xué)法主要步驟 本實驗采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶連接法，將制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫溶液作用20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.01 mol·L-1pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)法抗原修復(fù)，滴加1∶100稀釋的兔抗人HMGN2多克隆抗體50 μL濕盒內(nèi)4 ℃過夜，次日室溫下復(fù)溫1 h，滴加生物素化的羊抗兔二抗50 μL室溫孵育1 h，再滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素50 μL室溫孵育1 h；新鮮配制0.04%DAB顯色1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時間；蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照。HMGN2的染色結(jié)果由2名病理科醫(yī)生采用雙盲法鏡檢，細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或黃色者為陽性細(xì)胞，未出現(xiàn)棕黃色或黃色者為陰性細(xì)胞。

1.4.2HMGN2的分離提取 按文獻(xiàn)[2]報道的方法進(jìn)行，首先取新鮮豬胸腺和淋巴結(jié)，剔除表面筋膜和血管組織，切成小塊速凍于液氮中，碾碎成細(xì)粉末狀，在5%的乙酸中電動勻漿，離心收集上清，收集的上清液移入分子截流量為3.5×103的透析袋中，4 ℃透析48 h除去乙酸，冷凍干燥后，得到酸溶性粗提物，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?.1%的乙酸溶解重懸后，4℃，12 000 r·min-1，離心10 min，收集上清液，用于反相高效液相色譜法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離。RP-HPLC分離條件：0.1%三氟乙酸/60%乙氰0～60 m線形梯度洗脫，檢測波長214 nm，流速1 mL·min-1。樣本收集：收集洗脫液每管1 mL。真空冷凍干燥后，再溶于0.1%乙酸中，進(jìn)行三羥甲基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacry-lamide gel electrophoresis, Tricine-SDS-PAGE），將電泳裝置與電源相接，100 V 電泳1 h 左右，至染料條帶進(jìn)入分離膠后電壓改為80 V，繼續(xù)電泳4 h，關(guān)閉電源。最后對提取的HMGN2 分子進(jìn)行質(zhì)譜精確分子量測定，質(zhì)譜分析由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.4.3人工合成HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)域 HMGN2的α-螺旋結(jié)構(gòu)：KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKP KKAPAKK（position 18-48 of HMGN2 amino acid sequence)，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，合成后相對分子質(zhì)量為3 433。

1.4.4實驗用液和菌懸液的制備 取制備好的HMGN2和人工合成的HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)，用滅菌雙蒸水配制蛋白溶液，針孔濾器過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?。實驗菌種接種于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇，于80%N2、10%H2、10%CO2，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24～48 h，白假絲酵母菌于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃需氧培養(yǎng)24 h。檢查菌落生長形態(tài)，鏡檢無污染，涂片檢查證實為純培養(yǎng)后，挑取單個菌落于液體培養(yǎng)基中在相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)增菌，CrystalSpecTM比濁儀測定菌懸液濃度，磷酸緩沖液配制的菌懸液濃度為1×106CFU·mL-1。

1.4.5最小抑菌濃度（minimum inhibitory concen-tration，MIC）及最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定 實驗分為3個組：分別含HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)實驗液和菌懸液的液體培養(yǎng)基（實驗組），含氯已定和菌懸液的液體培養(yǎng)基（陽性對照組），含磷酸緩沖液和菌懸液的液體培養(yǎng)基（陰性對照組），每組設(shè)置3個平行組。分別將HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)實驗用液按2倍稀釋法分別配制成濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.68、7.8、3.9 μg·mL-1溶于液體培養(yǎng)基中。細(xì)菌懸液與各組藥液按體積比例，各100 μL分別接種于無菌96孔板中，用微量振蕩器振蕩1 min后，置于適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)24 h。在黑色背景下，凡肉眼觀察微孔內(nèi)液體清亮無渾濁或沉淀生長的最低藥物濃度為MIC值。選擇大于MIC濃度的各孔，分別取20 μL劃線接種于固體培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，觀察菌落數(shù)少于5～6個的最低濃度為MBC值。所有菌種的MIC測定實驗重復(fù)3次。

