人源抗EV71病毒中和表位SP70 的Fab抗體研制

余艷瓊，翁育偉，嚴延生

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人源抗EV71病毒中和表位SP70 的Fab抗體研制

余艷瓊1，翁育偉2,3，嚴延生2,3

目的 構(gòu)建人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫，篩選具有中和活性的人源單克隆抗體，為EV71感染引起的手足口病臨床診斷及治療奠定基礎。方法 從成人志愿者抗凝血中分離外周淋巴細胞，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用人源IgG Fab段基因引物擴增輕鏈及重鏈Fd區(qū)基因，分步克隆至pComb3載體，構(gòu)建Fab噬菌體抗體庫。以SP70為抗原對Fab噬菌體抗體庫進行富集篩選，將獲得的重組噬菌體感染XL1-Blue菌并誘導表達，用SP70對誘導表達的菌上清進行篩選。結(jié)果 共獲得3株輕、重鏈基因組合序列不同的克隆，且這3株Fab抗體可特異性結(jié)合SP70多肽。結(jié)論 成功構(gòu)建人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫，并從中篩選出3株針對EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1上中和線性表位SP70的特異性人源Fab抗體，為研發(fā)新的手足口病診斷和治療工具奠定基礎。

EV71病毒；手足口??；噬菌體展示技術(shù)；人源化抗體；抗體Fab段；SP70

腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是一類單正鏈無包膜RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒A屬成員[1]。近年來，由EV71病毒引起的手足口病對嬰幼兒和兒童的健康成長造成了嚴重威脅，特別是EV71感染造成的重癥和死亡病例高居不下，已成為我國的重要公共衛(wèi)生問題之一[2-5]。雖然已經(jīng)研發(fā)了EV71疫苗，且臨床試驗證實疫苗安全、有效[6-7]，但尚無市售商品化疫苗問世[8]；此外，對于EV71病毒引起的手足口病仍然缺乏有效防治措施[9]。

單克隆抗體因具有性質(zhì)純、效價高、特異性強、少或無血清交叉反應等特點，已被廣泛應用于腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等疾病治療[10-12]。因此，抗EV71單克隆抗體是一種潛在的、具有重要臨床應用前景的侯選藥物，或可應用于EV71感染引起手足口病的臨床治療，降低重癥及死亡。SP70是EV71病毒VP1結(jié)構(gòu)蛋白上具有中和活性的肽段[1]。研究表明，應用合成SP70多肽免疫小鼠，產(chǎn)生的鼠源性單克隆抗體對EV71病毒具有明顯的中和活性[13]。但鼠源抗體對人體免疫系統(tǒng)具有較強的免疫原性，可誘發(fā)人抗鼠抗體反應，同時鼠源抗體不能有效激活人體免疫系統(tǒng)的生物效應功能[14]，從而限制了其臨床應用。本研究采用噬菌體表面展示技術(shù)，構(gòu)建人源抗EV71病毒Fab抗體庫，從中篩選針對EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1上中和線性表位SP70的特異性人源Fab抗體，從而為EV71病毒引起的手足口病診斷和治療工具研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞、菌株及載體 EV71病毒分離株(2010FJLY008)，C4a亞型，Gene Bank No.HQ426649，由福建省疾病預防控制中心病毒科分離；人橫紋肌肉瘤RD細胞、大腸埃希菌(E.coli) XL1-Blue株、噬菌體載體pComb3由福建省疾病預防控制中心病毒科保存。

1.1.2 多肽及單抗 SP70多肽(氨基酸序列為：YPTFGEHKQEKDLEY)由上海生工公司合成，純度≥95%；人源抗狂犬病毒Fab單克隆抗體由中國疾病預防控制中心病毒病所出血熱室提供。

