微RNA-129表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及其分子機(jī)制

李青峰，高燕萍，吳勉華

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023；2.南京軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇南京210002）

微RNA-129表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及其分子機(jī)制

李青峰1，高燕萍2，吳勉華1

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210023；2.南京軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇南京210002）

目的分析微RNA-129（miR-129）表達(dá)對(duì)食管鱗癌（ESCC）細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及可能的分子機(jī)制。方法構(gòu)建miR-129過(guò)表達(dá)載體（pGCMV/EGFP/miR-129）和對(duì)照載體（pGCMV/EGFP/ miR-NC），分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ESCC細(xì)胞Eca109和EC9706，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-129表達(dá)水平；MTT法、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)miR-129表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞體外增殖活性、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響；構(gòu)建含有Bcl-2基因3′-UTR野生和突變序列的熒光素酶報(bào)告基因載體，分別與pGCMV/EGFP/miR-129共轉(zhuǎn)染人ESCC細(xì)胞Eca109，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析熒光素酶活性變化；Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2、激活型胱天蛋白酶3及總胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果miR-129過(guò)表達(dá)可顯著抑制食管癌細(xì)胞增殖（P＜0.01），增加細(xì)胞凋亡率（P＜0.05），并誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期比例增加和S期比例降低（P＜0.05），G2/M期比例則無(wú)顯著變化。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析結(jié)果表明，miR-129可顯著降低含有Bcl-2基因3′-UTR野生序列的熒光素酶活性，而不降低含有Bcl-2基因3′-UTR突變序列的熒光素酶活性。Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果提示，miR-129過(guò)表達(dá)可顯著降低ESCC細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，增加激活型胱天蛋白酶3蛋白水平（P＜0.05），總胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。結(jié)論miR-129可能通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2表達(dá)而影響ESCC細(xì)胞增殖活性、凋亡和細(xì)胞周期的變化，為miR-129成為ESCC臨床治療的分子靶標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

miR-129；食管鱗癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；Bcl-2

微RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22 nt大小在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的非編碼小分子RNA，可通過(guò)識(shí)別和特異性結(jié)合靶基因mRNA分子3′端翻譯區(qū)域，從而負(fù)性調(diào)控靶mRNA翻譯，已成為基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域中一類非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子［1］。大量研究表明，miRNA參與調(diào)控人類多種生理學(xué)及病理學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡，同時(shí)在腫瘤發(fā)生，發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用［2-4］。近來(lái)，miRNA-129（miR-129）在結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌和肝癌中的作用已有相關(guān)報(bào)道［5-8］，但其在食管鱗癌（esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC）發(fā)生過(guò)程中的作用并不清楚。本研究檢測(cè)ESCC細(xì)胞中miR-129的表達(dá)，分析miR-129對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

人ESCC細(xì)胞（Eca109和EC9706）、人正常食管上皮細(xì)胞（HEEC）、AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料所；Trizol試劑、MMLV-RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RealMasterMix（SYBR Green）熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自中國(guó)Tiangen公司；鼠抗人Bcl-2、激活型胱天蛋白酶3、總胱天蛋白酶3和GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Biosharp公司；LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；miR-129過(guò)表達(dá)載體（pGCMV/ EGFP/miR-129）及對(duì)照載體（pGCMV/EGFP/miRNC）均由上海吉瑪公司構(gòu)建；含野生型Bcl-2基因3′-非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）的熒光素酶報(bào)告載體（pLUC/Bcl-2-3′-UTR-wt）和含突變型Bcl-2基因3′-UTR的熒光素酶報(bào)告載體（pLUC/Bcl-2-3′-UTR-mut）購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Partec流式細(xì)胞儀，德國(guó)PARTEC公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

ESCC細(xì)胞Eca109和EC9706采用含10% FBS、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。分別將Eca109和EC9706細(xì)胞傳入6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)運(yùn)用脂質(zhì)體法分別將pGCMV/EGFP/ miR-129和pGCMV/EGFP/miR-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)，方法參照LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。培養(yǎng)48 h后，加入含有氨基糖苷類抗生素G418 600 mg·L-1進(jìn)行篩選，每2 d更換篩選培養(yǎng)液，14 d后，挑選6孔板中形成的單細(xì)胞克隆至24孔板中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，直到獲得穩(wěn)定的具有G418抗性的細(xì)胞克隆。穩(wěn)定陽(yáng)性細(xì)胞克隆分別命名為Eca109/miR-129，Eca109/miR-NC，EC9706/ miR-129和EC9706/miR-NC。

