食管鱗癌細(xì)胞中ESCCAL_1對蛋白激酶磷酸化的調(diào)節(jié)作用

曹新廣 崔淵博 陳小兵 曹巍

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 普外科 河南 鄭州 450000； 2.鄭州市中心醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 河南 鄭州 450000)

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食管鱗癌細(xì)胞中ESCCAL_1對蛋白激酶磷酸化的調(diào)節(jié)作用

曹新廣1崔淵博2陳小兵1曹巍2

(1.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 普外科 河南 鄭州 450000； 2.鄭州市中心醫(yī)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 河南 鄭州 450000)

目的 探討ESCCAL_1在食管鱗癌中發(fā)揮功能的可能機制。方法 使用人磷酸化激酶陣列試劑盒檢測ESCCAL_1敲減前后EC9706細(xì)胞中相關(guān)蛋白激酶磷酸化水平，對各蛋白條帶進行灰度值定量分析。結(jié)果 KD組與NC組中FAK、JNK1、Src、AMPKα1等蛋白激酶的相對磷酸化水平比值分別為2.76∶1、2.20∶1、2.15∶1、2.01∶1，表達量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 ESCCAL_1可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白激酶的磷酸化水平調(diào)控EC9706細(xì)胞生長。

食管鱗狀細(xì)胞癌；ESCCAL_1；蛋白激酶磷酸化

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA，基因組中80%的轉(zhuǎn)錄本為LncRNA[1]。目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與了生命進程中一系列重要的生命活動，包括發(fā)育、造血、器官形成、凋亡、細(xì)胞增殖及腫瘤形成等[2]。前期研究中我們采用高通量篩查技術(shù)在食管鱗癌(esophageal squmaous cancer，ESCC)中發(fā)現(xiàn)表達差異最大的一種LncRNA位于8號染色體(Chr8：76121095～76189420)，其在ESCC組織中的表達顯著增高，約為癌旁組織的30倍。由于文獻中沒有關(guān)于該LncRNA的表達及功能的研究報道，我們將其命名為食管鱗狀細(xì)胞癌特異相關(guān)長片段非編碼RNA_1(esophageal squmaous cancer associated LncRNA，ESCCAL_1)，初步研究表明其可能參與了ESCC的發(fā)生發(fā)展過程，是潛在的診斷和預(yù)后標(biāo)志物[3]。為了探討ESCCAL_1在ESCC中發(fā)揮功能的機制，本實驗采用人蛋白激酶磷酸化水平芯片陣列檢測ESCCAL_1敲減前后EC9706細(xì)胞系蛋白激酶磷酸化水平表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 ESCC EC-9706細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。慢病毒載體系統(tǒng)由pGC-LV載體、pHelper 1.0載體和 pHelper 2.0載體三質(zhì)粒組成，購自上海吉凱公司。蛋白質(zhì)組分析陣列-人磷酸化激酶陣列試劑盒購自R&D公司(美國)。

靶向ESCCAL_1基因的慢病毒載體的構(gòu)建與生產(chǎn)：含干擾片段及無關(guān)序列的慢病毒載體委托上海吉凱公司合成。實驗分為敲減組(ESCCAL_1-shNRA-EC9706轉(zhuǎn)染組，KD 組)、陰性對照組(即轉(zhuǎn)染無關(guān)系列，NC- ESCCAL_1-shNRA-EC9706，NC組)和空白對照組(不做任何處理，Con組)。

1.2 檢測方法 采用人蛋白激酶磷酸化芯片陣列檢測抑制ESCCAL_1表達后EC9706細(xì)胞蛋白激酶磷酸化相對水平，按說明書進行，并在伯樂成像系統(tǒng)中進行掃描分析。用伯樂成像分析軟件對各蛋白膜進行灰度值分析，計算各蛋白激酶磷酸化相對水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。表達水平差異的比較采用χ2檢驗；多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

KD組與NC組中FAK、JNK1、Src、AMPKα1等蛋白激酶的相對磷酸化水平比值分別為2.76∶1、2.20∶1、2.15∶1、2.01∶1，表達量明顯降低(P<0.05)。見表1及圖1、圖2。

表1 人磷酸化激酶灰度值分析

圖1 芯片陣列檢測ESCCAL_1敲減前后EC9706中

圖2 芯片檢測蛋白激磷酸化相對水平

3 討論

LncRNA的作用機制非常復(fù)雜，至今人們知之甚少。近年來研究表明，LncRNA作為細(xì)胞功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中必需的生物分子，在染色體折疊組裝與穩(wěn)定、核小體形成、基因表達、信使RNA的選擇性剪輯以及蛋白質(zhì)形成等過程中發(fā)揮重要作用。目前研究顯示，LncRNA位于增強子區(qū)域時，可調(diào)節(jié)蛋白-蛋白、蛋白-DNA的相互作用，也可以直接結(jié)合蛋白或miRNAs，可從復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等多種層面對細(xì)胞功能進行調(diào)控，調(diào)控的主要方式是充當(dāng)信號分子、分子誘餌、蛋白復(fù)合體骨架等[4]，可以積累體細(xì)胞基因拷貝數(shù)變異(copy-number variations，CNAs)，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，一部分CNAs會引起腫瘤發(fā)生。有的LncRNA可以從多個層面，充當(dāng)多個角色，發(fā)揮極其復(fù)雜精確的調(diào)控功能。