1.1.3 主要試劑 人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品公司；TRIzol○RLS Reagent及cDNA合成試劑盒購自Invitrogen公司；HRP-抗人IgG(Fab)抗體、抗人 IgG(Fab)抗體及FITC-抗人IgG(Fab)抗體購自Sigma公司；FITC-抗鼠抗體購自Dako公司；內(nèi)切酶及T4 DNA 連接酶購自New England Biolabs公司產(chǎn)品；鼠源抗EV71病毒單克隆抗體購自Merck Millipore公司；其他試劑均為實驗室常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細胞供體篩選 采集16名成人志愿者外周血3 mL，分離血清，以EV71病毒LY008分離株為抗原，通過免疫熒光試驗(IFA)檢測血清抗體，并進一步檢測血清中針對EV71病毒的特異性中和抗體滴度，篩選出EV71病毒感染者。中和抗體滴度檢測方法參照《手足口病防治手冊》[19]。再將SP70(200 ng/孔)包被于高吸附96孔板中，采用ELISA法，檢測其SP70多肽結(jié)合活性。

1.2.2 噬菌體抗體庫的構(gòu)建 從上述抗EV71病毒中和抗體陽性成人志愿者外周血中分離淋巴細胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以人源抗體IgG Fab段基因引物[20]擴增重鏈Fd區(qū)基因、Kappa和Lambda輕鏈基因，PCR條件為：95 ℃預變性 5 min，94 ℃變性 1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)后，72 ℃延伸 10 min。利用XbaI/SacI、XhoI/SpeI內(nèi)切酶將擴增出的人源抗體輕鏈片段及重鏈Fd區(qū)片段分步克隆至pComb3載體，電轉(zhuǎn)至E.coliXLI-Blue，加入輔助噬菌體VCSM13進行感染，最終形成Fab噬菌體抗體菌庫。將梯度稀釋后的抗體庫溶液感染XLI-Blue菌后均勻涂至含有氨芐青霉素的LB平皿，次日隨機挑選單菌落，快提質(zhì)粒后XbaI/SacI雙酶切驗證輕鏈插入率，XhoI/SpeI雙酶切驗證重鏈插入率，以檢測轉(zhuǎn)化效率；計算菌落數(shù)，按每mL輕鏈或重鏈抗體庫所含的克隆數(shù)計算庫容。

1.2.3 噬菌體抗體庫的富集篩選 采用高吸附96孔板包被多肽抗原SP70，進行3輪富集篩選，3輪SP70包被量分別為2 μg/孔、500 ng/孔和100ng/孔。第1輪用0.1 mol/L NaHCO3包被液(pH 8.6)將合成多肽SP70包被于高吸附96孔板，4 ℃過夜；次日洗去未結(jié)合的抗原，并用B-MPBST(PBST 加入1%脫脂奶及1%BSA，新鮮配制使用)于37 ℃中封閉1 h后，加入100 μL預先活化的Fab噬菌體抗體庫，37 ℃孵育2 h，用PBS-T( PBS 加入0.1%Tween-20)反復洗20遍，再用PBS洗2遍，最后每孔用100 μL甘氨酸鹽酸洗脫液(pH 2.2)洗脫，再用適量的2 mol/L Tris液中和洗脫下的噬菌體；再次感染A600=0.5左右的XLI-Blue菌液，經(jīng)輔助噬菌體VCSM13感染后進入下一輪富集篩選，重復上述步驟，對抗體庫共進行3輪富集篩選。

1.2.4 Fab陽性克隆誘導表達及篩選鑒定 隨機挑選經(jīng)3輪富集篩選后的單菌落，過夜培養(yǎng)并利用IPTG誘導劑，30 ℃誘導表達過夜；次日離心后吸取菌上清用于ELISA檢測，分別用多肽抗原SP70及抗人Fab抗體包被高吸附96孔板，加入待測樣品菌上清，用HRP酶標的抗人Fab二抗檢測 Fab活性及抗原結(jié)合活性。

1.2.5 Fab陽性克隆基因序列分析 對篩選獲得的陽性菌克隆提取質(zhì)粒后，檢測Fab段輕、重鏈基因序列，并用DNA star軟件對測序結(jié)果進行分析處理，獲得其氨基酸序列分析結(jié)果，結(jié)合Internet V-Base基因庫中的IgG家族序列，確定陽性克隆的抗體輕、重鏈。

