雷公藤紅素抑制LDL及HAEC細(xì)胞氧化損傷作用

李 鋒,李義嘉,李清仙,郭養(yǎng)浩

(福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所，福建 福州 350116)

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雷公藤紅素抑制LDL及HAEC細(xì)胞氧化損傷作用

李 鋒,李義嘉,李清仙,郭養(yǎng)浩

(福州大學(xué)藥物生物技術(shù)與工程研究所，福建 福州 350116)

目的 考察雷公藤紅素(celastrol)體外對(duì)低密度脂蛋白(LDL)氧化過程及動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的抑制作用。方法 采用體外Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化修飾的體外化學(xué)反應(yīng)模型，設(shè)置陰性對(duì)照、模型對(duì)照及雷公藤各劑量組，測(cè)定Cu2+誘導(dǎo)氧化LDL的動(dòng)力學(xué)曲線，分析比較各實(shí)驗(yàn)組的曲線下面積(AUC)、延滯期持續(xù)時(shí)間(lag time)及脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生量(TBARS值)；MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，以確定雷公藤紅素對(duì)正常細(xì)胞的安全劑量；建立AAPH誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞HAEC氧化損傷的細(xì)胞模型，設(shè)置陰性對(duì)照、模型對(duì)照及雷公藤各劑量組， 測(cè)定細(xì)胞的乳酸脫氫酶(LDH)漏出量、超氧化物岐化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性，Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞核受損傷情況，RT-qPCR法分析Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，celastrol在體外較低的劑量條件下(100 nmol·L-1～1 μmol·L-1)即能有效延長LDL氧化過程中的遲滯期，降低反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的AUC以及脂質(zhì)過氧化物的生成，表明celastrol在體外能有效抑制Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在100～400 nmol·L-1劑量范圍內(nèi)，celastrol能有效降低AAPH所致HAEC細(xì)胞的LDH漏出量，維護(hù)細(xì)胞膜和細(xì)胞核的完整性；提高受損細(xì)胞的Nrf2和HO-1mRNA表達(dá)，提高受損細(xì)胞的SOD、GPX酶活，從而提升內(nèi)皮細(xì)胞的抵抗氧化應(yīng)激的能力。結(jié)論 celastrol可在體外有效抑制Cu2+誘導(dǎo)人LDL氧化損傷，在無細(xì)胞毒安全劑量下(100～400 nmol·L-1)可抑制AAPH所致的HAEC細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

雷公藤紅素；低密度脂蛋白；血管內(nèi)皮細(xì)胞；脂質(zhì)過氧化；氧化應(yīng)激；抗氧化；活性氧

雷公藤紅素(celastrol，CL)又名南蛇藤素，是一種木栓烷型五環(huán)三萜酸，結(jié)構(gòu)式見Fig 1。雷公藤最初提取自我國傳統(tǒng)中藥雷公藤的根皮，后又發(fā)現(xiàn)在南蛇藤屬植物中也有存在[1]。研究表明，celastrol具有廣泛的生物活性，具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、抵抗免疫抑制[4]、抑制肥胖[5-6]、抑制肝硬化[7]及降血糖[8]等多方面的藥理作用，現(xiàn)在臨床上主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[9]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[10-11]等炎癥性和免疫抑制方面的疾病。特別是Liu等[5]2015年報(bào)道了celastrol治療小鼠肥胖癥的研究工作之后，celastrol的相關(guān)藥理活性引起了廣泛關(guān)注，極具開發(fā)成為新一代降肥胖藥物潛力。雖然雷公藤作為一種中藥材毒性較強(qiáng)，但對(duì)celastrol單體化合物的研究表明，在正常的用藥劑量范圍內(nèi)對(duì)小鼠并無毒性作用，其臨床應(yīng)用前景被看好。