Hu等[5]使用RNA pull down、Western blotting及RIP-qPCR確認(rèn)FAL1 RNA的結(jié)合蛋白為BMI1。BMI1是PRC1(polycomb repressive complex 1)復(fù)合體的一個亞基，PRC1是染色體修飾復(fù)合物，可抑制多種基因表達。shRNA沉默F(xiàn)AL1或BMI1，發(fā)現(xiàn)表達量增加最多的是CDKN1A基因，該基因與癌癥發(fā)生有關(guān)，說明FAL1可能通過調(diào)控BMI1在CDKN1A啟動子的結(jié)合率而控制CDKN1A的轉(zhuǎn)錄，提高CDKN1A的表達。另有研究采用LncRNA芯片發(fā)現(xiàn)MEG3在肝癌中的特異性表達下調(diào)。對MEG3表達調(diào)控機制的研究認(rèn)為，MEG3的表達下調(diào)可能是因為MEG3啟動子發(fā)生了超甲基化，即LncRNA的表達同樣可能受到表觀遺傳調(diào)控；MEG3啟動子的超甲基化可能是與microRNA-29a 調(diào)控通路相互作用的結(jié)果，從而認(rèn)為miRNA和LncRNA可以相互作用而參與基因表達調(diào)控[6]。MALAT1也稱為NEAT2(nuclear-enriched abundant transcript 2)，目前研究較多。Wang等[7]研究表明，在ESCC細(xì)胞系中miRNA-101和miRNA-217通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機制使MALAT1表達沉默，阻滯細(xì)胞周期進程，進而抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。MALAT1的5’端可以與SR剪切蛋白家族中的多種因子結(jié)合，改變SR蛋白的磷酸化與去磷酸化，影響其活性；通過影響SR蛋白的空間，調(diào)控其對pre-mRNA的剪接作用[8]。

蛋白激酶(protein Kinases，PK)是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，是一個非常龐大的功能性蛋白家族。它能把腺苷三磷酸(ATP)上末位的磷酸基團轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基上。根據(jù)被磷酸化底物蛋白的氨基酸殘基種類，蛋白激酶共分為5類，即絲氨酸/蘇氨酸、酪氨酸、組氨酸、色氨酸和天冬氨?；?谷氨酰基蛋白激酶。蛋白激酶的調(diào)控功能非常強大，涉及面廣，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、免疫和炎癥反應(yīng)等復(fù)雜生命活動中均起著非常重要的作用。近年來科研人員發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶還和腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，如局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達上調(diào)[9]。隨后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AK可通過調(diào)控多條信號通路參與腫瘤生長、發(fā)生、發(fā)展過程，并與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)[10-11]。近年來，研究人員已開發(fā)多種靶向藥物并應(yīng)用于臨床，抑制PK活性以殺死或控制癌細(xì)胞。如在 ER(+)乳腺癌中，三苯氧胺可通過調(diào)節(jié)PKC活性抑制癌細(xì)胞生長[12]；吉非替尼和厄洛替尼作為酪氨酸激酶抑制劑用于治療肺癌等。本研究中使用人磷酸化激酶陣列試劑盒檢測抑制ESCCAL_1表達后EC9706中磷酸蛋白激酶的表達，用軟件對各蛋白條帶進行灰度值定量分析。結(jié)果顯示， NC組與敲減組相比，F(xiàn)AK、JNK1、Src、AMPKα1、Chk2和GSK3α/β相對水平比值分別為2.76∶1、2.20∶1、2.15∶1、2.01∶1，1.51∶1、1.44∶1，敲減組表達量明顯降低(P<0.05)。這提示在體外食管癌細(xì)胞系中，ESCCAL_1能與多種蛋白激酶作用，引起這些蛋白激酶磷酸化，參與食管癌的發(fā)生發(fā)展。當(dāng)然，進一步的研究需驗證這些蛋白激酶磷酸化在食管癌中的作用，ESCCAL_1與蛋白激酶的作用機制，并明確這些激酶之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)對話，對食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機制有進一步認(rèn)識。

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Regulatory effects of ESCCAL_1 on protein kinase phosphorylation in esophageal squamous cell carcinoma

Cao Xinguang1, Cui Yuanbo2, Chen Xiaobing1, Cao Wei2

(1.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China;2.DepartmentofTranslationalMedicineCenter,ZhengzhouCenterHospital,Zhengzhou450007,China)

Objective To explore the possible mechanism of ESCCAL_1 in esophageal squamous cell carcinoma. Methods Human phospho-kinase array kit was used to detect the phosphorylation of protein kinase in EC9706 cells transfected with ESCCAL_1-shRNA or control. Each gray value of protein band was quantitatively analyzed.Results The relative gray value ratios of FAK、pJNK1、pSrc、pAMPKα1 between KD group and NC group were 2.76∶1, 2.20∶1, 2.15∶1, 2.01∶1 respectively, and the phosphorylation of these protein kinases in KD group was significantly down-regulated (P<0.05).Conclusion ESCCAL_1 may regulate the EC9706 cell proliferation and metastasis through protein kinase phosphorylation.

esophageal squamous cancer; ESCCAL_1; protein kinase phosphorylation

曹巍，E-mail：xinguangcao@126.com。

R 735.1

10.3969/j.issn.1004-437X.2016.10.002

2016-03-17)