2　結(jié)果

2.1HMGN2蛋白在豬的肝、胸腺、腎、心、肺和淋巴結(jié)中的免疫組織化學(xué)定位情況

圖1分別顯示了HMGN2在豬的肝、胸腺、腎、心、肺和淋巴結(jié)中的免疫組織化學(xué)定位情況。結(jié)果顯示：所有受檢組織均呈HMGN2免疫陽性反應(yīng)，且HMGN2多表達(dá)在組織細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。每一種組織的陽性反應(yīng)強(qiáng)度不同，胸腺、腎臟和淋巴結(jié)組織中可觀察到HMGN2強(qiáng)免疫反應(yīng)，肝、心、肺免疫反應(yīng)較弱。

圖1　HMGN2在豬的肝、胸腺、腎、心、肺和淋巴結(jié)中的免疫組織化學(xué)定位情況Fig 1 Immunohistochemical localization of HMGN2 protein in porcine liver, thymus, kidney, heart, lung, and lymph node

2.2HMGN2的鑒定

從豬胸腺和淋巴結(jié)中分離純化的HMGN2蛋白，經(jīng)Tricine-SDS-PAGE分析顯示其純度較高，表觀相對分子質(zhì)量約為14 000，此蛋白即為目標(biāo)蛋白HMGN 2分子。質(zhì)譜分析顯示，HMGN2的相對分子質(zhì)量為9 274，與文獻(xiàn)[2]報道一致。

2.3抑菌性能檢測結(jié)果

HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)谇蛔儺愭溓蚓?，表兄鏈球菌及大腸桿菌的MIC和MBC結(jié)果如表1所示，表明HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)域抗菌活性相當(dāng)，均對口腔主要致病菌及大腸桿菌有明顯的抑菌效果。

表1　HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)谇患膊≈饕虏【腗IC及MBC值Tab 1 MIC and MBC of HMGN2 and α-helical domain of HMGN2 against oral pathogenic bacteria μg·mL-1

3　討論

HMG蛋白是脊椎動物和非脊椎動物的細(xì)胞核中含量最為豐富的非組蛋白家族，普遍存在于高等真核生物中。HMGN2屬于HMGN亞家族，相對分子質(zhì)量約為9 200，共由90個氨基酸殘基組成，為堿性蛋白質(zhì)。HMGN2的編碼基因?qū)儆谝粋€多基因家族，通過基因雜交方法發(fā)現(xiàn)HMGM2多基因家族中功能基因僅有一個，定位于染色體1P36.1[3-4]。HMGN2是不含二硫鍵結(jié)構(gòu)的線形分子，由外顯子3和外顯子4編碼的17～47位30個氨基酸組成的核小體結(jié)合區(qū)，為強(qiáng)陽離子區(qū)，具有核小體結(jié)合功能，將HMGN2錨定在染色體上，經(jīng)分析其為α-螺旋區(qū)，具有跨膜功能[5]。

研究表明HMGN2在組織中的表達(dá)有一定的特異性：HMGN2 mRNA在人前列腺、垂體、甲狀腺、胸腺、骨髓和胎兒的脾、肝、肺、胸腺中水平較高，其余組織中水平均為中等[6-7]。Amen等[8]發(fā)現(xiàn)HMGN2還可表達(dá)在牙齒和胚胎14.5 d磨牙牙蕾的口腔上皮中，其表達(dá)受到胚胎組織的限制，在成熟組織中HMGN2表達(dá)下降。由于HMGN2有很高的保守性，早期的研究常從牛胸腺或雞紅細(xì)胞中提取，使HMG各蛋白得到很好的分離，這樣的提取方法具有來源豐富，具有天然結(jié)構(gòu)的優(yōu)點，但不足之處是這并不是人的HMGN2。后來，人們又試著從人腫瘤細(xì)胞株中提取，甚至用分子克隆的方法經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得HMGN2蛋白，但這種技術(shù)獲得的HMGN2無真核細(xì)胞蛋白編碼后的修飾。Boumba等[9]從豬胸腺中成功提取了HMGN2，并對其進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與來源于人類的同類家族蛋白相似性最高，僅僅是在64位上發(fā)生了一個保守置換，即天門東氨酸替代了谷氨酸。近年來，也有學(xué)者成功地從人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞中分離純化出了HMGN2抗菌肽。

