葛根芩連湯治療對2型糖尿病濕熱證腸道菌群影響

曾藝鵬，馮新格，谷成英，郭亞芳，許迎烈

（復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院/上海市浦東醫(yī)院，上海 浦東新區(qū) 201399）

葛根芩連湯治療對2型糖尿病濕熱證腸道菌群影響

曾藝鵬，馮新格，谷成英，郭亞芳，許迎烈

（復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院/上海市浦東醫(yī)院，上海 浦東新區(qū) 201399）

目的：觀察葛根芩連湯治療2型糖尿病濕熱證的療效及對患者腸道菌群的影響。方法：將42例2型糖尿病濕熱證患者隨機分兩組，對照組使用單純西藥治療，中藥組在西藥治療的基礎(chǔ)上聯(lián)用葛根芩連湯。采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對患者糞便樣本中所有細菌的16S rRNA－V3區(qū)進行DNA測序，通過實時定量PCR對腸道菌群進行定量分析。對比觀察兩組患者治療前后療效與腸道菌群的關(guān)系。結(jié)果：中藥組總有效率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＝0.02)。濕熱證減分率和Bacteroides含量成負相關(guān)；濕熱證減分率和Fusobacterium含量呈正相關(guān)。結(jié)論：葛根芩連湯聯(lián)合西藥可有效治療濕熱證2型糖尿病，Bacteroides和Fusobacterium含量變化可作為療效觀察的標志物。

濕熱證； 2型糖尿病； 腸道菌群； 葛根芩連湯

為探索中藥治療2型糖尿病的機制提供了新的視野，我們將在前期研究[1]的基礎(chǔ)上，擬通過對2型糖尿病腸道菌群的高通量測序，分析濕熱與腸道菌群的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：于2015年1月至2015年12月間，隨機選擇42例經(jīng)本院門診及住院診治為2型糖尿病伴濕熱證型患者作為研究對象，均符合1999年WHO糖尿病診斷標準，且中醫(yī)辨證為濕熱證[2]。排除標準：排除年齡＜18歲，腸道器質(zhì)性疾病者，嚴重心、肝、腎等病變患者，腹部手術(shù)史者，懷孕期或哺乳期者，近兩周內(nèi)使用過膨脹劑、止瀉藥、解痙藥、益生菌及抗生素等藥物。將研究對象利用SPSS軟件隨機分組程序分兩組：中藥組21例，男性9例，女性12例，平均年齡（38± 6.87）歲，BMI指數(shù)（28.03±3.23）kg/m2，病程（4.56±1.52）年；對照組21例，男性10例，女性11例，平均年齡（40.02±7.23）歲，BMI指數(shù)（29.11±3.94）kg/m2，病程（4.32±1.61）年。兩組一般資料及濕熱證候積分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治療方案：對兩組患者進行糖尿病健康教育知識普及以及運動方面的指導(dǎo)，并在治療的過程中嚴格控制患者的飲食。其中對照組的患者給予阿卡波糖、二甲雙胍、瑞格列奈、格列美脲、吡格列酮等口服降糖藥進行治療。中藥組患者在服用對照組口服藥物的基礎(chǔ)上，加用葛根芩連湯加減（葛根20g、黃芩9g、甘草6g、黃連12g。加減：陰虛熱盛者合用白虎湯；氣陰兩虛者合用生脈飲；舌苔黃膩者加生薏苡仁、六一散；形體肥胖、脘腹脹滿、不欲飲食，心下痞者合平胃散）。每次100mL，每天2次；連續(xù)用藥2周為一療程，觀察1個療程。

1.3 16S rRNA－V3區(qū)的PCR擴增及測序：無菌條件下獲取自然排出的新鮮糞便（10±5）g，放入無菌凍存管后立即速凍，采樣程序符合醫(yī)院倫理要求。送至實驗室提取DNA，糞便樣本－80℃保存。用提取的總DNA作為模板，16S PCR引物由測序接頭引物、Index 和V3區(qū)引物3部分組成。Index為6bp核苷酸隨機組成的序列，以標記PCR產(chǎn)物的來源。PCR擴增體系采用25μL：2×Master Mix（NEB，美國）12.5μL，引物各1.5μL，模板2.5μL，滅菌雙蒸水7μL（如模板DNA濃度較低則不加滅菌雙蒸水，加等體積的模板）。擴增條件：98℃預(yù)變性30s，98℃10s，50℃30s，72℃30s，20個循環(huán)，最后72℃延伸7min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后將全部反應(yīng)產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳（溴化乙錠染色）檢測擴增片段大小，采用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德國）對目的條帶膠回收純化。將純化后的16SrRNA－V3區(qū)的PCR產(chǎn)物送至進行測序，測序平臺為Illumina Miseq。

