鎘誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬和凋亡

劉宣宣，王文倩，毛偉平

（1.南京師范大學(xué)江蘇省分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院生理學(xué)教研室，江蘇連云港222000）

鎘誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬和凋亡

劉宣宣2，王文倩2，毛偉平1

（1.南京師范大學(xué)江蘇省分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210023；2.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院生理學(xué)教研室，江蘇連云港222000）

目的探究鎘（二氯化鎘，CdCl2）能否誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬與凋亡以及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2和AKT蛋白在自噬中的作用。方法將綠色熒光蛋白（GFP）-微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3B（LC3B）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞24 h后，以CdCl22，4，8和10μmol·L-1誘導(dǎo)細(xì)胞12 h，熒光顯微鏡觀察自噬情況；以CdCl22，4，8和10μmol·L-1誘導(dǎo)未轉(zhuǎn)染GFP-LC3B重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞12 h，透射電子顯微鏡下觀察自噬泡；Western蛋白印跡檢測(cè)LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)變化，以及ERK1/2和AKT蛋白的磷酸化表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CdCl2（≤10μmol·L-1）對(duì)HEK293細(xì)胞凋亡的影響。用3-MA（自噬抑制劑）預(yù)處理CdCl210μmol·L-1誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞12 h，Western蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)激活型胱天蛋白酶3的表達(dá)。結(jié)果CdCl2（≤10μmol·L-1）誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞12 h，熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光點(diǎn)狀聚集，電鏡下觀察到自噬泡，Western蛋白印跡檢測(cè)到LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)量增加（P＜0.05，P＜0.01），ERK1/2和AKT蛋白磷酸化水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)出CdCl2（≤10μmol·L-1）誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞凋亡；加入3-MA 20μmol·L-1+CdCl210μmol·L-1后，細(xì)胞自噬被抑制，激活型胱天蛋白酶3表達(dá)增加（P＜0.01）。結(jié)論低濃度CdCl2（≤10μmol·L-1）能引起細(xì)胞自噬，可能通過ERK1/2和AKT蛋白介導(dǎo)細(xì)胞自噬；自噬與凋亡相伴發(fā)生，自噬可能抑制凋亡。

鎘；HEK293細(xì)胞；自噬；細(xì)胞凋亡

鎘（cadmium，Cd）是一種有毒重金屬，國際癌癥研究組織將鎘及其相關(guān)化合物確認(rèn)為第一類致癌物。鎘的化合物可引起人類腎、肝、肺、咽、前列腺等器官發(fā)生癌癥。大量研究表明，長期低劑量接觸鎘主要引起近曲小管與腎小球系膜細(xì)胞的損傷［1］。

自噬是真核細(xì)胞自我保護(hù)的一種方式，是自噬泡包裹著部分細(xì)胞器如線粒體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等被溶酶體所降解的過程。營養(yǎng)缺乏、感染及細(xì)胞器受損等均能激活自噬［2］。目前，自噬的檢測(cè)方法主要有磺酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）染色法、透射電子顯微鏡檢測(cè)自噬小體、綠色熒光蛋白（GFP）-微管相關(guān)蛋白Ⅰ輕鏈3（lightchain 3，LC3）熒光定位和免疫印跡法檢測(cè)LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化等［3］。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，如下幾種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘發(fā)自噬：ClassⅠ磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylino? sitol3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）-哺乳動(dòng)物西羅莫習(xí)（雷帕霉素）靶蛋白〔mammalian target of sirolimus（Rapamycin），mTOR〕和Ras/Raf1-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracel?lular regulated protein kinases，ERK1/2）信號(hào)通路，ClassⅢPI3K復(fù)合物，Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性激酶激酶（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase，CaMKK）β-絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路及活性氧（reactive oxygen species，ROS）等［4］。有研究表明，激活的PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路能夠通過抑制自噬增強(qiáng)細(xì)胞凋亡；而Ras/Raf-1/ERK激酶（ERK kinases，MEK）/ERK的信號(hào)通路中的Raf-1蛋白與PI3K/Akt串聯(lián)的通路通過抑制Raf-1的表達(dá)，從而抑制自噬［5］，說明ERK和Akt的激活在細(xì)胞自噬現(xiàn)象中也存在著相互作用。用ERK的抑制劑處理細(xì)胞可降低細(xì)胞色素c的釋放，同時(shí)活化胱天蛋白酶3，提示ERK也可能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］；也有研究表明，在系膜細(xì)胞中，ERK的抑制劑PD98059對(duì)鎘誘導(dǎo)的CaMKⅡ信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并未起到作用［7］。