1.3 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)miR-129表達(dá)

參照Trizol試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，參照MMLV-RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照ABI 7500 Real-time儀器說(shuō)明書，并根據(jù)RealMasterMix（SYBR Green）熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行miR-129擴(kuò)增，操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書，以U6作內(nèi)參。每一樣本同時(shí)做3復(fù)孔，輸出數(shù)據(jù)為復(fù)孔Ct值的平均值，待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt表示。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活

將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞以每孔1.0×104細(xì)胞密度接種于96孔板，每組設(shè)5復(fù)孔，并設(shè)調(diào)零孔。分別在轉(zhuǎn)染后第20，44，68，92和116小時(shí)，每孔加入MTT 10μL（5.0 g·L-1），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加150μL DMSO溶解紫色顆粒，振蕩混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值（A490nm）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用預(yù)冷1.0×PBS（4℃）洗滌細(xì)胞3次，377.3×g離心5 min，將上清棄凈，加入100μL的1.0×Annexin緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5μL AnnexinⅤ和1μL PI染色、混勻后，避光，室溫孵育約15 min；測(cè)試前補(bǔ)加400μL的1.0×緩沖液，于流式細(xì)胞儀上測(cè)細(xì)胞凋亡情況。每組均設(shè)2復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

收集上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用預(yù)冷1×PBS（4℃）洗滌細(xì)胞2次，調(diào)整細(xì)胞密度約為1.0×108L-1，以-20℃預(yù)冷的75%冰乙醇1 mL固定細(xì)胞，置于4℃冰箱過(guò)夜；以167.7×g離心5 min后棄上清，染色前用PBS洗去固定液，洗滌2次，每次重懸5 min，167.7×g離心5 min；棄上清后加100μL RNA酶A，37℃水浴30 min；再加入400μL PI染色并混勻，4℃避光30 min后，激發(fā)光波長(zhǎng)在488 nm處，流式細(xì)胞儀記錄紅色熒光檢測(cè)細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

收集上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，冰上裂解液處理后，保留上清，采用二喹啉甲酸法檢測(cè)裂解液的蛋白濃度后，每組取等量蛋白，與上樣緩沖液混合后行常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳，取目的條帶行轉(zhuǎn)膜處理后，根據(jù)條帶大小加入適量鼠抗人Bcl-2，激活型胱天蛋白酶3、總胱天蛋白酶3和GAPDH一抗（稀釋度為1∶150），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，每次5 min。加入山羊抗鼠IgG二抗（1∶2000稀釋），室溫40 min，TBST洗滌4次，每次5 min，辣根過(guò)氧化酶底物顯色后用Gel-Pro analyzer軟件分析各條帶積分吸光度（integrated absorbance，IA）值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平用目的條帶與內(nèi)參GAPDH條帶IA比值表示。

1.8 生物信息學(xué)在線分析軟件分析miR-129可能調(diào)控的靶mRNA

運(yùn)用3種miRNA/靶mRNA在線生物信息學(xué)分析軟件：miRanda（http：//www.microrna.org），TargetScan（http：//www.targetscan.org）和PicTar（http：//pictar.bio.nyu.edu/）預(yù)測(cè)miR-129可能調(diào)控的下游靶基因。

1.9 熒光素酶活性分析miR-129是否與Bcl-2基因3′-UTR結(jié)合

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ESCC細(xì)胞Eca109并接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)60%～70%時(shí)，按LipofectAMINE 2000說(shuō)明書分別將pGCMV/ EGFP/miR-129+pLUC/Bcl-2-3′-UTR-wt，pGCMV/ EGFP/miR-129+pLUC/Bcl-2-3′-UTR-mut，pGCMV/ EGFP/miR-NC+pLUC/Bcl-2-3′-UTR-wt和pGCMV/ EGFP/miR-NC+pLUC/Bcl-2-3′-UTR-mut共轉(zhuǎn)染至Eca109細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞，按雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。樣品熒光素酶活性＝（海腎熒光素酶活性值-本底值）/（螢火蟲熒光素酶活性值-本底值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 人食管鱗癌細(xì)胞Eca109和EC9706 miR-129表達(dá)水平

如圖1所示，與HEEC比較，ESCC細(xì)胞Eca109和EC9706中miR-129相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。以HEEC細(xì)胞中miR-129相對(duì)表達(dá)量為1.0，ESCC細(xì)胞Eca109和EC9706中相對(duì)表達(dá)量分別為0.45±0.08和0.58±0.11。

Fig.1 MicroRNA-129（miR-129）expression in esopha?geal squamous cell cancer（ESCC）cells（Eca109 and EC9706）detected by quantitative real-time reverse transcription（qRT-PCR）.U6 was used as an internal control.*P＜0.05，compared with normalcontrol HEEC.

