BD在奈瑟腦膜炎雙球菌傳代培養(yǎng)中的比較研究

馮君平++謝澎++孫一枚++陳作江++楊明++李國(guó)晏

摘要：目的 探索A群C群腦膜炎球菌多糖疫苗生產(chǎn)中奈瑟腦膜炎雙球菌傳代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。方法 用BD代替酸水解酪蛋白制備相應(yīng)的培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)4～5 h，以收獲菌體量來(lái)確定較好培養(yǎng)基配比。結(jié)果 BD用于A群C群奈瑟腦膜炎菌培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)高，能穩(wěn)定提高奈瑟腦膜炎雙球菌的產(chǎn)量。結(jié)論 BD可作為A群C群奈瑟腦膜炎雙球菌培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：BD；奈瑟腦膜炎雙球菌；培養(yǎng)菌數(shù)

The Study about BD in the Medium of Neisseria Menigitids

FENG Jun-ping， XIE Peng，SUN Yi-mei，CHEN Zuo-jiang YANG Ming， LI Guo-yan

（Lanzhou Institute of Biological Products Co.，Ltd ， Center for Gansu Provincial Vaccine Engineering Research，Lanzhou730046，Gansu，China）

Abstract：Objective To explore the optimal medium for culture of the meningococas polysaccharide vaccine.Methods The caseinic acid of BD medium was changed， The Neisseria meningitids was cultived for four-five hours. And the bactertrial to determine the best formulation of the medium was harvested .Results The caseinic acid of BD medium have the advantages of good culture. Conclusion The caseinic acid of BD medium is one of good formulation mediums in cultiving Neisseria meningitids .we should exchange the chemical composition of medium with the Bacterium changed.

Key words：Caseinic acid of BD；Neisseria menigitids ； Bacterial concentration

流行性腦膜炎是由奈瑟腦膜炎雙球菌引起的急性呼吸道傳染病。該病傳染性強(qiáng)，起病急，病情發(fā)展快和病死率高等特點(diǎn)。我國(guó)在大規(guī)模疫苗接種后，大大降低流腦的發(fā)病率[1]。隨著流腦在病原方面變化[2]，須接種A+C群流腦多糖疫苗來(lái)預(yù)防流腦的流行。為了選擇培養(yǎng)腦膜炎雙球菌最適宜的培養(yǎng)基，本實(shí)驗(yàn)采用調(diào)整某些培養(yǎng)基成分來(lái)觀察細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母浸出粉（生物級(jí)）0.2%；磷酸二氫鉀（AR）0.02%；磷酸氫二鈉（AR）0.1%；氯化銨（AR）0.125%；甘氨酸（AR）0.01%；L-谷氨酸鈉（AR）0.1%；硫酸鎂（AR）0.06%；葡萄糖（AR）1%。

酸水解酪蛋白：A：法國(guó)Solabia 2.2%，批號(hào)：5042767識(shí)別碼Y120150158，有效期：2019年12月31日；B：美國(guó)BD：1.32%，批號(hào)：4195668，有效期：2019年05月；C：50%鹽酸水解酪蛋白液（自制）：1.2AN%，批號(hào)：20080309，有效期：2013年3月23日。

實(shí)驗(yàn)組：S（1）號(hào)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+酸水解酪蛋白（法國(guó)Solabia）；BD（2）號(hào)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+酸水解酪蛋白（BD）；Y（3）號(hào)培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+50%鹽酸水解酪蛋白液（自制）。

1.1.2菌種 試驗(yàn)用腦膜炎球菌的菌號(hào)：A群：CMCC 29201 （A4）菌株；C群：CMCC 29205（C11）菌株。來(lái)自中國(guó)生物制品研究院。

1.1.3反應(yīng)罐 培養(yǎng)基制備罐：型號(hào)：MPS30L Applikon 30L Holland

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基制備[3-7] 開啟全自動(dòng)配制罐，按1.1.1項(xiàng)配方制備基礎(chǔ)培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基，在適宜的配制溫度，攪拌轉(zhuǎn)速下溶解。澄清過(guò)濾分裝待用。

