液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定甘藍中4-羥基百菌清的殘留量

吳成，任海雷，趙志強，王蕾

(1.山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護和農(nóng)村能源總站，濟南 250100； 2.沂源縣農(nóng)業(yè)檢測中心，山東沂源 256100)

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定甘藍中4-羥基百菌清的殘留量

吳成1，任海雷2，趙志強1，王蕾1

(1.山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護和農(nóng)村能源總站，濟南 250100； 2.沂源縣農(nóng)業(yè)檢測中心，山東沂源 256100)

建立液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測定甘藍中4-羥基百菌清殘留的方法。以乙腈提取樣品中的4-羥基百菌清，采用電噴霧負離子源(ESI–)和多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式測定，基質(zhì)匹配標準工作曲線法定量。結(jié)果表明，甘藍中4-羥基百菌清的質(zhì)量濃度與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.999)，線性范圍為1.0～100 μg／L，方法檢出限為0.31 μg／kg，定量限為1.0 μg／kg。在5，10，50 μg／kg 3個添加水平下，方法的回收率為88.0%～91.4%，測定結(jié)果的相對標準偏差為4.6%～7.2%(n=6)。該法簡單、準確、快速、靈敏，符合法規(guī)殘留限量監(jiān)測要求。

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法；4-羥基百菌清；甘藍

百菌清是一種廣譜高效保護性殺菌劑，主要用于防治蔬菜、大田作物和果樹真菌病害［1–3］。4-羥基百菌清是百菌清主要降解產(chǎn)物，其毒性比百菌清強，對人類健康影響比百菌清重［4–8］。美國、加拿大、澳大利亞和國際食品法典委員會(CAC)等農(nóng)藥殘留限量標準中百菌清殘留定義為百菌清及4-羥基百菌清之和，以百菌清計［9–12］。目前，文獻報道的4-羥基百菌清檢測方法有高效液相色譜法(帶紫外檢測器)［13–14］和甲基化–氣相色譜法(帶電子捕獲檢測器)［15–16］，這些方法操作繁瑣,易受干擾,靈敏度低。甘藍是百菌清用藥較多的蔬菜，筆者用液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法(LC–MS／MS)測定甘藍中4-羥基百菌清殘留量，該方法簡單、準確、快速、靈敏，符合法規(guī)殘留限量監(jiān)測要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：LCMS–8040型，配電噴霧離子源(ESI)，日本Shimadzu公司；

離心機：LDZ5–2型，北京京立離心機公司；食品加工機：k600型，荷蘭Philips公司；均質(zhì)器：T18型，德國IKA公司；

天平(1)：JY2001型，感量為0.1 g，上海精密儀器公司；

天平(2)：BT25 s型，感量為0.01 mg，德國賽多利斯公司；

4-羥基百菌清標準品：純度不小于98%，加拿大TRC公司；

乙腈和甲醇：色譜純，德國Merck公司；

甲酸、乙酸銨和氯化鈉：分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；

甘藍：市售，用本實驗方法檢測確保為無4-羥基百菌清殘留的空白樣品；

實驗用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 標準溶液配制

用天平(1)準確稱取100.00 mg的4-羥基百菌清標準品，用甲醇逐級稀釋配制成100 mg／L的標準儲備液，置于–20.0℃冰箱保存，使用時用甲醇水(1+1)稀釋至所需濃度。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜

色譜柱：Shim-pack XR–ODSⅢ柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm，日本Shimadzu公司)；柱溫：40℃；流動相：甲醇–0.1%甲酸水溶液(體積比為75∶25，含5 mmol／L乙酸銨)；流量：0.4 mL／min；等度洗脫；進樣體積：1 μL；信號采集時間：13.0 min。

1.3.2 質(zhì)譜

電噴霧正離子源(ESI+)接口電壓：4.5 kV；電噴霧負離子源(ESI–)接口電壓：–3.5 kV；霧化氣：氮氣，流量為3.0 L／min；干燥氣：氮氣，流量為15.0 L／min；碰撞氣：氬氣，壓力為230 kPa；脫溶劑管溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；駐留時間：10 ms；延遲時間：3 ms；監(jiān)測離子對質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 4-羥基百菌清監(jiān)測離子對及質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品處理

按GB／T 8855–2008 《新鮮水果和蔬菜取樣方法》 抽取甘藍樣品，取可食部分［17］，縮分、切碎、混勻，放入食品加工機中粉碎，制成待測樣，置于–20.0℃冰箱保存。用天平(2)稱取樣品15.0 g于50 mL具塞離心管，加入30.0 mL乙腈，用均質(zhì)器以12 000 r／min均質(zhì)2 min，加入5.0 g氯化鈉，劇烈振搖2 min，以5 000 r／min離心5 min，取上清液1.5 mL過0.22 μm有機濾膜，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