2 結(jié) 果

2.1 EV71病毒感染者篩選 對16例成人志愿者血清進行EV71抗體IFA及EV71病毒中和抗體滴度檢測，選出IFA反應陽性(圖1)，且抗EV71中和抗體滴度最高的血清，其血清滴度為1∶128。進一步對該血清進行SP70多肽結(jié)合活性ELISA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該名志愿者血清具有SP70多肽結(jié)合活性。抽取該患者外周血50 mL，置于肝素瓶中備用。

2.2 人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建 分離供體外周血淋巴細胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用人IgG Fab基因引物擴增了IgG重鏈Fd區(qū)基因和輕鏈基因(圖2)。合并輕鏈PCR純化產(chǎn)物，經(jīng)XbaI/SacI雙酶切后克隆入pComb3載體，電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞，建立輕鏈庫(pComb3-L)。再將重鏈Fd段PCR純化產(chǎn)物及pComb3-L載體分別進行XhoI/SpeI雙酶切，純化酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后，電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞，構(gòu)建噬菌體Fab抗體庫。雙酶切驗證輕、重鏈基因插入率，結(jié)果顯示輕鏈、重鏈的插入率均接近100%，且輕、重鏈抗體庫的平均庫容量均可達到108。

圖1 人血清EV71病毒免疫熒光分析Fig.1 Immunofluorescence assay of EV71 in human serum

M:100 bp DNA marker；1-5：κappa基因PCR產(chǎn)物；6-13：lamda基因PCR產(chǎn)物；14-21：Fd基因PCR產(chǎn)物. M: 100 bp DNA marker; 1-5: PCR products of κappa chain genes; 6-13: PCR products of lambda chain genes; 14-21: PCR products of Fd chain genes.圖2 人源抗體Fd、κappa及l(fā)amda基因PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR products of Fd,κappa and lamda chain genes

2.3 人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫的富集篩選 經(jīng)過3輪富集篩選后隨機挑選800個克隆，誘導表達后，用抗人Fab抗體(1∶1 000)及純化的SP70為抗原包被高吸附96孔板，分別加入待測樣品菌上清，用HRP標記的抗人Fab二抗(1∶1 000)進行ELISA檢測。結(jié)果共獲得51個既有Fab抗體表達的同時也具有與多肽抗原SP70結(jié)合活性的克隆，陽性克隆與SP70多肽抗原特異性結(jié)合活性及與人源Fab表達活性ELISA檢測結(jié)果見圖3、4。

圖3 ELISA 檢測Fab抗體與SP70多肽抗原的特異性結(jié)合Fig.3 Specific binding of Fab antibody to SP70 antigen detected using ELISA

圖4 ELISA檢測人源Fab抗體表達Fig.4 Expression of Fab antibodies detected by ELISA

2.4 人源抗EV71病毒Fab抗體序列 將上述51個陽性菌克隆提取質(zhì)粒后，通過序列測定確定其基因序列，與Internet V-Base基因庫比對確定IgG家族，與IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫比對，確定51個陽性克隆的抗體輕、重鏈型別，其中有15個克隆為同一抗體基因序列，本文將其命名為antiEV71-Fab1；有24個克隆為同一抗體基因序列，將其命名為antiEV71-Fab2；其余12個克隆抗體基因序列相同，將其命名為antiEV71-Fab3。即共獲得3株具有不同抗體輕、重鏈基因組合序列的Fab抗體，其重鏈可變區(qū)主要分布在IgG VH1、VH3及VH4家族，輕鏈可變區(qū)主要分布在IgG VK3和Vλ1家族。這3株Fab抗體的互補決定區(qū)重鏈、輕鏈基因的氨基酸序列見表1、2。

表1 人源抗EV71病毒Fab抗體重鏈可變區(qū)基因的氨基酸序列
Tab 1 Deduced amino acid sequences of heavy chain V regions of humanized Fab antibody against EV71