2.2 轉(zhuǎn)染miR-129對(duì)Eca109和EC9706細(xì)胞增殖活性的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于Eca109/miRNC和EC9706/miR-NC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞Eca109/ miR-129和EC9706/miR-129細(xì)胞中miR-129表達(dá)水平分別升高304.8%和416.3%（P＜0.01）（圖2A）。MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，相對(duì)于Eca109/miR-NC和EC9706/miR-NC細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞Eca109/miR-129和EC9706/miR-129細(xì)胞增殖活性均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）（圖2B）。表明miR-129表達(dá)水平升高可顯著降低ESCC細(xì)胞增殖活性。

Fig.2 Transfection of miR-129 on proliferation of ESCC cells.A：miR-129 expression in the stably transfected ESCC cells was detected by qRT-PCR；B：proliferation of stably transfected ESCC cells was detected by MTT assay.A1 and B1：Eca109 cells；A2 and B2：EC9706 cells.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with corresponding contro（l miR-NC）group.

2.3 轉(zhuǎn)染miR-129對(duì)Eca109和Ec9706細(xì)胞周期、凋亡和胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，Eca109/miR-129和EC9706/miR-129細(xì)胞G0/G1比例顯著增加（P＜0.05），S期比例顯著降低（P＜0.05）而G2/M期比例無(wú)明顯變化（圖3A）。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，Eca109/miR-129和EC9706/miR-129細(xì)胞凋亡率分別增加了14.5%和18.4%（P＜0.05）（圖3B）。Western蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，Eca109/miR-129和EC9706/miR-129細(xì)胞中激活型胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而總胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化（圖3C）。因此推測(cè)，miR-129表達(dá)水平升高可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，且細(xì)胞凋亡率升高。

Fig.3 Transfection of miR-129 on cell cycle（A），apoptosis（B）and caspase 3 protein expression（C）of Eca109 and EC9706 cells detected by FCM or Western blotting.C1：Eca109 cells；C2：EC9706 cells；IA：integrated absorbance.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with corresponding control（miR-NC）group.

2.4 miR-129對(duì)Bcl-2的調(diào)控作用

Fig.4 Identification of Bcl-2 gene as target gene down?stream regulated by miR-129.A：schematic graph of putative one binding site of miR-129 in Bcl-2/3′-UTR.The human Bcl-2/3′-UTR fragment containing wild-type or mutant miR-129-binding sequence was subcloned into downstream of the luciferase reporter gene in pLUC/luc vector；B：transfection of pGCMV/ EGFP/miR-129 inhibited firefly luciferase activity of pLUC/Bcl-2-3′-UTR-wt.Such inhibition was not observed with mutations in the miR-129-binding site（pLUC/Bcl-2-3′-UTR-mut）；C：Bcl-2 protein expression in stably transfected ESCC cells was detected by Western blotting.C1：Eca109 cells；C2：EC9706 cells；n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with corresponding control（miR-NC）group.

為了進(jìn)一步分析miR-129作用分子機(jī)制，運(yùn)用3個(gè)miRNA/靶基因在線分析軟件（TargetScan，miRanda和PicTar）分析miR-129下游可能調(diào)控的靶基因。圖4結(jié)果顯示，在Bcl-2基因mRNA/3′-UTR（1525～1531堿基：CAAAAA）含有一個(gè)潛在的miR-129結(jié)合位點(diǎn)。依托廣州復(fù)能基因有限公司，分別構(gòu)建含野生型Bcl-2基因3′-UTR的熒光素酶報(bào)告載體（pLUC/Bcl-2-3′-UTR-wt）和含突變型Bcl-2基因3′-UTR的熒光素酶報(bào)告載體（pLUC/ Bcl-2-3′-UTR-mut）（圖4A），分別與pGCMV/ EGFP/miR-NC或pGCMV/EGFP/miR-129共轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，miR-129能靶向野生型Bcl-2基因的3′-UTR，使熒光素酶表達(dá)水平降低，抑制效率為（67.5±3.8）%，顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖4B）。進(jìn)一步用Western蛋白印跡法分析上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞（Eca109/miR-129，Eca109/miR-NC，EC9706/miR-129和EC9706/miR-NC）中Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果提示，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，Eca109/ miR-129和EC9706/miR-129細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）（圖4C）。上述結(jié)果表明，miR-129能與靶基因Bcl-2基因3′-UTR序列結(jié)合，提示Bcl-2是miR-129下游的一個(gè)靶基因。

