遼育白牛MSTN基因分子克隆及序列分析

王嬌嬌,張世偉,張麗君,王澤英,羅光彬,白文林

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧 沈陽 110886; 2.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站,遼寧 沈陽 110032)

遼育白牛MSTN基因分子克隆及序列分析

王嬌嬌1,張世偉2?,張麗君2,王澤英1,羅光彬1,白文林1

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧 沈陽 110886; 2.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站,遼寧 沈陽 110032)

肌肉生長抑制素(簡稱MSTN)是肌肉發(fā)育負調控因子,為了實現(xiàn)將來對遼育白牛的分子育種,本試驗對MSTN分子特征及其靶MicroRNA進行了分析。以遼育白牛為研究對象,利用分子生物學技術,設計特定引物對遼育白牛MSTN基因的編碼區(qū)和調控區(qū)分段PCR擴增,并進行克隆和測序。借助生物信息學分析軟件,尋找各個區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(SNP)并分析了MSTN基因分子特征、組織表達譜以及3'非翻譯區(qū)靶標m iRNA。試驗表明, MSTN基因5′調控區(qū)SNPs使啟動子位置和轉錄因子結合情況發(fā)生變化,但編碼區(qū)的突變未造成氨基酸改變。遼育白牛MSTN編碼區(qū)序列全長為1 128 bp,編碼375個氨基酸,該蛋白存在信號肽序列,為分泌性蛋白,疏水性較弱且不穩(wěn)定。遼育白牛MSTN基因在不同組織中具有表達差異性,且肌肉中表達量最高。3′UTR存在肌肉生長發(fā)育功能miRNA,且比較保守。為開展遼育白牛分子育種研究奠定理論基礎。

遼育白牛;MSTN基因;MicroRNA;單核苷酸多態(tài)性

遼育白牛是遼寧省新培育出來的肉牛新品種,其生長性狀具有一定的優(yōu)勢和典型性,由于初培育目前對遼育白牛的深入研究現(xiàn)在還非常少,要想讓該種群擴大并保持生長性狀的優(yōu)越性,僅用傳統(tǒng)的育種手段,其遺傳進展無疑是緩慢的,效果也是不理想的。借助先進的分子育種技術手段找尋遼育白牛重要經(jīng)濟性狀的主基因或與之連鎖的分子標記,是提高我國遼育白牛生產(chǎn)水平,尤其是產(chǎn)肉和肉品質性狀的一條有效途徑［1]。

根據(jù)目前研究,國內(nèi)外關于肌肉生長發(fā)育和肉質性狀的研究方法有很多,一般采用定位影響肉質的主效基因的方法來實現(xiàn),所涉及的主要調節(jié)肌肉生長發(fā)育因素有如下幾種:肌肉生長抑制素、瘦蛋白基因、鈣素基因、生肌調節(jié)因子MyoG基因［2]、腎上腺髓質基因、腺苷酸環(huán)化酶2型基因［3]、胰島素樣生長因子［4]。

肌肉生長抑制素(簡稱MSTN),又稱GDF-8,是TGF-β(transforming growth factor beta,轉化生長因子β)超家族成員。MSTN在骨骼肌中廣泛表達,是功能比較專一的肌肉發(fā)育負調控因子,在控制骨骼肌生長發(fā)育與分化上起著非常重要的作用。MSTN基因實現(xiàn)對肌細胞生長發(fā)育的負向調控的原理,是通過抑制成肌細胞的分化抗體家族成員的轉錄活性來實現(xiàn)的,肌肉重量大小的變化表現(xiàn)為與MSTN基因的表達量呈顯著的負相關性［5]。已有最新報道表明,在不同的家畜動物中,可以使MSTN基因失活,從而導致肌肉增大重量增加現(xiàn)象［6]。肌肉生長抑制素基因的研究一直是近年來國內(nèi)外分子遺傳領域的研究熱點之一,并已取得顯著成果。

MicroRNA是一類進化上高度保守的非編碼的單鏈內(nèi)源性小分子R N A［7]。目前,大約有3 000種MicroRNA已經(jīng)被鑒定出來［8]。目前,已經(jīng)被證實,在肌肉發(fā)育和肌肉細胞增殖和分化過程中MicroRNA具有重要的調節(jié)作用［9]。