在本研究的免疫組織化學(xué)定位實驗中，檢測發(fā)現(xiàn)HMGN2在豬的肝、胸腺、腎、心、肺和淋巴結(jié)中均呈HMGN2免疫陽性反應(yīng)，HMGN2表達(dá)在組織細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。每一種組織的陽性反應(yīng)強(qiáng)度不同，提示除了從豬胸腺組織中可獲取HMGN2，還可從豬腎臟和淋巴結(jié)中提取HMGN2，也說明HMGN2作為一個免疫活性分子可能參與了體內(nèi)的天然免疫防御作用。

由于天然抗菌肽生物效能低，具有蛋白水解的不穩(wěn)定性，這兩個特點極大的阻礙了它們的臨床應(yīng)用。根據(jù)對抗菌肽作用的共同特征的分析，對抗菌肽的分子序列、所帶電荷性、螺旋性結(jié)構(gòu)、疏水性、親水親脂性等進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造有助于提高其抗菌活性。本實驗所得到的HMGN2的多肽結(jié)構(gòu)域α-螺旋即是采用人工固相多肽合成的方法而得到。該方法將肽鏈結(jié)合到一種具反應(yīng)活性位點的聚合物（固相支持物，不溶于水和有機(jī)溶劑的樹脂支持物）上，解決了以前多肽合成中分離和純化效率低的難題。Feng等[10]分別構(gòu)建了HMGN2以及HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)域重組表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)HMGN2有抗大腸桿菌、銅綠假單胞菌等的活性，且HMGN2和HMGN2 α-螺旋區(qū)域的抗菌活性相當(dāng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HMGN2除可影響上皮細(xì)胞，也可能對細(xì)菌本身產(chǎn)生一定作用，共同減弱細(xì)菌內(nèi)化，此外，還發(fā)現(xiàn)HMGN2可以抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的生長[11]。

本研究進(jìn)一步采用液體稀釋法測定了HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)嶒灳甑腗IC及MBC值，實驗結(jié)果顯示HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌活性相當(dāng)，這與以往學(xué)者研究結(jié)果一致。HMGN2和HMGN2 α-螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)谇患膊〕Ｒ娭虏【幸种谱饔?，提示抗菌肽HMGN2可能作為一種天然免疫介質(zhì)參與機(jī)體對細(xì)菌的抵抗過程，至于HMGN2分子如何動態(tài)地在各組織細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用，還需要進(jìn)一步研究。

[1] Phair RD, Misteli T. High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus[J]. Nature, 2000, 404 (6778):604-609.

[2] 李薇, 張平, 孔祥麗, 等. 人淋巴結(jié)中HMGN2蛋白的分離純化及其亞細(xì)胞分布研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2010, 27(4):842-846.

Li W, Zhang P, Kong XL, et al. Isolation and purification of antimicrobial polypeptide HMGN2 from human lymph node and analysis of its distribution [J]. J Biomed Eng, 2010, 27(4):842-846.

[3] Hock R, Scheer U, Bustin M. Chromosomal proteins HMG-14 and HMG-17 are released from mitotic chromosomes and imported into the nucleus by active transport[J]. J Cell Biol, 1998, 143(6):1427-1436.