3 討論

食管癌是世界上最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第7位，死亡率居世界癌癥死因的第6位。中國(guó)是食管癌最高發(fā)的地區(qū)之一，其中ESCC是主要的組織學(xué)類型。由于食管鱗癌具有較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移活性，在早期即可局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，通常大多數(shù)ESCC患者確診時(shí)已為晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)的最佳時(shí)期，再加上放化療一般不敏感，因此食管癌患者的預(yù)后較差［9］。探索ESCC的分子病因?qū)W將有助于尋找ESCC新的腫瘤分子標(biāo)志物，從而進(jìn)一步提高其臨床診治水平。

miRNA是一類平均長(zhǎng)度約為18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，在表觀遺傳學(xué)和翻譯后修飾調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［10］。miRNA能通過(guò)識(shí)別并結(jié)合到靶基因的3′-UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)誘導(dǎo)mRNA的降解或抑制其翻譯從而降低靶基因的表達(dá)，因此在腫瘤中發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的功能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展等各個(gè)階段［11-12］。近年來(lái)，miRNA與ESCC之間的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可用作食管癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。Zhang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-335在ESCC中表達(dá)水平上調(diào)與患者較差的生存預(yù)后密切相關(guān)。另外，Zhou等［14］研究表明，miR-100表達(dá)水平降低不僅與ESCC預(yù)后相關(guān)，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)水平還有助于鑒別哪些臨床患者對(duì)放療敏感。另外，miRNA表達(dá)紊亂被證明在ESCC細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及放、化療耐藥等多種惡性表型形成過(guò)程中還發(fā)揮著重要作用。Li等［15］研究發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡而影響ESCC體內(nèi)外增殖活性。Nie等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Yin Yang-1（YY1）表達(dá)從而調(diào)控ESCC細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Imanaka等［17］研究報(bào)道，miR-141可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控YAP1表達(dá)從而增加ESCC細(xì)胞抵抗順鉑誘導(dǎo)的凋亡并最終產(chǎn)生順鉑化療抵抗。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是一個(gè)多因素及多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，探索新miRNA在ESCC發(fā)展過(guò)程中的作用，有助于進(jìn)一步深入闡明ESCC發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄后分子調(diào)控機(jī)制并構(gòu)建新的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-129是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因性質(zhì)的miRNA，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，包括結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌和肝癌等［5-8，18］，然而miR-129與食管癌之間的關(guān)系并未見相關(guān)的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究探索miR-129在ESCC惡性表型中的作用及可能的下游分子調(diào)控機(jī)制。

本研究首先運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)ESCC細(xì)胞和HEEC中miR-129表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ESCC細(xì)胞中miR-129表達(dá)水平顯著降低，提示miR-129表達(dá)水平下調(diào)可能在ESCC發(fā)生過(guò)程中起重要作用。MTT法檢測(cè)miR-129表達(dá)對(duì)ESCC細(xì)胞體外增殖活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-129過(guò)表達(dá)顯著降低ESCC細(xì)胞的體外增殖能力。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析miR-129表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-129過(guò)表達(dá)組ESCC細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低，G2/M期細(xì)胞比例無(wú)顯著變化。同時(shí)，miR-129過(guò)表達(dá)組ESCC細(xì)胞凋亡率顯著升高，且激活型胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平顯著升高。已有研究表明，miRNA的生物學(xué)功能發(fā)揮依賴下游靶基因的調(diào)控，探索并闡明miR-129下游調(diào)控的靶基因有助于闡明miR-129調(diào)控ESCC功能的分子機(jī)制。運(yùn)用3個(gè)miRNA/靶基因在線分析軟件分析miR-129下游可能調(diào)控的靶mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Bcl-2基因mRNA/3′-UTR（1525～1531堿基：CAAAAA）含有一個(gè)潛在的miR-129結(jié)合位點(diǎn)。在前期結(jié)腸癌的研究中，Karaayvaz等［5］已證明，miR-129可通過(guò)負(fù)向調(diào)控癌基因Bcl-2表達(dá)而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡水平，并最終調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥5-氟尿嘧啶的化療敏感性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Bcl-2是否有miR-129參與調(diào)控ESCC細(xì)胞惡性表型形成的一個(gè)下游功能靶基因，本研究依托廣州復(fù)能基因有限公司分別構(gòu)建含野生型Bcl-2基因3′-UTR和含突變型Bcl-2基因3′-UTR的熒光素酶報(bào)告載體。通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明了miR-129可直接結(jié)合Bcl-2基因mRNA 3′-UTR區(qū)。進(jìn)一步用Western蛋白質(zhì)印檢測(cè)結(jié)果提示，miR-129表達(dá)升高可以顯著降低ESCC細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平。上述結(jié)果均提示，Bcl-2是miR-129在ESCC中的一個(gè)下游功能靶基因。