Fig 1 Chemical structure of celastrol

低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)是主要的血膽固醇運(yùn)載工具，主要負(fù)責(zé)從肝向外周輸送膽固醇。LDL在體內(nèi)易經(jīng)活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基氧化損傷作用而轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷兔芏戎鞍?oxidative low density lipoprotein, ox-LDL)，而ox-LDL是致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的危險(xiǎn)因素，故LDL的氧化損傷在AS的形成和發(fā)展中扮演著重要角色[12-13]。目前，對(duì)celastrol體外抑制LDL氧化及保護(hù)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)擬采用體外Cu2+誘導(dǎo)人源LDL氧化損傷模型及2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(AAPH)誘導(dǎo)人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)氧化損傷細(xì)胞模型，考察celastrol對(duì)LDL氧化過程的抑制作用及對(duì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，并對(duì)其機(jī)制做初步研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞 人LDL，購自上海經(jīng)科化學(xué)科技公司；雷公藤紅素、AAPH購自Aladdin試劑有限公司；四乙氧基丙烷(TEP)、硫代巴比妥酸(TBA)、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)購自上海源葉生物科技公司；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；碘化丙啶(PI)單染試劑盒購自上海貝博公司；TaqManTMqPCR試劑盒，賽默飛公司；引物合成，生工生物工程(上海)公司；人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)細(xì)胞株，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司；其他試劑均為分析純。

1.2 LDL的制備及Cu2+誘導(dǎo)氧化

1.2.1 LDL的制備 為了避免商品LDL中的保護(hù)劑EDTA對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成干擾，要通過透析法去除。采用磷酸緩沖液(10 mmol·L-1，pH7.4)4 ℃透析24 h，每隔6 h更換1次透析液。BCA法測(cè)定蛋白濃度，過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Cu2+誘導(dǎo)氧化 LDL氧化反應(yīng)體系為：LDL終濃度100 mg·L-1，CuSO4終濃度10 μmol·L-1，混合均勻，于37 ℃避光反應(yīng)，結(jié)束時(shí)，加入等體積含1 mmol·L-1EDTA和1 mmol·L-1BHT的混合液終止氧化反應(yīng)[14]。本實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)體系中加入不同濃度的雷公藤紅素考察對(duì)LDL氧化過程的抑制效果。反應(yīng)進(jìn)行中，實(shí)時(shí)測(cè)定共軛二烯鍵的形成情況。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定共軛二烯鍵的生產(chǎn)，取樣采用TBARS法分析LDL氧化物水平。

1.2.3 共軛二烯鍵測(cè)定 共軛二烯鍵是LDL氧化的早期產(chǎn)物，采用Xu等[15]方法，略有改動(dòng)。1 mL LDL溶液(100 mg·L-1)與不同濃度雷公藤紅素樣品混合孵育，對(duì)照組同樣條件但不加雷公藤紅素。體系中加入終濃度為10 μmol·L-1的CuSO4啟動(dòng)氧化反應(yīng)，島津UV-1800分光光度計(jì)每10 min測(cè)定A234 nm吸光值，持續(xù)4 h，記錄共軛二烯鍵的生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)曲線，并計(jì)算0～4 h的曲線下面積(AUC0-4 h)。

1.2.4 硫代巴比妥酸產(chǎn)物(TBARS)分析 采用分析TBARS的方法測(cè)定LDL氧化物[16]。1 mL的LDL溶液(100 mg·L-1)與終濃度為10 μmol·L-1的CuSO4混合均勻，在加入或不加入(對(duì)照組)20 μL不同濃度雷公藤紅素樣品的情況下進(jìn)行氧化，37 ℃避光反應(yīng)4 h。反應(yīng)體系加入EDTA(終濃度1 mmol·L-1)終止氧化，分別加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為0.2的乙酸和1 mL 0.67%TBA溶液，混合均勻，加熱至95 ℃，反應(yīng)30 min，冷至室溫。1 500 r·min-1離心10 min去除沉淀，取上清532 nm測(cè)定吸光值。TEP 10 μmol·L-1作為標(biāo)樣，與測(cè)定樣品同樣處理。計(jì)算各組的TBARS濃度值：A532樣品/A532標(biāo)樣×10，折算成相對(duì)含量為μmol·g-1Pro。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 HAEC用DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)0.15 FBS、20 kU·L-1bFGF、100 kU·L-1鏈霉素、100 kU·L-1青霉素)，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液1次。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，密度調(diào)整至1×108·L-1，每孔100 μL接種于12孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后轉(zhuǎn)換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定celastrol對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生抑制的安全劑量，在安全劑量的范圍內(nèi)，考察celastrol對(duì)細(xì)胞氧化損傷的抑制作用。隨機(jī)將培養(yǎng)孔分成3組：① 空白對(duì)照組：不加任何藥物；② 模型刺激組：用含2 mmol·L-1AAPH無血清培養(yǎng)基氧化刺激；③ 藥物組：用含不同濃度雷公藤紅素和2 mmol·L-1AAPH無血清培養(yǎng)基處理。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用0.25%胰酶消化制備細(xì)胞懸液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法分析細(xì)胞活力 培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)基，加入含5 g·L-1MTT的無血清無酚紅培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取MTT溶液，加入DMSO溶解所形成的甲臜晶體，570 nm測(cè)定吸光值。細(xì)胞活力/%=處理組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%。