用不同濃度鎘處理U937細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)鎘引起細(xì)胞凋亡呈濃度-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系［8］。腎小球系膜細(xì)胞已被證實(shí)是鎘致毒的重要靶點(diǎn)［1］，但尚無研究證實(shí)CdCl2（≤10μmol·L-1）能否誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞自噬，以及自噬與凋亡關(guān)系。本研究旨在使用GFP-LC3熒光定位法探究CdCl2（≤10μmol·L-1）能否引起人胚腎細(xì)胞自噬，相關(guān)蛋白在自噬信號(hào)通路中的作用，以及自噬與凋亡的關(guān)系。通過促進(jìn)或抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，對(duì)疾病的預(yù)測(cè)和預(yù)防提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

人胚腎細(xì)胞HEK293，GFP-LC3B重組質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。人胚腎細(xì)胞HEK293貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1∶3用胰酶消化，傳代。

1.2 試劑及儀器

高糖DMEM（美國Gibco公司），小牛血清（杭州四季青公司），DMSO（美國Amresco公司），磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒（上海碧云天公司），CdCl2、兔抗人LC3B多克隆抗體（美國Sigma公司），ERK1/2、AKT、激活型胱天蛋白酶3（cleaved caspase 3）抗體和3-MA（南京Bioworld公司），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（二抗）（北京中杉金橋公司），ECL發(fā)光液（美國Thermo公司），流式凋亡試劑盒（美國BD公司）。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純（南京化學(xué)試劑廠）。Hera Cell150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），TE-2000U倒置相差顯微鏡（日本尼康公司），F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 熒光顯微鏡觀察GFP-LC3B在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

以每孔1×106L-1HEK293細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長至70%～80%時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。首先，換無抗生素培液（每孔加2 mL培液），30～60 min后將20μL GFP-LC3B質(zhì)粒DNA加到600μL CaCl2溶液中混勻；將DNA-CaCl2溶液加入到600μL BBS（平衡鹽溶液）溶液中，混勻，室溫孵育10～20 min；將DNACaCl2-BBS混合物均勻滴加到6孔板內(nèi)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染成功后的細(xì)胞，隨機(jī)分為GFP-LC3B對(duì)照組和CdCl2（2，4，8和10μmol·L-1）實(shí)驗(yàn)組，6孔板每孔加CdCl22μL，GFP-LC3B對(duì)照組加等量生理鹽水，12 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光點(diǎn)狀聚集細(xì)胞的形成并拍照。均勻分布于細(xì)胞中的LC3B-Ⅰ在CdCl2的誘導(dǎo)下向LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)化，LC3B-Ⅱ一般只出現(xiàn)在自噬體膜或溶酶體膜上，從而形成集中于自噬體膜或溶酶體膜上的綠色熒光點(diǎn)狀聚集。

1.4 透射電子顯微鏡觀察自噬小體

以每孔1×106L-1HEK293細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組各孔依次加入2，4，8和10μmol·L-1的CdCl2溶液2μL，正常細(xì)胞對(duì)照組加等量滅菌生理鹽水，24 h后胰酶消化移至離心管，626×g離心5 min，1×PBS洗滌2次，0.5 mL戊二醛固定樣品，放4℃冰箱3～4 h。吸出戊二醛，將離心管放入60℃水浴鍋內(nèi)，每管中加入20μL液態(tài)瓊脂，0.2 mL PBS和0.2 mL鋨酸脫水，用30%，50%，70%，80%和90%的丙酮依次脫水，每次15 min，無水丙酮脫水2次，每次10 min。丙酮/樹脂（0.2 mL/0.2 mL）浸透1 h、丙酮/樹脂〔0.2 mL/（0.2 mL+0.2 mL）〕浸透1 h；純樹脂，浸透過夜；包埋。30℃，45℃和60℃各聚合1 d。半薄切片（1～10μmol·L-1），甲苯胺藍(lán)染色。超薄切片，雙染（醋酸雙氧鈾避光染色40 min，檸檬酸鉛染色7 min）。透射電子顯微鏡下觀察自噬小體并拍照。