FabcloneVHCDR1CDR2CDR3AntiEV71-Fab1VH1GQTFSSYAIIPIWGTFARSYGSSWTAGGFQHAntiEV71-Fab2VH3GFTSSQHYIPWNFGSAARYQSGWRAGDHAntiEV71-Fab3VH4GQSIFSGTYAIYASGYTARDKPGLHWFALGGFHP

表2 抗EV71病毒人源Fab抗體輕鏈可變區(qū)基因的氨基酸序列
Tab 2 Deduced amino acid sequences of light chain V regions of humanized Fab antibody against EV71

FabcloneVLCDR1CDR2CDR3AntiEV71-Fab1VK3QAVASFNGASQQGSNWTPTATAntiEV71-Fab2VK3QTVGSNDTSQARSNGDPADTAntiEV71-Fab3Vλ1NSFIGNSYRTNATSDTNVSPWA

3 討 論

本研究采用噬菌體展示技術(shù)[16]從EV71感染的成人志愿者抗凝血中分離外周淋巴細胞，構(gòu)建人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫，并選擇SP70為抗原對Fab噬菌體抗體庫進行富集篩選。其中有51個克隆具有與多肽抗原SP70特異性結(jié)合活性，對其進行序列分析，獲得的氨基酸序列比對顯示，共有3株具有不同抗體輕、重鏈基因組合序列的Fab抗體，分別命名為antiEV71-Fab1、antiEV71-Fab2、antiEV71-Fab3。

雖然EV71感染后主要在嬰幼兒及學齡前兒童發(fā)病[1]，但嬰幼兒體內(nèi)EV71病毒保護性抗體水平非常低[17]。研究表明[18]，在EV71病毒引起的腦膜腦炎患兒體內(nèi)，其中和抗體水平與正常兒童無明顯差異。造成這樣現(xiàn)象的原因可能是：嬰幼兒免疫應答機制不成熟，而且體內(nèi)淋巴細胞仍處于動態(tài)變化中、功能尚不完善，所以合成抗體能力也較差[19]。因此，選擇恢復期EV71感染患兒外周血作為人源性EV71病毒中和抗體的供體，可能無法獲得高中和效價的中和抗體。本研究采用既往感染的成人外周淋巴細胞作為中和抗體來源，在一定程度上更有利于獲得高效價抗病毒中和抗體。

抗原是決定特異性抗體篩選的關鍵，直接關系到抗體庫篩選的有效性[21]。完整的EV71病毒顆粒雖然保留了所有天然抗原表位，有利于篩選到多種具有天然抗原結(jié)合活性的特異性中和抗體，但由于病毒顆粒制備步驟繁瑣，且不易提純，不利于抗體庫的篩選。相比之下，合成多肽具有制備簡單，純度高，且特異性強，適合用于抗體庫的篩選。綜合考慮成本-效益后，本研究選用EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1上中和線性表位SP70作為篩選抗原。EV71抗體表位主要位于VP1結(jié)構(gòu)蛋白上，而SP70是位于VP1結(jié)構(gòu)蛋白上208～222位氨基酸的肽段[1]。Foo等[22]證實 SP70免疫小鼠產(chǎn)生的中和抗體效價與以完整病毒作為免疫源所產(chǎn)生的抗體效價一致，且SP70的氨基酸殘基序列分析顯示，在不同亞型病毒間SP70呈現(xiàn)高度保守性。Li等[13]用SP70免疫小鼠后獲得的鼠單克隆抗體，經(jīng)與EV71病毒進行中和實驗后發(fā)現(xiàn)該株鼠單抗具有中和活性，進一步證明了SP70作為中和性線性表位的重要性。基于SP70多肽的諸多優(yōu)勢，我們合成了SP70的裸肽蛋白，以其作為抗體庫篩選所需的抗原，經(jīng)過3輪“吸附-洗脫-擴增”后，成功篩選出了3株SP70線性表位特異性的人源Fab單克隆抗體。這3株克隆的重鏈可變區(qū)主要分布在IgG VH1、VH3及VH4家族，輕鏈可變區(qū)主要分布在IgG VK3和Vλ1家族，造成所獲得的Fab抗體的重、輕鏈基因家族的多樣性有限的原因可能有：1)在構(gòu)建噬菌體抗體庫時，由于樣本來源有限，我們只選取了1名曾感染過EV71病毒的成人志愿者外周血，這可能對抗體庫的多樣性有一定程度的影響；2)本研究選擇的Fab基因擴增引物，更多的針對人體內(nèi)所占比例較高的IgG1的抗體基因，利用其進行人抗體基因的擴增時，也可能會導致某些遺傳信息的丟失；3)不同個體間抗體基因的使用頻率差異也可能造成抗體的多樣性下降，Davidkova等[23]就曾運用原位雜交的方法，發(fā)現(xiàn)各健康個體之間VH基因家族的使用頻率存在很大差異；4)抗體庫構(gòu)建過程中因操作和方法等因素的影響也可能導致多樣性降低。所以在本次研究過程中，不可避免的存在抗體庫多樣性受限的情況。此外，鑒于SP70僅是EV71病毒中由14個氨基酸組成的多肽，而不是完整的病毒顆粒[1]，故這3株特異性單克隆抗體是否具有針對EV71完整病毒顆粒的中和活性，還有待進一步研究。然而，由于線性多肽在抗體庫篩選中具有簡單、快速的優(yōu)勢，如進一步采用多種線性多肽作為篩選抗原，則可能可以篩選出多價抗病毒中和抗體。