1 材料與方法

1.1 血液與肌肉組織樣品試驗以遼寧省培育的新品種——遼育白牛為研究對象進行多次采樣分析。樣品分別由遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站聯(lián)系大連雪龍集團公司與遼寧綠源肉業(yè)有限公司提供。在大連雪龍集團公司,利用加有抗凝劑EDTAK2的采集管對20頭遼育白牛靜脈采血,將采集的樣品低溫保存,帶回實驗室-70℃冰箱中保存?zhèn)溆?。在遼寧綠源肉業(yè)有限公司所屬的屠宰場采集平均年齡約為5歲的遼育白牛肋脊部肌肉組織,以及心、肝、脾、肺、腎、翠丸、附翠組織,用提前經(jīng)過滅菌的鑷子和手術刀片分別取100 g并切成小塊分裝,裝在紗布袋里,拴好并在繩上粘上標簽,立即放入液氮罐中冷凍備用。

1.2 試劑蛋白酶K(proteinase K)、Taq DNA聚合酶、5×SDS PAGE蛋白上樣緩沖液、DEPC、dNTPs、6×Buffer、DL 2000 DNA Marker、RNA simple總RNA提取試劑盒、血液DNA提取試劑盒、RT-PCR反轉錄試劑盒、PCR試劑2×Taq PCR Master Mix、β Actin抗體等,購自天跟生物有限公司和大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物設計及合成參考Gen Bank上公布的牛MSTN序列(登錄號為NM_001001 525.2),使用Primer 5.0和Olio 6軟件分別對基因的5′調控區(qū),CDS和3′-UTR設計特異引物,由上海生工合成引物。5M1和5M2擴增5′調控區(qū)(位于編碼區(qū)上游長約1 240 bp), 5M1,F:5 CTAAGGTTGAGAGTTTGA 3,R:5 TCTTTTGCTTTTGAGTAA 3,長度1 226 bp,退火溫度51.0℃;5M2,F:5 AGACCTTACCCCAAATCCC 3,R: 5 AGACAACTTGCCACACCAG 3,長度 1 101 bp,退火溫度61.0℃。M1、M2、M3擴增編碼區(qū)(1～1 128 b p), M1,F:5 TTGGCTTGGCGTTACTCA 3,R:5 CCATCTTCTCCTGGTTCT 3,長度826 bp,退火溫度57.4℃;M2,F:5 TTGGGCTTGATTGTGAT 3,R:5 GAATGGTAACCTGCGTAT 3,長度846 bp,退火溫度55.0℃;M3,F:5 CCACAAAGTAGGGAT 3,R:5 CATTGGATGTAAGAA 3,長度977 bp,退火溫度46.4℃。3M1、3M2、3M3擴增3′調控區(qū)(位于編碼區(qū)下游長約1 058 bp),3M1,F:5 GTAGATCGCTGTGGGTGT 3,R:5 CCATAGGGAGGAGTGTGA 3,長度700 bp,退火溫度54.2℃;3M2,F:5 AGGTCTTCCCCTCAACAA 3,R:5 CAGCCATTCAGCCTATTG 3,長度552 bp,退火溫度53.4℃;3M3,F:5 AGGACATAAAAGCAAAAG 3,R:5 TACAATGACAGTAAACCA 3,長度194 bp,退火溫度48.5℃。

1.4 基因組DNA及總RNA的提取及檢測按照血液基因組DNA提取試劑盒(天根)提取基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DN A純度,紫外分光光度計測定DNA濃度,采用RNA simple總RNA提取試劑盒(天根),對遼育白牛肌肉及心、肝、脾、肺、腎、翠丸、附翠八種組織的總RNA進行提取,并用0.8%的甲醛的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 產(chǎn)物擴增與序列鑒定本試驗采用設計的上、下游特異引物,分別在各自最適退火溫度條件下獲得MSTN基因各個區(qū)段目的片段。編碼區(qū)的引物M1、M2、M3對基因擴增時,采用的模板是遼育白牛各組織中提取的RNA反轉錄后獲得的cDNA。用MSTN基因的5′調控區(qū)和3′-U T R區(qū)域的基因引物進行基因擴增時,需要對10頭遼育白牛種公牛血樣提取的DNA分別進行擴增。然后根據(jù)巢式PCR方法,將檢測后成功獲得的MSTN基因的5′調控區(qū)和3′-UTR區(qū)域基因擴增產(chǎn)物每3管混在一起,將所有成功獲得的MSTN基因擴增產(chǎn)物進行測序。目的序列與GenBank中相應基因序列比對分析,確定基因的序列結構。利用DNAStar,DNAMAN 4.0,BLAST等軟件與GenBank中序列進行比較分析。利用數(shù)據(jù)庫和在線軟件分別分析5′端非翻譯區(qū)序列、預測TATAbox、轉錄因子結合位點、預測CpG島、預測蛋白結構及功能位點、預測3′端非翻譯區(qū)序列靶標MicroRNA。