[4] Spieker N, Beitsma M, van Sluis P, et al. An integrated 5-Mb physical, genetic, and radiation hybrid map of a 1p36.1 region implicated in neuroblastoma pathogenesis[J]. Genes Chromosomes Cancer, 2000, 27(2):143-152.

[5] Bustin M. Chromatin unfolding and activation by HMGN chromosomal proteins[J]. Trends Biochem Sci, 2001, 26(7):431-437.

[6] Boumba VA, Seferiadis K, Vougiouklakis T. Content of the HMG-17 chromosomal protein in porcine tissues[J]. Protein Pept Lett, 2004, 11(6):515-519.

[7] West KL, Ito Y, Birger Y, et al. HMGN3a and HMGN3b, two protein isoforms with a tissue-specific expression pattern, expand the cellular repertoire of nucleosome-binding proteins[J]. J Biol Chem, 2001, 276(28):25959-25969.

[8] Amen M, Espinoza HM, Cox C, et al. Chromatinassociated HMG-17 is a major regulator of homeodomain transcription factor activity modulated by Wnt/beta-catenin signaling[J]. Nucleic Acids Res, 2008, 36(2):462-476.

[9] Boumba VA, Tsolas O, Choli-Papadopoulou D, et al. Isolation by a new method and sequence analysis of chromosomal HMG-17 protein from porcine thymus[J]. Arch Biochem Biophys, 1993, 303(2): 436-442.

[10] Feng Y, Huang N, Wu Q, et al. HMGN2: a novel antimicrobial effector molecule of human mononuclear leukocytes[J]. J Leukoc Biol, 2005, 78(5): 1136-1141.

[11] Hu A, Dong X, Liu X, et al. Nucleosome-binding protein HMGN2 exhibits antitumor activity in oral squamous cell carcinoma[J]. Oncol Lett, 2014, 7(1): 115-120.

（本文編輯 駱筱秋）

Immunohistochemical localization and antimicrobial properties of high mobility group protein N2

Liu Yi1, Zhou Rongjing2, Fei Wei1.
(1. Dept. of Oral Medicine, Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital, Chengdu 610072, China; 2. Dept. of Oral Medicine, Liaocheng People's Hospital, Liaocheng 252000, China)

This study was supported by Doctoral Fund of Sichuan Provincial People's Hospital(30305030568).

Objective To study immunohistochemical localization of high mobility group protein N2(HMGN2) protein in porcine tissues, and evaluate the antimicrobial activity of its active domain, α-helical domain in vitro. Methods In this study, we investigated the localization of HMGN2 protein in porcine tissues using the immunohistochemical method. In addition, we isolated and purified HMGN2 from porcine thymus and lymph node by the high-performance liquid chromatography(HPLC), and then we synthesized α-helical domain of HMGN2. After that, we evaluated the antimicrobial activity of HMGN2 and α-helical domain of HMGN2, against Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Candida albicans and Escherichia coli in vitro. Results The results showed that HMGN2 could be isolated and purified from porcine thymus and lymph node, and all the tested porcine tissues were immunoreactive to HMGN2 proteins. The proteins mostly presented in the cytoplasm and nucleus. Synthetic α-helical domain of HMGN2 and HMGN2 had equivalent antibacterial activity, and both of them had potent antimicrobial activity against the selected bacteria and fungi. Conclusion The study suggested that the HMGN2 proteins mostly presented in the cytoplasm and nucleus in porcine tissues, and HMGN2 and synthetic α-helical domain of HMGN2 had potent antimicrobial activity against some bacteria and fungi.

high mobility group protein N2； im-munohistochemistry； antibacterial activity

R 782

A [doi] 10.7518/gjkq.2016.06.010

2016-01-23；

2016-05-21

四川省人民醫(yī)院博士基金（30305030568）

劉奕，副主任醫(yī)師，博士，Email：liuyi82404@hotmail.com

費(fèi)偉，主任醫(yī)師，博士，Email：fwross10@foxmail.com