嘎日迪烏日勒對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型血漿烏頭堿含量的影響

韓志強(qiáng) 孫曉成 王 茜 安 達(dá) 巴圖德力根

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥臨床藥理研究所,內(nèi)蒙古 通遼 028007)

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·基礎(chǔ)研究·

嘎日迪烏日勒對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠模型血漿烏頭堿含量的影響

韓志強(qiáng) 孫曉成1王 茜2安 達(dá) 巴圖德力根

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥臨床藥理研究所,內(nèi)蒙古 通遼 028007)

目的 高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定口服嘎日迪烏日勒的腦缺血再灌注損傷大鼠模型血清烏頭堿含量。方法 Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為嘎日迪烏日勒低、高劑量組，每組10只，分別給予嘎日迪烏日勒0.18、0.36 g/kg，均按20 ml/kg體積灌胃給藥，1次/d,連續(xù)給藥7 d。給藥7 d后禁食，不進(jìn)水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型(MCAO)，HPLC方法檢測(cè)血漿烏頭堿含量。結(jié)果 大鼠口服嘎日迪烏日勒7 d，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，血漿烏頭堿含量在低、高劑量組分別為(2.68±0.61)，(2.50±0.82)μg/ml，兩組間比較無明顯差異。結(jié)論 處方劑量服用嘎日迪烏日勒是安全的。

嘎日迪烏日勒；烏頭堿

蒙藥嘎日迪烏日勒，蒙古名扎沖十三味丸，功能祛風(fēng)通竅，舒筋活血，鎮(zhèn)靜安神，除“協(xié)日烏素”，用于半身不遂、左癱右瘓、口眼歪邪、四肢麻木、腰腿不利、言語不清、筋骨疼痛、神經(jīng)麻痹、風(fēng)濕、關(guān)節(jié)疼痛，收載于1998年版衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(蒙藥分冊(cè))。研究表明，其急性毒性試驗(yàn)半數(shù)致死量(LD50)為2.96 g/kg，95%可信下限為2.60 g/kg、上限為3.36 g/kg，是成人臨床用量的177.5倍；長期毒性試驗(yàn)無明顯的慢性毒性反應(yīng)和延緩毒性反應(yīng)〔1〕。嘎日迪烏日勒對(duì)腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腦組織中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(nNOS)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量有關(guān)。該方中含有劇毒成分雙酯型二萜類生物堿、烏頭堿。本研究采用高效液相色譜法(HPLC)〔2〕測(cè)定口服嘎日迪烏日勒后，腦缺血再灌注損傷大鼠模型血清烏頭堿含量，為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠SPF級(jí)，體重180～200 g，雌雄各半，長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司購買，許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004。

1.1.2 藥物 嘎日迪烏日勒由訶子、制草烏、石菖蒲、木香、人工麝香、珊瑚(制)、珍珠(制)、丁香、肉豆蔻、沉香、禹糧土、磁石(煅)、甘草等藥材組成，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室制備。烏頭堿，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110720-201111,含量98.8%。

1.1.3 儀器 LC-20AT島津高效液相色譜分析儀，日本島津。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥、造模方法〔3〕Wistar大鼠按體重隨機(jī)分為嘎日迪烏日勒低、高劑量組，每組10只，分別給予嘎日迪烏日勒0.18、0.36 g/kg，均按20 ml/kg體積灌胃給藥，1次/d,連續(xù)給藥7 d。給藥7 d后禁食，不進(jìn)水12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，參照Longa等〔4〕采用的線栓法略加改良，制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型(MCAO)。對(duì)大鼠MCAO進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分：0分，沒有神經(jīng)功能缺損；1分(不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪)，輕度局灶性神經(jīng)功能缺損；2分(向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈)，中度局灶性神經(jīng)功能缺損；3分(向?qū)?cè)傾倒)，重度局灶性神經(jīng)功能缺損；4分，大鼠沒有自發(fā)地行走，并且意識(shí)喪失。達(dá)到1～3分者納入研究。再灌注24 h取各組存活大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，3 000 r/min離心5 min,取上清，-80℃保存，待測(cè)。