圖1 MSTN基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of MSTN gene

圖2 MSTN基因中SNP的峰圖Fig.2 Peak profile of SNPs in MSTN gene

2 結果與分析

2.1 目的基因片段擴增與測序采用設計的上、下游特異引物,在最適退火溫度條件下獲得MSTN基因不同區(qū)段目的片段(圖1)。測序結果顯示,在5′調控區(qū)-805 bp位處發(fā)生G/C突變,編碼區(qū)571 bp位處發(fā)生A/G突變,3′-UTR區(qū)5 387 bp處發(fā)生C/T突變(圖2)。

2.2 MSTN 基因分子特征分析測序結果分析后,在MSTN基因5′調控區(qū)發(fā)現(xiàn)4個突變位點,分別是-805 bp位點G/C突變、-163 bp位點T缺失突變、-156 bp位點A插入突變、-130 bp位點A插入突變。利用Berkeley Drosophila Genome Project軟件對MSTN基因5′端的啟動子分析預測。結果顯示發(fā)生SNP突變后,在-161 bp和-137 bp位點處的兩個TATA box消失,推斷-163 bp位點的T缺失突變,-156 bp位點的A插入突變和-130 bp位點的A插入突變很有可能都是潛在的功能性突變位點。利用TFSEARCH轉錄因子結合位點預測軟件,比較發(fā)現(xiàn)發(fā)生SNPs后,導致MSTN的5′端結合的轉錄因子種類和數(shù)量都發(fā)生了變化。通過methprimer cpG島軟件查找發(fā)現(xiàn)5′調控區(qū)存在明顯的cpG Islands。

借助ORF Finder在線分析軟件,參照Kozak法則(起始密碼子符合CCA/GCCATG),對得到的遼育白牛MSTN的DNA序列進行閱讀框架的識別,發(fā)現(xiàn)MSTN基因開放閱讀框由3個外顯子組成長度分別為373、374和381 bp,編碼375個氨基酸。測序結果中發(fā)現(xiàn)在571 bp處發(fā)生A/G突變。

ExPASy-ProtParam分析結果表明其蛋白質氨基酸殘基親疏水性總和為-0.337,蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為40.48(此值大于40為不穩(wěn)定蛋白),說明遼育白牛MSTN蛋白的疏水性較弱,且不穩(wěn)定。根據(jù)Signal P4.1和Server 4.1軟件對遼育白牛MSTN基因編碼的蛋白進行信號肽預測,結果顯示遼育白牛的MSTN蛋白中存在明顯的信號肽序列。成熟鏈序列(mature chain sequence)預測在19 bp、375 bp位置處,屬分泌性蛋白,這與已有研究結果相一致。

通過ExPASy-ProtScale軟件對遼育白牛MSTN蛋白進行蛋白疏水區(qū)的預測(圖3)。從圖3可見,遼育白牛MSTN基因編碼蛋白的C端具有親水性,N端具很強疏水性,位于分子內(nèi)部;中間部分親水性和疏水性表現(xiàn)交替出現(xiàn)。從總體上講,該蛋白的親水性更強,而疏水區(qū)相對較少。

對遼育白牛MSTN蛋白序列用SOPMA進行蛋白質二級結構預測。該蛋白二級結構中由22.93%的a螺旋(h)、21.33%的伸展鏈(e)、2.93%的β轉角(t)和52.80%的隨機線圈螺旋(c)組成。氨基酸的對應序列顯示整個蛋白結構出現(xiàn)了3個大峰和2個較小峰,可見a螺旋結構出現(xiàn)的集中區(qū)域相對比較明顯。

將遼育白牛MSTN蛋白序列用SWISS MODEL軟件,進行搜索同源性高的三維結構建模模板。結果顯示,與遼育白牛MSTN蛋白同源性最高的是Transforming growth factor beta1蛋白因子(3rjr.1.B),同源性達到84%?；赥ransforming growth factor bta-1(3rjr.1.B)的三維結構,所提交的氨基酸序列構建的遼育白牛蛋白質三維結構模式(圖4),其含有多個a螺旋結構域,該三維空間結構的預測結果與二級結構的預測結果相一致。

圖3 ProScale預測遼育白牛MSTN親水性分布圖Fig.3 MSTN hydropathy profile in Liaoyu white cattle predicted by ProScale