1.2.2菌種傳代培養(yǎng) 將A群和C群菌種開啟后，接種于10%羊血瓊脂培養(yǎng)基上，35～37℃，CO2環(huán)境培養(yǎng)12～20 h，刮取鏡檢合格菌苔接種于腦膜炎球菌多糖疫苗培養(yǎng)基擴(kuò)增8～12 h后同上法轉(zhuǎn)種于發(fā)酵罐（30 L）。

1.2.3細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)及濃度的測(cè)定和形態(tài)觀察 培養(yǎng)中取樣測(cè)定細(xì)菌濃度及革蘭染色顯微鏡觀察，了解細(xì)菌生長(zhǎng)情況，并適時(shí)調(diào)整各項(xiàng)參數(shù)。

2結(jié)果

按照流腦深層培養(yǎng)工藝培養(yǎng)[8]：

2.1不同配方培養(yǎng)基中培養(yǎng)基滲透壓比較 從表1可見，在A群和C群的培養(yǎng)基中，配方1的滲透壓高于配方3的滲透壓，配方2的滲透壓不高于前兩者，同種配方培養(yǎng)基滲透壓基本相同。

2.2不同配方培養(yǎng)基中細(xì)菌復(fù)蘇生長(zhǎng)情況 從表2可見，按同一濃度接種，在相同的培養(yǎng)條件下：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，配方3培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量增加緩慢；而配方1和配方2培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量迅速增長(zhǎng)，配方2的細(xì)菌數(shù)增長(zhǎng)速度快于配方1；提示配方2更有利于A群和C群腦膜炎球菌細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 不同工藝下細(xì)菌復(fù)蘇情況比較 從表3中表明：在A群或C群的培養(yǎng)中，（BD）酸水解酪蛋白培養(yǎng)基采用高壓滅菌或除菌過(guò)濾兩種工藝中差異不明顯，都能用于培養(yǎng)基制備。復(fù)蘇該菌時(shí)除菌過(guò)濾的成功率略高于高壓滅菌，P<0.05。說(shuō)明除菌過(guò)濾后的培養(yǎng)基成分較能有效的復(fù)蘇腦膜炎球菌。

2.5培養(yǎng)基成分中氨基氮與氯化鈉的比較。

3討論

在進(jìn)行微生物的培養(yǎng)中，適宜的培養(yǎng)基成分，能有效的提供細(xì)菌生長(zhǎng)所需的碳源，氮源等營(yíng)養(yǎng)。奈瑟腦膜炎球菌多糖疫苗原液體培養(yǎng)基是經(jīng)典的配方，但隨著細(xì)菌傳代次數(shù)的增多及一些理化性狀的變化，原配方有時(shí)不能適應(yīng)新的培養(yǎng)。這次研究表明流腦的培養(yǎng)基成分中改良的酸水解酪蛋白（BD）能為細(xì)菌提供蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸、充足的游離氨基酸、維生素B族及生長(zhǎng)因子等，這些成分有利于細(xì)菌傳代生長(zhǎng)發(fā)育。這種試驗(yàn)既有利于提高培養(yǎng)基質(zhì)量又有利于培養(yǎng)基的商品化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡緒敬，流腦流行的檢測(cè)與預(yù)防[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，2004，20（5）：638-640.

[2]衛(wèi)生部.2006年全國(guó)法定傳染病疫情.[EB/OL]衛(wèi)生部，中華人民共和國(guó).http：//www.chinadcn.net.cn/c272442/n272530/n272757.16423.html.

[3]陳天壽，主編.微生物培養(yǎng)基制造與應(yīng)用[M].第1版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1995.

[4]紀(jì)紹梅，主編.微生物培養(yǎng)基質(zhì)控與圖解[M].第1版.北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[5]李國(guó)宴，孫一枚，楊勇，等.腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)結(jié)果與培養(yǎng)基質(zhì)量指標(biāo)的關(guān)系研究[C].第十次全國(guó)生物制品學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，2009：119-122.

[6]楊建勇，劉梅影，林云，等.W135群腦膜炎球菌發(fā)酵工藝的研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2005，33（30：19-24.

[7]李國(guó)宴，孫一枚，吳衛(wèi)堅(jiān)，等.腦膜炎球菌多糖疫苗培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)化研究[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2012，40（2）：26-29.

[8]中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)編.中國(guó)生物制品規(guī)程2000版[S].化學(xué)工業(yè)出版社，2000：249-250.

編輯/孫杰