1.2.2 色譜條件〔5〕Hubble C18(250*4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長為245 nm。甲醇∶水∶二乙胺為75∶25∶0.1。柱溫30℃，體積流速1.0 ml/min 。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取烏頭原堿對(duì)照品適量，精密稱定，加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液，配制成0.104 mg/ml的溶液，即得。

1.2.4 供試品溶液的制備 從-80℃冰箱中取出樣本200 μl，放入80 μl氨水堿化樣本，以1∶5的比例放入乙酸乙酯旋渦混合3 min，3 000 r/min離心5 min,取上清，氮?dú)獯蹈桑?00 μl甲醇復(fù)溶，5 000 r/min,離心5 min,取上清，50 μl進(jìn)樣。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

1.2.5.1 專屬性 取空白血漿100 μl加對(duì)照品溶液100 μl，按上述供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣10 μl。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 取對(duì)照品溶液10、20、40、80、100 μl，分別加入空白血漿成為200 μl，放入80 μl氨水堿化樣本，以1∶5的比例放入乙酸乙酯旋渦混合3 min，3 000 r/min離心5 min,取上清，氮?dú)獯蹈?，?00 μl甲醇復(fù)溶，5 000 r/min離心5 min,取上清100 μl，定容至1 000 μl，按照色譜條件進(jìn)樣10 μl，烏頭堿濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.3 精密度與重復(fù)性 (1)日內(nèi)精密度：取對(duì)照品溶液10、40、100 μl各5份，分別加入空白血漿至200 μl，按照供試品溶液制備方法制備，取上清100 μl，定容至1 ml，分別進(jìn)樣10 μl，測(cè)其峰面積。(2)日間精密度：取對(duì)照品溶液10、40、100 μl，分別加入空白血漿至200 μl，按照供試品溶液制備方法制備，取上清100 μl，定容至1 ml，分別進(jìn)樣10 μl,每天測(cè)量一組，連續(xù)5 d，測(cè)其峰面積。

1.2.5.4 回收率 取對(duì)照品溶液10、40、100 μl各5份，分別加入空白血漿至200 μl，按照供試品溶液制備方法制備，取上清100 μl，定容至1 ml，分別進(jìn)樣10 μl。

1.2.5.5 穩(wěn)定性 取對(duì)照品溶液40 μl，加入空白血漿160 μl，按照供試品溶液制備方法制備，取上清100 μl，定容至1 ml，進(jìn)樣10 μl,分別于1、2、4、6、8、10、12、24 h測(cè)其峰面積。

1.3 樣品含量測(cè)定 取服用嘎日迪烏日勒的腦缺血再灌注損傷大鼠血漿200 μl，按上述血漿前處理方法進(jìn)行制備，分別進(jìn)樣50 μl,測(cè)其峰面積，計(jì)算樣品含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用回歸法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，回歸方程以標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限為線形范圍，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差以RSD值為準(zhǔn)進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 專屬性 烏頭堿保留時(shí)間為9.67 min，陰性對(duì)照無干擾，見圖1。

a：烏頭堿，1：對(duì)照品，2：樣品，3：空白血漿圖1 專屬性試驗(yàn)對(duì)照品、樣品、空白血漿色譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 回歸方程為Y=6.18×106X-425.94，r=0.999 8；結(jié)果表明，在線形范圍0.52×10-3μg/μl～0.52×10-2μg/μl之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，定量下限為1.47×10-3μg/μl。

2.1.3 精密度及重復(fù)性 見表1。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 見表2。

2.1.5 穩(wěn)定性 烏頭原堿相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.009%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 服用嘎日迪烏日勒后腦缺血再灌注損傷大鼠血漿烏頭堿含量 嘎日迪烏日勒低、高劑量組血漿烏頭堿含量分別為(2.68±0.61)、(2.50±0.82)μg/ml。