2.3 MSTN MSTN基因組織表達譜遼育白牛MSTN蛋白不同組織部位表達見圖5,組織部位包括翠丸、心臟、肌肉、肺、肝、脾、腎、附翠,利用β actin作為參照基因,從圖可知,MSTN在心臟、肌肉和肝中的表達量相對強些,而在翠丸、脾、腎、附翠中的轉錄信號相對較弱,但在遼育白牛的肺中沒有檢測到表達信號, MSTN在肌肉中的表達信號相對最強。

2.4 MSTN基因3′-UTR-UTR靶標miRNA分析測序后通過基因序列與波峰的比對發(fā)現(xiàn),在MSTN基因3′UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了三個突變位點,分別是+5 304 bp位點A到C的突變,+5 378 bp位點C到G的突變,+5 387 bp位點C到T的突變(圖6)。

利用在線軟件查找牛的miRNA,牛的靶標miRNA庫包含687個相關miRNA,用Micro Inspector軟件將MSTN基因與牛的miRNA結合情況分析后發(fā)現(xiàn)MSTN基因的3′U TR可以結合5個miRNA(圖7)。發(fā)生突變后結合的miRNA的情況沒有發(fā)生變化,結合的miRNA詳細信息見表1。

3 討論

圖4 遼育白牛MSTN基因編碼蛋白三維空間結構預測圖Fig.4 Predictions of three-dimensional structure of protein encoded by MSTN in Liaoyu white cattle

圖5 MSTN基因在遼育白牛不同組織中的表達結果Fig.5 Results of MSTN gene expression in different tissues in Liaoyu white cattle

圖6 遼育白牛MSTN基因3′UTR測序Fig.6 Sequencing of 3′UTR in MSTN gene of Liaoyu white cattle

啟動子是基因的重要組成部分,它位于基因5′端上游,參與基因的轉錄表達。它通過與RNA聚合酶特異性作用,來對基因的轉錄水平起作用。由于啟動子在轉錄水平的功能,當5′調控區(qū)發(fā)生SNP后,可能會造成啟動子發(fā)生相應的變化。本試驗已經(jīng)得到遼育白牛MSTN基因的5′調控區(qū)發(fā)生SNP后,啟動子位置發(fā)生了明顯的變化,且原區(qū)域的TATA box消失。這表明在遼育白牛MSTN基因上存在多個潛在的啟動子區(qū)段。而在很多研究中,?；蚪M中的5′調控區(qū)或外顯子1和2附近并沒有典型的TATA框序列。轉錄結合因子在基因轉錄中具有重要的意義,它也是通過與RNA酶結合來發(fā)揮功能,影響著基因的轉錄,不同的轉錄因子,會產(chǎn)生不同的結合物,最后影響基因轉錄成不同的轉錄本,繼而影響到后續(xù)的進程［10]。本試驗通過尋找SNP前后潛在的轉錄因子潛在的結合位點的變化,功能性SNP使遼育白牛MSTN基因5′端結合的轉錄因子種類數(shù)量和結合力上都發(fā)生了改變,產(chǎn)生了不同的潛在結合位點,而這些潛在的結合因子共同作用可能會對MSTN基因的表達產(chǎn)生一定的影響。

圖7 Microlnspector分析遼育白牛MSTN基因靶標miRNA結合情況Fig.7 Microinspector analysis of miRNA binding conditions targeted by MSTN gene in Liaoyu white cattle

表1 靶標miRNA的堿基序列Table1 Base sequence of target miRNA

MSTN基因在不同物種間是十分保守的:甚至小鼠、大鼠、人、豬、雞和火雞在C-端的同源性能達到100%,而牛羊相比只有1～3個堿基的差別,斑馬魚與其他動物比同源性最差也能達到88%。遼育白牛MSTN蛋白與多個哺乳動物MSTN蛋白序列的序列一致性都在90%以上,說明了該蛋白在哺乳動物中存在顯著的相似性,因而可以認為其功能也存在保守性［11]。所以該基因在其他哺乳動物中的研究對遼育白牛的研究具有一定的借鑒意義。

MSTN在骨骼肌中廣泛表達,是功能比較專一的肌肉發(fā)育負調控因子［12]。目前有關遼育白?；虻南嚓P研究還比較少,因此本試驗將以生物信息學手段對MSTN的mRNA序列進行多物種比對并根據(jù)其保守區(qū)設計了遼育白牛MSTN基因克隆的引物,最終獲得全長為1 128 b p的遼育白牛MSTN基因cD NA序列。再通過生物信息學分析對該未知序列進行初步的確認及功能預測,為后續(xù)試驗確定初步的研究方向。