綜上，本研究成功構(gòu)建了人源抗EV71病毒Fab噬菌體抗體庫，并從中篩選出3株針對EV71病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1上中和線性表位SP70的特異性人源Fab抗體，為研發(fā)新的手足口病診斷和治療工具奠定了基礎。

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Yan Yan-sheng, Email:yysh@publ.fz.fj.cn

Development of a humanized Fab antibody against the neutralizing SP70 epitope of EV71

YU Yan-qiong1, WENG Yu-wei2,3, YAN Yan-sheng2,3

(1.HuliDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Xiamen361000,China;2.SchoolofPublicHealth,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;3.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

We developed a humanized Fab phage-display library against EV71, and screened humanized monoclonal antibody with a neutralization activity, so as to provide a basis for clinical diagnosis and treatment of hand, foot and mouth disease induced by EV71 infection. Peripheral blood lymphocytes were isolated from anticoagulated blood specimens of adult volunteers infected with EV71. Total RNA was extracted from lymphocytes, and transcribed reversely into cDNA. The light-chain and heavy-chain Fd fragments were amplified using cDNA as a template, and cloned into the vector pComb3 to construct Fab phage-display library. SP70, a neutralizing linear epitope from the VP1 structural protein of EV71, was used as an antigen for enrichment and screening of Fab phage antibody library, and the yielded recombinant phage was used to infectE.coliXL1-Blue. Then, the supernatant ofE.coliXL1-Blue following induced expression was screened using SP70. A total of 3 light- and heavy-chain clones with various sequences were yielded, which bound specifically to SP70 polypeptide. A humanized anti-EV71 Fab phage antibody library is successful constructed, and 3 specific humanized Fab antibodies are screened that target the neutralizing linear epitope SP70, which provide new insights into the development of novel diagnostics and therapeutics for hand, foot, and mouth disease.

Enterovirus 71 (EV-71); hand, foot and mouth disease; phage display technology; humanized antibody; Fab fragment; SP70

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(No.2011AA02A114)；福建省自然科學基金(No.2010J01115)聯(lián)合資助

嚴延生，Email：yysh@publ.fz.fj.cn

1.福建省廈門市湖里區(qū)疾病預防控制中心，廈門 361000；

2.福建醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，福州 350001；

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.001

R373

A

1002-2694(2016)08-0683-06

2016-03-20；

2016-04-18

3.福建省疾病預防控制中心，福州 350001

Supported by the National High-tech R & D Program of China (No. 2011AA02A114) ,and the Natural Science Foundation of

Fujian Province (No. 2010J01115).