1.5 細(xì)胞ROS水平、LDH漏出量及SOD、GPX酶活性測(cè)定 細(xì)胞ROS測(cè)定：采用黑壁底透96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，藥物處理方法同前。棄上清，PBS清洗，每孔加入100 μL 10 μmol·L-1的DCFH-DA熒光染液，37 ℃避光染色30 min，PBS清洗2次，用SpectraMax i3x型熒光酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，其激發(fā)光波長為480 nm，發(fā)射光波長為520 nm；以最高組熒光強(qiáng)度為100%，計(jì)算其他各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度(%)。LDH漏出測(cè)定：取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照LDH試劑盒說明書操作，測(cè)定LDH酶活，表示為U·L-1。SOD、GPX酶活性測(cè)定：收集6孔培養(yǎng)板中細(xì)胞，冰浴超聲波破碎，收集蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，樣品采用SOD和GPX試劑盒測(cè)定酶活性。

1.6 細(xì)胞Hoechst 33258染色 將所需的細(xì)胞爬片和載玻片用乙醇浸泡后清洗干凈，細(xì)胞爬片置于6孔板內(nèi)，備用。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔1.0×105個(gè)接種于24孔板細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，用不同濃度celastrol和2 mmol·L-1的AAPH一起處理細(xì)胞24 h。棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次，加入0.5 mL固定液，固定15 min。PBS洗2次，每次3 min，加入Hoechst 33258染色液，避光染色5 min。PBS洗2次，每次3 min。加熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片。激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 Celastrol對(duì)Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化的體外抑制作用 共軛二烯鍵的形成(測(cè)定234 nm吸光值)是反映LDL氧化的較合適的生物標(biāo)志，其反映了LDL早期氧化階段，而TBARS法分析的是晚期氧化階段的產(chǎn)物。因此，本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了這2項(xiàng)指標(biāo)，如Fig 2所示。從Fig 2A中可以看出，Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化的動(dòng)力學(xué)曲線可以分為3個(gè)階段：延滯期、快速反應(yīng)期和減速期。Cu2+氧化LDL對(duì)照組的延滯期時(shí)間為89.24 min，經(jīng)過celastrol處理可明顯延長延滯期所持續(xù)的時(shí)間，呈劑量依賴性(Tab 1)，100 nmol·L-1celastrol處理的延滯期時(shí)間延長到108.55 min(P<0.05)，而1 μmol·L-1水平時(shí)遲滯期進(jìn)一步延長(P<0.01)。同時(shí)，celastrol也能有效降低Cu2+氧化LDL動(dòng)力學(xué)曲線的AUC值，500 nmol·L-1和1 μmol·L-1水平時(shí)，從對(duì)照的72.17分別降低到41.23和34.10，而在100 nmol·L-1和200 nmol·L-1水平時(shí)，AUC降低并無顯著性。Fig 2B表明，celastrol能明顯降低Cu2+氧化LDL過程中脂質(zhì)過氧化物的水平，呈劑量依賴性。經(jīng)過Cu2+氧化誘導(dǎo)后，LDL反應(yīng)體系中脂質(zhì)過氧化物明顯增加到約12.4 μmol·g-1Pro，而celastrol 200 nmol·L-1能將TBARS值降低到約8.9 μmol·g-1Pro(P<0.05)，1 μmol·L-1能更進(jìn)一步降低到3.2 μmol·g-1Pro水平(P<0.01)。

Tab 1 Lag time and AUC0-4 hof LDL oxidative

GroupLagtime/minAUC0-4hCu2+inducedcontrol89.24±1.5472.17±8.45Cu2++CL100nmol·L-1108.55±2.67*71.71±10.7Cu2++CL200nmol·L-1119.37±1.93*71.67±9.10Cu2++CL500nmol·L-1154.71±2.16**41.23±4.74**Cu2++CL1μmol·L-1165.38±3.16**34.10±4.35**

