不同培養(yǎng)條件對(duì)金釵石斛懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

牛曉娟，林夢(mèng)瑩，楊德彩，張宇斌

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

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不同培養(yǎng)條件對(duì)金釵石斛懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

牛曉娟，林夢(mèng)瑩，楊德彩，張宇斌*

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

研究了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)金釵石斛液體懸浮培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，在培養(yǎng)條件分別為培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)天數(shù)為30d、初始pH為6、搖床轉(zhuǎn)速為120r/min時(shí)，金釵石斛原球莖增殖量最大，石斛堿的積累量也相對(duì)最高。

金釵石斛；懸浮培養(yǎng)；培養(yǎng)條件；增殖；生物堿

石斛屬是蘭科植物中較大的屬，全世界約有1 100種，廣泛分布于亞洲、歐洲和大洋洲等地。目前供作藥用的石斛屬植物約有30多種。石斛的主要化學(xué)成分是生物堿、多糖、氨基酸、酚類、萜類、甾體及揮發(fā)油等[1]。在我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，石斛為常用貴重藥材，藥用歷史悠久，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳等功效[2，3]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，石斛還具有降血糖[4]、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力和擴(kuò)張血管等作用[5，6]，石斛的藥理與其所含有的石斛堿密切關(guān)聯(lián)。

金釵石斛作為貴州省四大主要中藥材之一，其資源的再生產(chǎn)對(duì)于我省中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用成分可以在人工條件下進(jìn)行，通過操作培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式能極大地提高生產(chǎn)率，在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的目標(biāo)產(chǎn)物，既節(jié)省耕地，又解決了原料來源；既保護(hù)了生物多樣性，又可實(shí)現(xiàn)我國(guó)中藥資源的保護(hù)和中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

本研究以金釵石斛為材料，對(duì)其在懸浮培養(yǎng)方面應(yīng)用生物技術(shù)手段生產(chǎn)石斛堿有用次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行探討，得出適合石斛堿懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和石斛堿積累的較佳搖瓶培養(yǎng)工藝條件，旨在對(duì)發(fā)酵罐中試放大培養(yǎng)石斛生產(chǎn)石斛堿提供研究基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 供試材料

金釵石斛(DendrobiumnobileLind1)采自貴州省赤水市旺隆鎮(zhèn)的野生金釵石斛，種子為野生果實(shí)，金釵石斛莖段為經(jīng)馴化后移栽到貴州師范大學(xué)生命科學(xué)院溫室，以栽培存活2年后的莖段為外植體培養(yǎng)再生植株。

1.2 金釵石斛原球莖增殖統(tǒng)計(jì)方法

用“稱重法” 對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行稱量(單位:g), 在稱量的同時(shí)觀察記錄石斛原球莖的生長(zhǎng)狀態(tài)。增殖系數(shù)能較好地反應(yīng)原球莖的增殖狀況，增殖系數(shù)=(培養(yǎng)后重量—接種量)/接種量。

1.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

石斛懸浮培養(yǎng)過程中可以控制反應(yīng)條件，如基本培養(yǎng)基、激素種類[7，8]和濃度、培養(yǎng)條件等來達(dá)到最優(yōu)懸浮培養(yǎng)條件。本實(shí)驗(yàn)通過控制懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)天數(shù)、搖床轉(zhuǎn)速、搖床的溫度、初始pH等條件，以增重量和石斛堿含量為衡量指標(biāo)篩選最優(yōu)液體懸浮培養(yǎng)條件。

1.4 生物堿的測(cè)定

石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以石斛堿濃度為橫坐標(biāo)，620nm處吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品總生物堿含量測(cè)定：精密稱取上述各石斛樣品粉末0.5g，加濃氨水適量，加氯仿10mL，60℃回流提取2h，冷卻后補(bǔ)充氯仿至原重，抽濾得到生物堿提取液[9]。按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總生物堿的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)金釵石斛懸浮培養(yǎng)的影響

用“稱重法”對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行稱量(單位:g), 在稱量的同時(shí)觀察記錄石斛原球莖的生長(zhǎng)狀態(tài)。增殖系數(shù)能較好地反應(yīng)原球莖的增殖狀況，增殖系數(shù)=(培養(yǎng)后重量—接種量)/接種量。

選取相同條件下生長(zhǎng)良好的原球莖，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，控制懸浮培養(yǎng)溫度，分別設(shè)定為22℃、25℃、28℃、31℃ 4個(gè)溫度梯度，分別于懸浮培養(yǎng)第10d、20d、30d、35d、40d，取樣稱重，計(jì)算增殖系數(shù)，并對(duì)相應(yīng)生物堿含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 不同發(fā)酵天數(shù)、發(fā)酵溫度對(duì)石斛懸浮培養(yǎng)的影響Tab.1 The influence of culture temperature and cultivation time in suspension culture