綜上所述，miR-129表達(dá)水平下調(diào)誘導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，在ESCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用，上調(diào)miR-129表達(dá)可顯著抑制ESCC細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡增加。因此，miR-129有望成為ESCC治療的一個(gè)新分子靶標(biāo)。當(dāng)然，這一論點(diǎn)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，仍有許多問(wèn)題需要進(jìn)一步研究。如①通過(guò)臨床的組織標(biāo)本了解miR-129在ESCC的臨床病理及預(yù)后價(jià)值；②miR-129是否參與調(diào)控ESCC的其他惡性生物學(xué)表型形成，包括侵襲轉(zhuǎn)移、放化療耐藥等；③由于一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，因此除了Bcl-2之外，miR-129是否還通過(guò)調(diào)控其他靶基因從而影響ESCC惡性表型形成等。

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EffectofmicroRNA-129 expression on proliferation，apoptosis and cellcycle of esophagealsquamous cell cancer and its possible molecular mechanism

LIQing-feng1，GAO Yan-ping2，WU Mian-hua1
（1.Jiangsu Collaborative Innovation Center of TraditionalChinese Medicine for Prevention and Treatment of Tumor，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Department of Oncology，GeneralHospitalof Nanjing Military Command，PLA，Nanjing 210002，China）

OBJECTIVE To investigate the effect of microRNA-129（miR-129）expression on malignant phenotypes of esophageal squamous cell cancer（ESCC）cells and its possible molecular mechanisms. METHODS The constructed miR-129-overexpressed vector（pGCMV/EGFP/miR-129）and negative control vector（pGCMV/EGFP/miR-NC）were stably transfected into ESCC cell lines（Eca109 and EC9706），respectively.Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）was performed to detect the expression of miR-129.MTT and flow cytometry（FCM）assays were performed to analyze the effects of miR-129 on proliferation，cell cycle and apoptosis of ESCC cells.Furthermore，a luciferase reporter vector with the putative B-celllymphoma-2（Bcl-2）3′-untranslated region（pLUC/Bcl-2-3′-UTR-wtand pLUC/ Bcl-2-3′-UTR-mut）was constructed to explore whether Bcl-2 was a direct target gene of miR-129 by detecting luciferase activity.Next，Western blotting was performed to detect the expression of Bcl-2，cleaved caspase 3 and totalcaspase 3 proteins.RESULTS Overexpression of miR-129 significantly inhibited proliferation（P＜0.01），induced cellarrest in G0/G1phase（P＜0.05）and enhanced apoptosis（P＜0.05）in ESCC cells.Luciferase reporter assay indicated that Bcl-2 was identified as a direct target gene ofmiR-129.Results of Western blotting showed thatoverexpression of miR-129 significantly reduced the expression of Bcl-2 protein and increased the expression ofcleaved caspase 3 protein，butinduced no changes in total caspase 3 protein in ESCC cells.CONCLUSION miR-129 functions as a tumor suppressor in ESCC cells by targeting Bcl-2 gene.Therefore，miR-129 will be a potential molecular targetfor the treatmentofhuman ESCC.

miR-129；esophagealsquamous cellcancer；proliferation；apoptosis；Bcl-2

The projectsupported by NationalNaturalScience Foundation of China（81273717）

WU Mian-hua,E-mail：wmh7001@163.com

Q522

A

1000-3002-（2016）05-0532-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.008

2015-12-08接受日期：2016-03-18）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81273717）

李青峰，碩士研究生，主要從事腫瘤內(nèi)科學(xué)研究。

吳勉華，E-mail：wmh7001@163.com