*P<0.05，**P<0.01vsCu2+-oxidized LDL control. CL: celastrol

2.2 Celastrol對(duì)細(xì)胞活性的影響及對(duì)AAPH氧化損傷的抑制作用 由于考察celastrol是否具有抑制AAPH致HAEC細(xì)胞氧化損傷的前提是celastrol本身不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷抑制作用，故需要先確定藥物的安全劑量。Fig 3A表明，隨著劑量的增加，celastrol會(huì)明顯抑制HAEC細(xì)胞的增殖。在1 μmol·L-1及以上濃度時(shí)，相對(duì)細(xì)胞活性低于50%，抑制作用明顯；而在500 nmol·L-1及以下濃度時(shí)，相對(duì)細(xì)胞活性接近100%，并無明顯的抑制。故本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的celastrol細(xì)胞安全劑量上限為500 nmol·L-1，確定了50、100、200、400 nmol·L-14個(gè)濃度梯度，在此系列劑量下考察celastrol對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。Fig 3B表明，與AAPH對(duì)照相比，celastrol在50 nmol·L-1劑量下對(duì)細(xì)胞活性無明顯提高，而在100、200、400 nmol·L-1劑量下能明顯提高細(xì)胞的活性，說明celastrol在一定的劑量范圍能有效保護(hù)HAEC細(xì)胞免受AAPH的氧化損傷作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要在100、200、400 nmol·L-13個(gè)劑量下進(jìn)行。

Fig 2 Inhibition effect of celastrol on human

A: Kinetic curves of celastrol against Cu2+mediated LDL oxidation; B: The TBARS values of LDL oxidation.**P<0.01vswithout Cu2+-oxidized LDL control;#P<0.05，##P<0.01vsCu2+-oxidized LDL control.

2.3 Celastrol對(duì)AAPH氧化細(xì)胞的LDH漏出率、ROS水平及SOD、GPX酶活性的影響 通過分析LDH的漏出率，可間接反映出細(xì)胞膜所受氧化損傷程度，結(jié)果如Tab 2所示。為了考察celastrol本身在實(shí)驗(yàn)劑量條件下是否會(huì)對(duì)細(xì)胞所釋放的LDH產(chǎn)生抑制而發(fā)生假陽性，另用相應(yīng)實(shí)驗(yàn)濃度的celastrol與經(jīng)AAPH損傷的細(xì)胞孵育1 h后發(fā)現(xiàn)，與AAPH處理的模型細(xì)胞相比較，LDH漏出量并無明顯差異，說明celastrol在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定劑量條件下并不抑制LDH。由Tab 2可知，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，AAPH氧化組的LDH酶活性明顯增加，漏出量增加到89.26 U·L-1，說明細(xì)胞膜受損傷嚴(yán)重，而celastrol能有效保護(hù)細(xì)胞膜，降低細(xì)胞LDH的漏出量，呈劑量依賴性。細(xì)胞ROS水平反映了細(xì)胞氧化應(yīng)激的程度，celastrol也能明顯降低AAPH所致細(xì)胞的ROS水平的增幅，在100 nmol·L-1劑量使相對(duì)ROS水平降至85.6%，隨著劑量增加，能進(jìn)一步降低至57.4%，表明celastrol能有效減輕損傷細(xì)胞的胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。SOD和GPX是機(jī)體重要的抗氧化酶，反映了細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果表明，celastrol同樣能提高AAPH所致?lián)p傷細(xì)胞的SOD、GPX酶活性，提升細(xì)胞的抵抗氧化應(yīng)激能力。

Fig 3 Celastrol effects on normal HAEC cells and its effects on AAPH-induced cell ±s,n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsAAPH-oxidized control

Tab 2 Effects of celastrol on LDH，ROS，SOD and GPX of AAPH-induced damaged ±s,n=3)

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAAPH-oxidized control

2.4 Hochest 33258熒光染色分析celastrol對(duì)細(xì)胞核形態(tài)影響 細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，往往伴隨著一系列形態(tài)變化，其中細(xì)胞核形態(tài)的變化尤其明顯，常出現(xiàn)染色質(zhì)濃集、碎裂等特征。本實(shí)驗(yàn)采用Hoechst 33258熒光染料核染色法觀察celastrol對(duì)AAPH所致細(xì)胞核損傷的影響，結(jié)果如Fig 4所示。陰性對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核中染色質(zhì)分布均勻，呈藍(lán)色(Fig 4A)；AAPH損傷細(xì)胞的染色質(zhì)明顯濃集，染色體碎裂，細(xì)胞剝落(Fig 4B)；celastrol能明顯減輕細(xì)胞核的這種受損傷程度(Fig 4 C-E)。說明celastrol能保護(hù)HAEC細(xì)胞核免受AAPH的氧化損傷。

Fig 4 Effects of celastrol on nuclei morphology of AAPH-induced damaging cells

A: Normal control group; B: AAPH-induced model group; C: AAPH+CL 100 nmol·L-1; D: AAPH+CL 200 nmol·L-1; E: AAPH+CL 400 nmol·L-1. Exicitation wavelength, 350 nm; emission wavelength, 460 nm. Magnification×400.