乙腈是蔬菜、水果農(nóng)藥多殘留標準分析方法的首選提取溶劑［18–19］，乙腈與水部分互溶，加入氯化鈉后，鹽析、分層和除雜效果明顯，因此實驗選取乙腈作甘藍中4-羥基百菌清的提取溶劑。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別采用ESI+和ESI–模式掃描4-羥基百菌清母離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于母離子掃描信號強度，ESI–模式遠高于ESI+模式；ESI–模式下，4-羥基百菌清減氫峰離子信號較強且穩(wěn)定，以相應(yīng)離子作母離子，利用島津LCMS–8040 Optimizer軟件對子離子、四極桿預(yù)桿偏置電壓(Q1和Q3)、碰撞電壓(CE)等參數(shù)進行優(yōu)化，優(yōu)化的MRM參數(shù)見表1。

用優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件，在MRM模式下，進0.1 mg／L 4-羥基百菌清標液1.0 μL，得監(jiān)測離子對提取離子流圖見圖1。計算定性參考離子與定量離子信號強度比(相對離子強度，為43.6%)。依據(jù)歐盟2002／657|EC 文件［20］規(guī)定的質(zhì)譜技術(shù)中相對離子強度的最大允許限度范圍，結(jié)合樣品色譜峰保留時間和扣背景質(zhì)譜圖，可確證樣品中4-羥基百菌清的存在。

圖1 4-羥基百菌清監(jiān)測離子對提取離子流圖

2.3 凈化條件的選擇

甘藍的乙腈提取液色素含量低，若用傳統(tǒng)固相萃取柱凈化，則效率低，操作繁瑣。樣品前處理采取鹽析、乙腈提取、離心和過有機濾膜，能有效去除樣品提取溶液中的色素。并且當(dāng)前LC–MS／MS儀器結(jié)構(gòu)性能得到改進，抗基質(zhì)干擾能力強，清洗方便。另外，4-羥基百菌清為弱極性化合物，雜質(zhì)對其電噴霧離子化影響較小，樣品基質(zhì)對分析物測定的干擾可忽略不計。本實驗樣品前處理方法,操作簡單,回收率高、快速和經(jīng)濟，特適合大批量樣品農(nóng)藥多殘留檢測，是農(nóng)業(yè)部蔬菜質(zhì)量安全農(nóng)藥殘留例行監(jiān)測和風(fēng)險評估推薦的LC–MS／MS樣品前處理方法。

2.4 方法的特異性

用LC–MS／MS檢測4-羥基百菌清，選取信號響應(yīng)值高，特異性強的離子進行監(jiān)測，輔之色譜分離，基質(zhì)干擾已減至最低，可忽略不計。4-羥基百菌清純?nèi)軇藰优c基質(zhì)標樣，不含干擾離子對，對方法的特異性無影響。

2.5 線性范圍及定量限

用甘藍空白基質(zhì)液配制4-羥基百菌清1～100 μg／L系列標準工作溶液，在1.3儀器工作條件下測定4-羥基百菌清。以被測組分的色譜峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x，μg／L)作標準工作曲線，分別以3倍和10倍信噪比(S／N)計算方法檢出限和定量限，結(jié)果見表2。由表2可知，4-羥基百菌清的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系(r=0.999)，方法檢出限為0.31 μg／kg，定量限為1.0 μg／kg。說明該方法檢測靈敏度符合殘留檢測方法的要求［21］。

表2 線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 精密度試驗

在甘藍空白樣品中添加3個水平的4-羥基百菌清標準溶液5,10,50 μg／kg，在1.3儀器工作條件下，每個水平重復(fù)6次，結(jié)果列于表3。由表3可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為4.6%～7.2%，說明該方法精密度符合食品中農(nóng)藥殘留分析要求［21］。

表3 精密度試驗結(jié)果(n=6)

2.7 回收試驗

在甘藍空白樣品中添加3個水平的4-羥基百菌清標準溶液5,10,50 μg／kg，進行加標回收試驗，結(jié)果見表4。由表4可知，甘藍中4-羥基百菌清3個水平添加平均回收率為88.0%～91.4%，說明該方法的加標回收率符合食品中農(nóng)藥殘留分析要求［21］。

表4 加標回收試驗結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語

以乙腈作提取劑，經(jīng)液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法分析，建立了甘藍中4-羥基百菌清殘留的檢測方法。該方法簡單、快速、靈敏度高，確證性和實用性強，可作為甘藍中4-羥基百菌清殘留的確證定性和定量檢測。

［1］ 吳祥為. 百菌清重復(fù)施用在土壤中的殘留特征及其土壤生態(tài)效應(yīng)［D］. 杭州：浙江大學(xué)，2014.

［2］ 湯宇戀. 百菌清和毒死蜱在設(shè)施作物中的分布與消解研究［D］.杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2011.

［3］ 黃慧俐. 幾種農(nóng)藥在綠葉類和番茄類作物上的殘留消解規(guī)律及殘留量外推法研究［D］. 南寧：廣西大學(xué)，2015.