1.4 實時熒光定量PCR：采用ABI實時定量PCR儀器對 Bacteroides F：GAGAGGAAGGTCCCCCAC，R：CGCTACTTGGCTGGTTCAG；Fusobacterium F：CCCTTCAGTGCCGCAGT；R：GTCGCAGGATGTCAAGAC分別進行定量檢測。PCR均采用25μl反應(yīng)體系，包括2 ×PCR Mix，2U Taq DNA聚合酶，0.2mmoL/L dNTP，正反向引物各0.1μmoL/L以及5μl DNA模板。反應(yīng)程序為95℃ 1min，95℃ 25s，59℃ 30s，72℃ 20s，40個循環(huán)。熒光定量反應(yīng)均以濃度101～108拷貝/μl的標準菌種16S rRNA基因片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建標準曲線，用每克糞便16S rRNA基因拷貝數(shù)的對數(shù)值表示兩個組別所有個體細菌數(shù)量。樣品定量數(shù)據(jù)經(jīng)log10轉(zhuǎn)換后錄入SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。

1.5 觀察指標：中醫(yī)證候積分評定按中醫(yī)癥狀分級標準（半定量積分法）。增加脘腹脹滿、惡心嘔吐、口有穢臭、舌紅苔黃膩、脈滑數(shù)等濕熱證候積分項。證候積分評定分濕熱證候積分，非濕熱證候積分。濕熱證候計分標準：陰性計0分，輕度計2分，中度計4分，重度計6分，舌紅計2分，苔黃膩計2分，脈滑數(shù)計2分（舌脈計分，分0和2分2個等級）。

1.6 療效評定標準[3]：顯效：患者在治療后的中醫(yī)癥狀、體征有明顯的改善，且證候積分減少70％以上；有效：患者的中醫(yī)臨床癥狀、體征有明顯好轉(zhuǎn)，且證候積分減少30％以上；無效：患者的中醫(yī)臨床癥狀、體征無明顯的改善甚至加重，且中醫(yī)證候積分減少小于30％?？傆行剩ǎィ剑@效例數(shù)＋有效例數(shù)）/患者例數(shù)×100％。補充總有效率計算方法

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析：本實驗所有數(shù)據(jù)運用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率表示，進行卡方檢驗，UniFrac analysis進行腸道菌群主成分分析，Spearman秩相關(guān)進行變量間相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

表1 兩組患者顯效率及總有效率比較

2.1 兩組臨床療效比較：兩組治療過程中均無明顯不良反應(yīng)；治療后，中藥組患者的癥狀改善，顯效及總有效兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P值分別是0.04和0.02），見表1。

2.2 兩組治療前腸道菌群結(jié)構(gòu)分析：PLS－DA圖形分析可以有效的對組間觀察值進行區(qū)分，找到導(dǎo)致組間區(qū)別的影響變量。入組前對兩組（C組：對照組；D組：中藥組）研究對象腸道菌群通過V3 16S rRNA進行深度測序，兩組研究對象腸道菌群組間樣本交錯分散分布，未顯示出腸道菌群的組間差別，如圖1所示。多樣本相似度樹狀圖是利用樹枝結(jié)構(gòu)描述和比較呈現(xiàn)多個樣本間的相似性和差異關(guān)系，樣本之間的差異越小，樣本便會處在相近的同一分支上。同樣，在圖2顯示入組前對兩組研究對象腸道菌群未出現(xiàn)明顯組間差異。

圖1 PLS－DA圖形分析

圖2 相似度樹狀圖

2.3 腸道菌群與治療后濕熱證評分減分率的Spearman秩相關(guān)分析：治療后，中藥組Bacteroides含量與濕熱評分減分率成負相關(guān)（R＝－0.57，P＜0.001）（圖3A），F(xiàn)usobacterium含量與濕熱評分減分率成正相關(guān)（R＝0.58，p＝0.01）（圖3B）；而對照組Bacteroides和Fusobacterium含量與濕熱評分減分率均沒有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)和P值分別是（R＝－0.06，p＝0.79）（圖3C）和（R＝0.35，p＝0.12）（圖3D）。

圖3 濕熱評分減分率和Bacteroides與Fusobacterium含量的相關(guān)性

3 討 論

2型糖尿病是一種以胰島素抵抗和慢性炎癥為主要特征的代謝性疾病，其各種并發(fā)癥相互關(guān)聯(lián)相互影響[3]，我們前期的研究發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯聯(lián)合胰島素治療2型糖尿病，不僅可以減少胰島素用量并有效控制血糖水平，而且可以明顯改善2型糖尿病的濕熱證候[1]。本研究通過分析葛根芩連湯治療2型糖尿病濕熱證與腸道菌群的變化關(guān)系，探討2型糖尿病濕熱證候療效的相關(guān)機制。