2.5 Celastrol對(duì)AAPH損傷細(xì)胞Nrf2和HO-1 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響 Nrf2主要介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，是機(jī)體重要的抗氧化防御系統(tǒng)，在對(duì)抗環(huán)境氧化因子致細(xì)胞損傷方面起重要作用。Nrf2信號(hào)通路的激活能上調(diào)HO-1的表達(dá)，對(duì)維持細(xì)胞氧化還原平衡具有重要意義。如Fig 5所示，celastrol在200、400 nmol·L-1劑量下能明顯提高AAPH所致?lián)p傷細(xì)胞Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)，而在100 nmol·L-1劑量下有一定的提升作用，但并不明顯。說明celastrol可通過增加Nrf2和HO-1的表達(dá)，從而提升細(xì)胞的抗氧化損傷能力。

Fig 5 Effects of celastrol on Nrf2 and HO-1 mRNA expressin of AAPH-induced damaging ±s,n=3)

*P<0.05，**P<0.01vsAAPH-oxidized control

3 討論

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook．F．)是中醫(yī)傳統(tǒng)藥物，臨床主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核以及其他慢性疾病，但由于藥物毒副作用較強(qiáng)，限制了其應(yīng)用。提取自雷公藤根皮的celastrol具有多種藥理活性，而在正常用藥劑量條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無明顯毒副作用[5]，因此受到人們極大的關(guān)注。Celastrol具有多種藥理活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，celastrol屬于五環(huán)三萜類化合物。研究表明，其結(jié)構(gòu)中A環(huán)C2和B環(huán)C6容易發(fā)生親電反應(yīng)[17]，易與半胱氨酸的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，形成共價(jià)鍵產(chǎn)物[18]，這可能是celastrol能影響很多蛋白質(zhì)功能的一個(gè)重要原因。

機(jī)體ROS所產(chǎn)生的LDL氧化損傷是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素之一[19]，其產(chǎn)物ox-LDL能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌黏附分子，易于形成泡沫細(xì)胞[20]。LDL在體外易受過渡態(tài)金屬離子的誘導(dǎo)作用而發(fā)生氧化，故本實(shí)驗(yàn)采用體外Cu2+誘導(dǎo)LDL氧化來模擬體內(nèi)的氧化過程。AAPH是常見的水溶性自由基誘導(dǎo)劑，能在生理?xiàng)l件下分解產(chǎn)生自由基，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷，且產(chǎn)生自由基的速度可控，因而被認(rèn)為是研究體內(nèi)抗氧化的理想模型[21]。故本實(shí)驗(yàn)采用體外Cu2+誘導(dǎo)人源LDL氧化損傷模型及AAPH誘導(dǎo)HAEC氧化損傷細(xì)胞模型，考察celastrol對(duì)LDL氧化過程及對(duì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的抑制作用。

Celastrol作為一種木栓烷型三萜酸，具有較強(qiáng)的抗氧化及清除自由基的作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，celastrol在體外較低的劑量下(100 nmol·L-1～1 μmol·L-1)即能有效延長LDL氧化過程中的遲滯期(lag time)，降低反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線的曲線下面積(AUC)以及脂質(zhì)過氧化物(TBARS值)的生成量，表明celastrol在體外能有效抑制Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化。