［4］ Chao Meng, Qin He, Junwei Huang, et al. Degradation of chlorothalonil through a hydrolytic dehalogenase secreted from Bacillus subtilis WB800［J］. International Biodeterioration & Biodegradation, 2015，104: 97–104.

［5］ Malay Chaudhuri, Hafizi Zuhali, Augustine Chioma Affam. Degradation of pesticide chlorothalonil by visible light–responsive photocatalyst ferrioxalate and H2O2under solar irradiation［J］. International Journal of Photoenergy, 2013，2013(2): 101–107.

［6］ Augustine Chioma Affam, Malay Chaudhuri. Degradation of pesticides chlorpyrifos, cypermethrin and chlorothalonil in aqueous solution by TiO2photocatalysis［J］. Journal of Environmental Management, 2013，130: 160–165.

［7］ 李瑛，李學(xué)德，花日茂，等. 百菌清的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)及降解轉(zhuǎn)化研究進展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33(4): 703–704.

［8］ Putnam R A, Nelson J O, Clark J M. The persistence and degradation of chlorothaonil and chlorpyrifos in a cranberry bog［J］. J. Agric Food Chem, 2003，51(1): 170–176.

［9］ EPA–738–F–99–008 EPA R.E.D. FACTS Chlorothaonil［S／OL］. ［2016–04–16］. https://www3.epa.gov/pesticides/chem_ search/reg_actions/reregistration/fs_PC–081901_1–Apr–99.pdf.

［10］ Proposed Maximum Residue Limit PMRL2014–10, Chlorothalonil［S／OL］. ［2016–09–13］. http://www.hc–sc.gc.ca/cps-spc/pest/ part/consultations/_pmrl2014–10/pmrl2014–10–eng.php.

［11］ Agricultural and Veterinary Chemicals Code Instrument No.4 (MRL Standard) 2012［S／OL］. ［2016–04–16］. https://www. legislation.gov.au/Details/F2014C01255.

［12］ CODEX Alimentarius: Pesticide Detail［S／OL］. ［2016–04–16］. http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/standards/pestres/ pesticide-detail/en/?p_id=81.

［13］ 紀淑娟，郭乃菲，齊小輝，等. 高效液相色譜法檢測蔬菜中百菌清及其代謝產(chǎn)物的方法研究［J］. 食品工業(yè)科技，2011，32(7): 397–399.

［14］ Kazos E A, Nanos C G, Stalikas C D, et al. Simultaneous determination of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxychlorothalonil in greenhouse air: dissipation process of chlorothalonil［J］. Chemosphere，2008，72(10): 1 413–1 419.

［15］ Doorn C V, Vink M, Poll J M V D. Gas chromatographicdetermination of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxy-2，5，6-trichloroisophtalonitrile (HTI) in water［J］. Chromatographia, 1995，40(7–8): 458–462.

［16］ Irani Mukherjee, Madhuban Gopal. Methodology for the estimation of chlorothalonil and its metabolite in mustard crop by gas liquid chromatography［J］. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, 1995，351(6): 590–591.

［17］ GB／T 8855–2008 新鮮水果和蔬菜取樣方法［S］.

［18］ GB/T 20769-2008 水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定 液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

［19］ AOAC Official Method 2007.01 Pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate［S／OL］. http://www.doc88.com/p–739755759078.html.

［20］ European Communities. Implementing Council Directive 96／23／EC, Concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results［J］. Official Journal of the European Communities, 2002，(L221): 8–36.

［21］ GB／T 27404–2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測［S］.

Determination of 4-Hydroxychlorothalonil Residues in Cabbage by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry

Wu Cheng1， Ren Hailei2， Zhao Zhiqiang1， Wang Lei1
(1. Shandong Station of Agro-environment Protection and Rural Energy， Jinan 250100， China；2. Yiyuan Agricultural Inspection and Testing Center， Yiyuan 256100， China)

The method for determination of 4-hydroxychlorothalonil residue in cabbage by liquid chromatography–tandem mass spectrometry was established. The sample was extracted with acetonitrile, electrospray negative ion source(ESI–), multiple reaction monitoring mode (MRM), matrix–matched and standard curve method were applied to samples analysis. The results showed that there was the good linear relationship(r=0.999) between chromatographic peak area and mass concentration of 4-hydroxychlorothalonil residue in cabbage, the linear range was 1.0–100 μg／L, the detection limit was 0.31 μg／kg，the quantification limit was 1.0 μg／kg. The method validation was carried out at 5,10,50 μg／kg, the recoveries were from 88.0% to 91.4%, and the relative standard deviations of determination results were from 4.6% to 7.2%(n=6). The methods is simple, accurate, rapid, sensitive and suitable for monitoring the maximum residue limit of 4-hydroxychlorothalonil in cabbage.

liquid chromatography–tandem mass spectrometry; 4-hydroxychlorothalonil; cabbage

O657.63

A

1008–6145(2016)06–0071-04

10.3969／j.issn.1008–6145.2016.06.017

聯(lián)系人：吳成；E-mail: wucheng7745@sina.com

2016–09–21