遼育白牛MSTN編碼的蛋白總體上屬于疏水性較弱、親水性較強的分泌性蛋白,這一點與其他學者研究的普通牛MSTN相一致［13],雖然疏水區(qū)相對較少,但可以推測出這些疏水區(qū)對MSTN蛋白形成重要功能結構域上發(fā)揮一定的作用。經(jīng)生物信息學分析王偉等也曾發(fā)現(xiàn)豬MSTN編碼的蛋白質在細胞外,很有可能作為信號肽［14]。

隨著動物發(fā)育時期的變化和物種的不同以及組織的不同,MSTN基因的表達也呈現(xiàn)一定差異［15]。Kim等［16]分析了新生牛不同時期MSTN基因在肌肉中的表達量逐漸發(fā)生變化。Sharma［17]研究在其他組織器官中MSTN蛋白的分布情況時,發(fā)現(xiàn)牛和綿羊心肌組織中該基因也表達。Ji等［18]發(fā)現(xiàn),除骨骼肌外,在豬的心、肝、肺、腎、腦、舌、骨髓、小腸、乳腺和脂肪組織中也都有表達。本試驗對于MSTN在不同組織中表達分析,發(fā)現(xiàn)其在遼育白牛肌肉組織中表達量相對很高,因此可以試圖通過對其調控作用實現(xiàn)對肌肉性狀的控制。MSTN基因5′端啟動子、轉錄因子、cpG島等都是都是在其轉錄水平起調控作用,可將其作為切入點實現(xiàn)對MSTN基因的表達進行調控。

4 結論

本試驗克隆遼育白牛MSTN基因,發(fā)生SNPs后,啟動子原區(qū)域兩個TATA box消失,5′端結合的轉錄因子種類和數(shù)量都發(fā)生變化,且存在明顯的cpG島。編碼區(qū)序列,全長為1 128 bp,編碼375個氨基酸, MSTN蛋白存在信號肽序列,為分泌性蛋白,疏水性較弱、不穩(wěn)定。遼育白牛不同組織部位MSTN基因具有組織部位差異性表達模式,且肌肉組織中表達信號最強。MSTN基因存在靶miRNAs,且比較保守。因此可將MSTN作為控制肌肉生長發(fā)育的候選基因,為開展遼育白牛分子育種研究奠定理論基礎。

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Liaoyu White Cattle MSTN Gene Molecular Clone And Sequence Analysis

Wang Jiaojiao1,Zhang Shiwei2*,Zhang Li jun2,Wang Zeying1, Luo Guangbin1,Bai Wenlin1
(1.College of Animal Husbandry and Veterinary,Shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110886; 2.Liaoning Animal Husbandry Economic Management Stations,Liaoning Shenyang 110032)

Myostatin(MSTN)are negative regulatory factors of muscle development,in order to achieved the molecular breeding of liao white cattle in the future,so this study analysesed the MSTN molecular characteristics and target of micrornas.In this research,Liaoyu white cattle were studied by means of molecular biological technology.By designing the specific primers,Coding regions and regulatory regions of MSTN ge0ne in Liaoyu white cattle were PCR amplified,cloned and sequenced separately.Based on the results of bioinformatics analysis software,to find SNPs in all areas,to analyze molecular characteristics of MSTN gene,expression differences in different tissues and target miRNAs of 3′-UTR.Experimental results showed that the SNPs in 5′regulatory region of MSTN gene could change the promoter position and the transcription factor binding conditions.But,the mutations in the Coding region had no effect on the protein composition.In Liaoyu white cattle,the full-length of Coding region sequences in MSTN gene was 1128 bp,with coding 375 amino acids which was the weak hydrophobic and unstable secreted protein containing signal peptide sequence.In different tissues of Liaoyu white cattle,there were expression differences for MSTN gene,and highest expression was appeared in muscle tissue.Conservative target miRNAs existed in 3′-UTR of MSTN gene.Through this research,the theoretical foundation of molecular breeding for Liaoyu white cattle can be laid.

Liaoyu white cattle;MSTN gene;MicroRNA;Single nucleotide polymorphisms(SNPs)

S823.25

B

1672-9692(2016)10-0021-07

2016-08-06

王嬌嬌(1987-),女,遼寧人,碩士,主要從事動物分子遺傳育種研究。

張世偉(1968-),男,本科,研究員級高級畜牧師,主要負責牛良種繁育體系建設及技術推廣等工作。