細(xì)胞正常條件下處于一種氧化/抗氧化平衡狀態(tài)，當(dāng)受外界氧化因子過度刺激時(shí)，會(huì)打破這種均衡狀態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，抗氧化系統(tǒng)嚴(yán)重受損。Nrf2主要介導(dǎo)細(xì)胞適應(yīng)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，是機(jī)體重要的抗氧化防御系統(tǒng)，在對(duì)抗環(huán)境氧化因子致細(xì)胞損傷方面起重要作用[22]。Nrf2信號(hào)通路的激活，能上調(diào)細(xì)胞中HO-1、SOD、GPX等重要抗氧化酶的活性，對(duì)維持細(xì)胞氧化還原平衡具有重要意義。乳酸脫氫酶(LDH)是較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于絕大多數(shù)正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，不能分泌到胞外，而一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外。通過檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性(即LDH的漏出量)，可判斷細(xì)胞受損的程度。本研究結(jié)果表明，在一定的劑量范圍內(nèi)(100～400 nmol·L-1)，celastrol能有效降低AAPH所致HAEC細(xì)胞的LDH漏出率，維護(hù)細(xì)胞膜的完整性；提高受損細(xì)胞的Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)，增加受損細(xì)胞的SOD、GPX酶活，從而提升內(nèi)皮細(xì)胞的抵抗氧化應(yīng)激的能力。張志強(qiáng)等[23]報(bào)道了celastrol在較高濃度2～10 μmol·L-1濃度能明顯提升結(jié)腸癌細(xì)胞SW620活性氧水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，celastrol在較低濃度不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷條件下，反而能抑制氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞ROS水平，這與Gu等[24]的研究結(jié)果大體一致，該小組報(bào)道了celastrol可在較低濃度下(50～200 nmol·L-1)抑制ox-LDL對(duì)巨噬細(xì)胞的氧化損傷。推測(cè)celastrol可能在低濃度和較高濃度條件下通過不同的途徑發(fā)揮截然不同的生物活性，低濃度下通過抗氧化降低氧化應(yīng)激途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，而在較高濃度下通過誘導(dǎo)凋亡提升ROS水平從而產(chǎn)生細(xì)胞損傷作用。

綜上所述，celastrol在體外能有效抑制Cu2+誘導(dǎo)的LDL氧化，抑制AAPH所致的HAEC細(xì)胞自由基氧化損傷，維護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核的完整性。其機(jī)制可能是通過增加Nrf2的表達(dá)，提高重要抗氧化酶HO-1、SOD及GPX的水平，從而提升細(xì)胞整體的抗氧化應(yīng)激能力來實(shí)現(xiàn)。

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The inhibitive effects of celastrol on LDL oxidation and HAEC cell oxidative damage

LI Feng, LI Yi-jia, LI Qing-xian, GUO Yang-hao

(InstituteofPharmaceuticalBiotechnologyandBioengineering,FuzhouUniversity,Fuzhou350116,China)

Aim To evaluate the inhibitive effects of celastrol on LDL oxidation and HAEC cell oxidative damage. Methods The Cu2+-induced LDL oxidation model was employed to evaluate celastrol inhibitive effect on LDL oxidationinvitro, the oxidative reaction kinetic curves were determined, and the AUC，lag time，TBARS value were assayed. The AAPH-induced HAEC damaging cellular model was employed to evaluate the effect of celastrol on oxidative cellular damage. The safe dose of celastrol on normal cells was determined by MTT method, and the effects of celastrol on HAEC oxidative damage were evaluated at the range of this safe dose. The LDH leakage，ROS level，SOD and GPX enzymatic activity，Nrf2 and HO-1 mRNA expression were determined. Results At the dose range of 100 nmol·L-1to 1 μmol·L-1, celastrol effectively extended the lag time of LDL oxidative process induced by Cu2+, reduced the AUC of oxidative reaction kinetic curve and reduced the generation of lipid peroxide in the LDL oxidative process. In the cellular experiment, celastrol effectively reduced the LDH leakage induced by AAPH, increased the integrity of cell membrane and nucleus, enhanced the antioxidative enzyme activities of cellular SOD，GPX and increased the expressions of Nrf2，HO-1 mRNA, celastrol also maintained the integrity of cellular structure. Conlusion Celastrol can effectively inhibit LDL oxidation induced by Cu2+, and can inhibit HAEC cell oxidative damage induced by AAPH at the dose range of 100 to 400 nmol·L-1.

celastrol; LDL; vascular endothelial cells; lipid peroxidation; oxidative stress; antioxidation; ROS

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.038.html

2016-06-17，

2016-07-21

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No 201205022)

李 鋒(1976-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：天然成分生物活性，E-mail：lifeng9676@aliyun.com；

郭養(yǎng)浩(1950-)，男，碩士，教授，研究方向：藥物生物技術(shù)，通訊作者，E-mail：yanghaoguo@aliyun.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.019

A

1001-1978(2016)11-1578-07

R284.1；R322.12；R329.24；R341.35；R543.5；R977.3；R977.6