我們認為2型糖尿病濕熱證腸道菌群成分和結(jié)構(gòu)具有一定的特異性和相似性，腸道菌群同樣影響2型糖尿病濕熱證候。本研究沒有納入正常人作為對照，僅對2型糖尿病濕熱證中藥治療前后腸道菌群進行了分析。治療前在腸道菌群的PLS－DA和樹狀圖中兩組研究對象沒有差異；在治療后，通過對腸道菌群的定量分析發(fā)現(xiàn)，實驗組兩種細菌Bacteroides和Fusobacterium在比對了對照組后發(fā)生了特異性的變化。濕熱證減分率越低，Bacteroides含量越高，提示治療無效可能與Bacteroides含量相關(guān)；而濕熱證減分率越高，F(xiàn)usobacterium含量越高，提示治療有效可能與Fusobacterium含量相關(guān)。

腸道菌群存在互相競爭抑制作用，有研究認為Bacteroides作為一種革蘭陰性菌是一種主要的致炎細菌，增加腸道粘膜的通透性，促進炎癥的形成，葛根芩連湯的抗炎作用可能抑制它們的生長。而Fusobacterium作為一種革蘭陽性菌是一類能產(chǎn)丁酸的細菌，丁酸能促進腸道合成粘蛋白，保護腸黏膜的完整性[4]。通過本研究，我們認為Bacteroides和Fusobacterium可以作為葛根芩連湯治療濕熱證2型糖尿病療效的標志物，同時也可以為靶向治療2型糖尿病提供合適的靶標。

葛根芩連湯在一定程度上改善了腸道微生態(tài)，能有效抑制致炎細菌、促進益生菌的生長。葛根芩連湯中黃岑、黃連均有抗炎抗病毒作用，葛根解熱消炎，甘草利尿解毒，葛根芩連湯可能通過改變腸道菌群，進而影響患者治療后的中醫(yī)濕熱證候。近年的動物或臨床研究試驗發(fā)現(xiàn)，葛根芩連湯具有顯著的降糖、降血脂的效果，同時顯著調(diào)節(jié)了腸道菌群產(chǎn)生的代謝物，在2型糖尿病等代謝性疾病的治療上具有巨大的應(yīng)用潛力。

[1]曾藝鵬，黃云勝，胡蘊剛，等.葛根芩連湯配合胰島素強化治療濕熱證2型糖尿病臨床觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（6)：514～520.

[2]國家中醫(yī)藥管理局.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行) [M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002.

[3]楊維娜，李冬民，曹三成，何嵐，呂社民.2型糖尿病各并發(fā)癥及影響因素的臨床分析[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，8：573～575.

[4]Egshatyan L，Kashtanova D，Popenko A，et al.Gut microbiota and diet in patients with different glucose tolerance[J].Endocrine connections，2016，5（1)：1～9.

Effect of Intestinal Flora of Type 2 Diabetes Patients with Dampness－h(huán)eat Syndrome Treated with Gegen Qinlian Decoction

ZENG Yipeng，F(xiàn)ENG Xinge，GU Chengying，et al

（Shanghai Pudong Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai Pudong201399，China)

Objective：To observe the effect of Gegen Qinlian Decoction in treating type 2 diabetes patients with dampness－h(huán)eat syndrome and the effect of intestinal flora.Methods：Forty－two type 2 diabetes patients with damp－h(huán)eat syndrome were randomly divided into 2 groups：the control group was treated with Western medicine alone，and the experimental group was treated with integrated Traditional and Western medicine.The fecal samples were collected to extract bacterial genome DNA，and the composition was investigated by Illumina Miseq high－throughput sequencing of the V3 region of the 16S rRNA gene.Species in feces were also measured by real－time quantitative PCR.The relationship between effectiveness and gut microbiota was observed after treatment.Results：The total effectiveness of experimental group was higher than that of control group.Bacteroides correlated negatively with the reduction rate of dampness－h(huán)eat syndrome，while Fusobacterium correlated positively with the reduction rate of dampness－h(huán)eat syndrome.Conclusion：The combination of Gegen Qinlian Decoction with Western medicine has the effective treatment among type 2 diabetes patients with dampness－h(huán)eat syndrome，and Bacteroides and Fusobacterium could be the markers of effectiveness.

Dampness－h(huán)eat syndrome； Type 2 diabetes； Gut microbiota； Gegen Qinlian Decoction

1006－6233（2016)10－1731－04

A【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.10.064

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金項目，（編號：PKJ2012－Y20）；上海市浦東新區(qū)傳統(tǒng)型中醫(yī)臨床示范學(xué)科建設(shè)項目，（編號：PDZXK－3－2013009）