從表1可知：溫度不同對(duì)石斛懸浮培養(yǎng)的影響比較顯著，31℃時(shí)，石斛的增殖系數(shù)最小，在培養(yǎng)超過20d后，增殖系數(shù)積累量逐漸下降，而生物堿積累量幾乎不變；當(dāng)溫度為25℃時(shí)，隨著發(fā)酵天數(shù)的延長(zhǎng)，石斛增殖系數(shù)增大，到培養(yǎng)30d的時(shí)候，增殖系數(shù)達(dá)到最大，為1.114，但是此溫度下生物堿的積累卻在發(fā)酵35d時(shí)達(dá)到最大，為81.78mg/L，與此溫度下培養(yǎng)30天相比差距不大，從成本考慮，選擇培養(yǎng)天數(shù)為30d為最優(yōu)，也基本可以看出，石斛原球莖增殖越多，生物堿也相對(duì)越多，基本呈正相關(guān)，在后面的培養(yǎng)中主要以石斛原球莖增殖量為衡量指標(biāo)。

2.2 初始pH對(duì)石斛懸浮培養(yǎng)石斛生物量積累的影響

選取相同條件下生長(zhǎng)良好的原球莖，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇懸浮培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)初始pH分別為5、6、7、8，培養(yǎng)天數(shù)為20d，按2.1方法稱重，計(jì)算增殖量。

表2 初始pH對(duì)石斛懸浮培養(yǎng)石斛生物量積累的影響Tab.2 The influence of initial pH in suspension culture

從表2可以看出，在同為在溫度為25℃，培養(yǎng)天數(shù)30d的情況下，初始pH對(duì)石斛懸浮培養(yǎng)影響很大，過酸或過堿都不利于石斛細(xì)胞的生長(zhǎng)，在pH為6的情況下，石斛生物量積累最快。

2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)石斛懸浮培養(yǎng)石斛生物量積累的影響

選取相同條件下生長(zhǎng)良好的原球莖，以1/2MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇懸浮培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)初始pH分別為6，培養(yǎng)天數(shù)為20d，設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速為100r/min、120r/min、140r/min、160r/min、180r/min。按2.1方法稱重，計(jì)算增殖量。

表3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)石斛懸浮培養(yǎng)生物量積累的影響Tab.3 The influence of rotation speed in suspension culture

從表3可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)速為120r/min時(shí)，石斛生長(zhǎng)最好，這與別人做其他植物懸浮培養(yǎng)選定的轉(zhuǎn)速一樣，說明植物培養(yǎng)轉(zhuǎn)速不宜過快，過快導(dǎo)致耗氧量增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損耗快。

3 結(jié)論

石斛作為珍貴藥材，藥用歷史悠久，藥用成分豐富，能治療多種疾病，石斛人工栽培技術(shù)近年來被廣泛用于生產(chǎn)石斛活性物質(zhì)。但人工栽培石斛因生產(chǎn)周期過長(zhǎng)、病害嚴(yán)重等原因而受到限制，因此，近些年來，植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)不斷被用于藥用植物生產(chǎn)，已成為目前最有潛力進(jìn)行藥用植物快速繁殖的途徑。其主要是通過外植種子(莖)體誘導(dǎo)原球莖，再進(jìn)行懸浮培養(yǎng)從而建立快速繁殖體系。由于本研究原有的研究基礎(chǔ)上已經(jīng)確定了金釵石斛懸浮培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、碳源、天然添加物等因素，故本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)金釵石斛懸浮培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明搖瓶最佳懸浮培養(yǎng)條件是：培養(yǎng)溫度為25℃、培養(yǎng)天數(shù)為30d、初始pH為6、搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。

[1] 乙引,陳玲,張習(xí)敏,等.金釵石斛研究[M].北京:電子工業(yè)出版社,2009：2-5.

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Effects of the culture conditions on cell growth in Dendrobium nobile

NIU Xiaojuan，LIN Mengying，YANG Decai，ZHANG Yubin*

(School of Life Sciences,Guizhou Normal University,Guiyang,Guizhou 550001,China)

This study investigated the culture temperature, cultivation time, initial pH, rotation speed of Suspension Cultured in Dendrobium nobile. The results showed that optimized culture conditions were initial pH 6, 25℃ of culture temperature, rotation speed at 120r/min, and 30 days of cultivation. Under those culture conditions, Dendrobium nobile could enhance the multiplication coefficient and the growth vigor of the protocorm.

Dendrobium nobile;suspension culture;culture conditions;multiplication;alkaloids

1004—5570(2016)05-0033-03

2016-08-20

貴陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(筑科合同 [2012204]42號(hào) )；貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目，黔教科(2011016)號(hào)

牛曉娟(1983-)，女，講師，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué),E-mail:252984899@qq.com.

*通訊作者：張宇斌(1978-)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物生理,E-mail:zyb123_mail@163.com.

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