表1 精密度試驗(yàn)及重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果±s)

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

蒙藥嘎日迪烏日勒劇毒成分為雙酯型二萜類生物堿烏頭堿，小鼠經(jīng)灌胃LD50為1.8 mg/kg〔6〕，人口服烏頭堿0.12 mg即可中毒，3～5 mg可使人致死。本實(shí)驗(yàn)表明，大鼠按0.18、0.36 g/kg口服嘎日迪烏日勒7 d未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，血漿烏頭堿含量低，可能與口服7 d，達(dá)到血藥濃度穩(wěn)態(tài)有關(guān)。如按血漿2.50 ug/ml、大鼠含血液量10 ml、標(biāo)準(zhǔn)體重220 g計(jì)算，大鼠體內(nèi)含烏頭堿量約0.11 μg/kg，按體表面積換算為成人(60 kg)0.02 μg/kg，是人口服烏頭堿中毒量的300分之一。以上結(jié)果表明按照處方劑量服用嘎日迪烏日勒是安全的。

1 韓志強(qiáng),徐艷華,娜日蘇,等.蒙藥嘎日迪烏日勒毒理研究〔J〕.中國臨床藥理學(xué)雜志,2015;31(19):1940-2.

2 巴圖德力根,布仁巴圖,韓志強(qiáng).HPLC法測(cè)定蒙藥嘎日迪-13味丸中6種烏頭類生物堿的含量〔J〕.中國臨床藥理學(xué)雜志,2015;31(19):1961-3.

3 田彩云,張浩楠,何靜波,等.嘎日迪-13對(duì)局灶性腦缺血大鼠NSE、TNF-α、IL-6表達(dá)的影響〔J〕.中草藥,2015;46(5):716-20.

4 Longa EZ,Weinstein PR,Carlon S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5 李文東,馬 辰.高效液相色譜法測(cè)定大鼠組織中烏頭堿的含量〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007;13(7):56-8.

6 張宏順.烏頭類中藥的毒性及中毒處理〔J〕.藥物不良反應(yīng)雜志，2005;7(2)：114.

〔2015-11-19修回〕

(編輯 袁左鳴)

Determination of serum content of aconitine of Garidi-Wurile administered cerebral ischemia reperfusion injured rat by HPLC

HAN Zhi-Qiang,SUN Xiao-Cheng,WANG Qian,et al.

Institute of Clinical Pharmacology of Traditional Mongolia Medicine,Affiliated Hospital of Inner Mongolian University for the Nationalities,Tongliao 028007,Inner Mongolia,China

Objective To detect the serum acotine content of Garidi-Wurile(GRD-WRL) by HPLC administered cerebral ischemia reperfusion injured rat,which can provide scientific evidence for clinical application.Methods Wistar rats were randomly divided into GRD-WRL low and high dose groups by body weight,10 rat for every group.Rats in the GRD-WRL low and high dose groups wereintragastrically treated by 0.18 and 0.36 g/kg dosage of GRD-WRL in 20 ml/kg volume 1 time every day for 7 days.At the last day of drug administration,the rats were fasted 12 hours,and anaesthetized with 10% of chloral hydrate,then the model of middle cerebral artery occlusion was caused by intraluminal monofilament,and serum acotine contents were detected by HPLC.Results After 7 days of administration of GRD-WRL,no adverse drug reaction was observed.The serum contents of acotine were(2.68±0.61)，(2.50±0.82)μg/ml in GRD-WRL low and high dose groups respectively,there was no significant difference between two groups.Conclusions The clinical dosage of GRD-WRL is safe.

Garidi-Wurile;Aconitine

國家科技支撐計(jì)劃基金資助項(xiàng)目(No.2012BAI27B02)

巴圖德力根(1969-)，男，碩士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事蒙藥藥理研究。

韓志強(qiáng)(1980-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事蒙藥藥理研究。

R991

A

1005-9202(2016)20-4941-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.001

1 內(nèi)蒙古民族大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 2 通遼市人民醫(yī)院兒科