1.5 Western蛋白印跡法檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

HEK293細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和CdCl22，4，8和10μmol·L-1實(shí)驗(yàn)組。收集細(xì)胞，加入含PMSF的裂解液后超聲3次，100℃煮5 min，4℃13 000×g離心2 min，-70℃保存。BCA法進(jìn)行蛋白定量，蛋白上樣量50μg進(jìn)行SDS-PAGE（12%），電泳條件為恒壓90 V，2 h；然后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓24 V，2 h；用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h，PBST洗膜4次，每次15 min；一抗（兔抗人LC3B、ERK1/2、AKT，1∶1000稀釋）4℃孵育過夜；二抗（羊抗兔IgG-HRP，1∶1000稀釋）4℃孵育8 h。ECL熒光顯色，于暗室顯影后掃描。目標(biāo)蛋白與β肌動(dòng)蛋白的積分吸光度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

以3-MA（自噬抑制劑）20μmol·L-1、CdCl210μmol·L-1和3-MA 20μmol·L-1+CdCl210μmol·L-1分別處理HEK293細(xì)胞12 h后，檢測(cè)LC3B-Ⅱ/Ⅰ和激活型胱天蛋白酶3的表達(dá)，一抗（兔抗人LC3B和激活型胱天蛋白酶3，1∶1000稀釋）；二抗（羊抗兔IgGHRP，1∶1000稀釋）。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

HEK293細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組每孔依次加入2μL的CdCl22，4，8和10μmol·L-1溶液，對(duì)照組加等量生理鹽水。凋亡檢測(cè)試劑盒FITC Annexin-Ⅴ和PI檢測(cè)。收集細(xì)胞（2000×g離心5 min），PBS洗滌2次（2000×g離心5 min），制備1×109L-1的細(xì)胞懸液，流式管每管加入100μL 1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，5μL FITC Annexin-V標(biāo)記，避光染色10 min；加入10μL碘化丙啶染液，避光染色5 min；加350μL 1×結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s形式表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Image J軟件分析。SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CdCl2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞中GFP-LC3B的表達(dá)

如圖1所示，與GFP-LC3B細(xì)胞對(duì)照組相比，CdCl2處理各組細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光點(diǎn)狀聚集現(xiàn)象（箭頭所示），提示CdCl2（≤10μmol·L-1）可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬。

2.2 CdCl2誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬

Fig.1 Expression of plasmid GFP-light chain 3（LC3）B in HEK293 cells detected by fluorescent microscope. HEK293 cells transfected with GFP-LC3B were exposed to 2，4，8 and 10μmol·L-1CdCl2for 12 h.Arrows show cytoplasmic GFP-LC3B punctuates.

Fig.2 Electron micrographs of HEK293 cells exposed to CdCl2（A-E：×1000；F：×4000）.HEK293 cells were exposed to CdCl22，4，8 and 10μmol·L-1for 12 h.Arrows show autophagic vacuoles.

如圖2所示，正常細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)基本完好，CdCl2組均出現(xiàn)了自噬泡，CdCl210μmol·L-1時(shí)出現(xiàn)了損傷的細(xì)胞器，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體出現(xiàn)腫脹破裂，其周圍出現(xiàn)空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu)，以及自噬溶酶體內(nèi)最終不能降解的殘?bào)w等（箭頭所示）。提示CdCl2（≤10μmol·L-1）可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬。

2.3 CdCl2誘導(dǎo)對(duì)HEK293細(xì)胞自噬蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)的影響

以CdCl22，4，8和10μmol·L-1處理HEK293細(xì)胞12 h后，自噬蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量均增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖3A）；以CdCl210μmol·L-1處理HEK293細(xì)胞2，4，8，12和24 h后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)均增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖3B），提示CdCl2（≤10μmol·L-1）誘導(dǎo)了HEK293細(xì)胞的自噬。

Fig.3 Effect of CdCl2on expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰproteins in HEK293 cells detected by Western blotting. See Fig.2 for the celltreatment.A2 and B2 are semi-quantitative results of A1 and B1.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup.

2.4 CdCl2誘導(dǎo)對(duì)HEK293細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白p-ERK1/2和p-AKT表達(dá)的影響

圖4結(jié)果所示，以CdCl22，4，8和10μmol·L-1處理HEK293細(xì)胞12 h后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量均增加，即細(xì)胞發(fā)生自噬；ERK1/2和AKT在不同CdCl2濃度下表達(dá)量相同時(shí)，p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達(dá)均增加（P＜0.05，P＜0.01）。提示CdCl2（≤10μmol·L-1）誘導(dǎo)細(xì)胞自噬時(shí)，可能激活了ERK1/2和AKT蛋白的磷酸化，或激活了相關(guān)信號(hào)通路。

Fig.4 Effect of CdCl2on expression of p-extracellular regulated protein kinases（ERK）and p-protein kinase B（PKB/AKT）in HEK293 cells exposed for 12 h detected by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B and C：semi-quantitative results of p-ERK and p-AKT in A.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normal cell control group.

2.5 CdCl2誘導(dǎo)對(duì)HEK293細(xì)胞凋亡的影響

流式結(jié)果（圖5）顯示，以CdCl22，4，8和10μmol·L-1處理HEK293細(xì)胞12 h后，與對(duì)照組相比，CdCl22，4，8和10μmol·L-1組均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；同時(shí)，CdCl2（≤10μmol·L-1）可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬。提示CdCl2（≤10μmol·L-1）時(shí)細(xì)胞自噬與凋亡相伴發(fā)生。

Fig.5 Effect of CdCl2exposure for 12 h on apoptosis of HEK293 cells by flow cytometry microscopy.See Fig.2 for the celltreatment.

2.6 3-MA對(duì)CdCl2誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)作用

圖6結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CdCl210μmol·L-1組自噬蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ和凋亡蛋白激活型胱天蛋白酶3的表達(dá)增強(qiáng)，出現(xiàn)細(xì)胞自噬和凋亡；與CdCl210μmol·L-1組相比，3-MA 20μmol·L-1+CdCl210μmol·L-1組自噬蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)減弱（P＜0.05，P＜0.01），凋亡蛋白激活型胱天蛋白酶3表達(dá)量增加（P＜0.05，P＜0.01）；提示3-MA抑制了細(xì)胞自噬，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡（圖6A）。即低濃度CdCl2（≤10μmol·L-1）誘導(dǎo)細(xì)胞自噬同時(shí)可能抑制細(xì)胞凋亡。

Fig.6 Effect of CdCl2on expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰand cleaved capase 3 proteins in HEK293 cells exposed for 12 h by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment. B：semi-quantitative results of cleaved capase 3 in A*P＜0.05，**P＜0.01，compared with normalcontrolgroup.

3 討論

自噬廣泛存在于生物體內(nèi)，是生物降解胞內(nèi)蛋白，完成細(xì)胞器轉(zhuǎn)化，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式［8］。本研究運(yùn)用重組質(zhì)粒GFP-LC3B的轉(zhuǎn)染、透射電子顯微鏡技術(shù)、Western蛋白印跡和流式細(xì)胞術(shù)等方法，表明CdCl2（≤10μmol·L-1）可誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬，與長期低劑量接觸鎘主要引起近曲小管與腎小球系膜細(xì)胞的損傷結(jié)果［1］一致；Lim等［9］和Oh［10］等通過對(duì)鎘抵抗細(xì)胞RWI38（通過6個(gè)月逐漸增加鎘濃度處理人肺上皮細(xì)胞WI38而誘導(dǎo)形成）進(jìn)行鎘處理后，也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征不明顯，而細(xì)胞自噬作用明顯。由此初步證明，細(xì)胞自噬與凋亡相伴發(fā)生，細(xì)胞自噬可能早于凋亡出現(xiàn)。

本研究中，ERK1/2和AKT的磷酸化在鎘誘導(dǎo)細(xì)胞自噬中起到了重要作用。ERK1/2具體在細(xì)胞自噬中如何發(fā)揮作用還未可知，因此，ERK1/2介導(dǎo)細(xì)胞自噬的具體機(jī)制仍值得探討。

本研究顯示，鎘可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡。自噬抑制劑3-MA增加了細(xì)胞內(nèi)激活型胱天蛋白酶3的表達(dá)和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，推測(cè)細(xì)胞自噬在一定范圍內(nèi)抑制了凋亡，在一定程度上延長了細(xì)胞的存活時(shí)間，這與用三氧化二砷等藥物處理細(xì)胞后，自噬與凋亡共存的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［11］相一致。Dong等［12］在血管上皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)低濃度鎘（＜10μmol·L-1）在無血清和bFGF條件下，能誘導(dǎo)自噬同時(shí)抑制凋亡。由此可見，自噬的發(fā)生為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的重復(fù)利用提供了基礎(chǔ)，這也可能是鎘作為一種促細(xì)胞分裂劑，刺激細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的一種途徑。

鎘誘導(dǎo)自噬和凋亡均通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)的介導(dǎo)，Ca2+信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡的發(fā)生分別通過ERK依賴途徑和線粒體胱天蛋白酶信號(hào)通路途徑［13］。鎘能夠同時(shí)誘導(dǎo)自噬和凋亡的發(fā)生，最終介導(dǎo)腎細(xì)胞死亡，表明自噬是通過Ca2+-ERK及ROS-糖原合酶激酶3β兩條途徑所介導(dǎo)［14-15］。本研究顯示，抑制細(xì)胞自噬后，凋亡增強(qiáng)，提示自噬的發(fā)生可能抑制凋亡，在細(xì)胞凋亡前期，自噬的發(fā)生可能是細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。盡管如此，細(xì)胞自噬和凋亡的具體關(guān)系仍然撲朔迷離，因?yàn)樵诩?xì)胞自噬和凋亡的信號(hào)通路中存在著眾多的交叉和重疊。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將重點(diǎn)探究細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系以及各信號(hào)蛋白在細(xì)胞自噬中的作用。以便通過促進(jìn)或抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，為某些疾病的預(yù)測(cè)和預(yù)防提供一定理論基礎(chǔ)。

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CdCl2induces autophagy and apoptosis in HEK293 cells

LIU Xuan-xuan2，WANGWen-qian2，MAO Wei-ping1
（1.Laboratory of Molecular and MedicalBiotechnology，Nanjing NormalUniversity，Nanjing 210023，China；2.DepartmentofPhysiology，Kangda College ofNanjing MedicalUniversity，Lianyungang 222000，China）

OBJECTIVE To evaluate the possibility that CdCl2induces autophagy and apoptosis in HEK293 cells，and the role of extracellular regulated protein kinases（ERK1/2）and AKT proteins in autophagy.METHODS Green fluorescence protein（GFP）-lightchain 3B（LC3B）expression plasmid was transfected into HEK293 cells.After 24 h，HEK293 cells were induced with CdCl22，4，8 and 10μmol·L-1for 12 h.The expression of GFP-LC3B was detected by fluorescent microscopy.HEK293 cells were induced with CdCl22，4，8 and 10μmol·L-1withouttransfection of GFP-LC3B for 12 h while autophagic vacuoles were observed by transmission electron microscopy.The expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰproteins and the phosphorylation levels of ERK1/2 and AKT were analyzed by Western blotting.Apoptosis was detected by flow cytometry microscopy.HEK293 cells were treated with 3-MA 20μmol·L-1+CdCl210μmol·L-1for 12 h before cleaved caspase 3 protein was detected by Western blotting.RESULTS When HEK293 cells were exposed to CdCl2（≤10μmol·L-1）for 12 h，cytoplasmic GFP-LC3B punctuates were observed under the fluorescence microscope，and autophagic vacuoles were observed under an electron microscope.The expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰ，p-ERK1/2 and p-AKT proteins was significantly increased in CdCl2-induced cells（P＜0.05，P＜0.01）.Moreover，apoptosis was observed.The addition of 3-MA 20μmol·L-1+CdCl210μmol·L-1enhanced apoptosis.Cleaved capase 3 protein expression was significantly increased（P＜0.01）.CONCLUSION CdCl2（≤10μmol·L-1）can induce autophagy in HEK293 cells.ERK1/2 and AKT proteins mightbe associated with the activation ofautophagy thatis accompanied by apoptosis，suggesting thatautophagy can inhibitapoptosis atcertain concentrations ofCdCl2.

cadmium；HEK293 cells；autophagy；apoptosis

E-mail：maoweiping@njnu.edu.cn，Tel：（0518）80689625

R995

A

1000-3002-（2016）05-0569-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.05.014

2015-05-08接受日期：2016-05-10）

（本文編輯：賀云霞）

劉宣宣，女，理學(xué)碩士，助教，主要從事重金屬鎘致細(xì)胞自噬與凋亡的研究。

毛偉平，E-mail:maoweiping@njnu.edu.cn.Tel:（0518）80689625