基于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型研究通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ代謝的影響

付文君,代 淵，魏江平,鄭 航，馬 濤，徐世軍，王永炎

(1.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

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基于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型研究通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ代謝的影響

付文君1，2,代 淵2，魏江平1，2,鄭 航1，2，馬 濤3，徐世軍1，2，王永炎4

(1.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

目的 采用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型，考察通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ生成和降解關(guān)鍵靶點(diǎn)的影響，探索其抗阿爾茨海默病的作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞，不同濃度的含藥血清的培養(yǎng)液(含通絡(luò)醒腦泡騰片血清0%～40%)干預(yù)48 h，采用MTT法確定無(wú)毒濃度，LDH法檢測(cè)細(xì)胞活性，ELISA法檢測(cè)Aβ1-40和Aβ1-42分泌量；采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)APP基因和蛋白表達(dá)，Western blot法檢測(cè)APP剪切片段sAPPα和sAPPβ蛋白表達(dá)；qRT-PCR、Western blot及熒光檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定BACE1基因、蛋白水平和酶活性；Western blot檢測(cè)Aβ降解酶IDE和NEP蛋白表達(dá)；體外培養(yǎng)SH-SY5Y，通絡(luò)醒腦泡騰片不同濃度的含藥血清培養(yǎng)液孵育48 h，MTT法檢測(cè)Aβ25-35誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率。結(jié)果 通絡(luò)醒腦泡騰片含藥血清對(duì)SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞均無(wú)明顯毒性作用(P>0.05)；通絡(luò)醒腦泡騰片含藥血清可明顯抑制SH-SY5Y-APP細(xì)胞Aβ的分泌(P<0.05)，對(duì)SH-SY5Y-C99細(xì)胞Aβ分泌量無(wú)影響；對(duì)SH-SY5Y-APP細(xì)胞APP基因及蛋白水平、sAPPα及Aβ降解酶NEP和IDE蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響(P>0.05)，但對(duì)sAPPβ蛋白有明顯抑制作用(P<0.05)，且呈劑量依賴關(guān)系，對(duì)BACE1基因、蛋白水平、活性均有明顯抑制作用(P<0.01)。此外，研究發(fā)現(xiàn)通絡(luò)醒腦泡騰片含藥血清對(duì) Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用(P<0.01)。結(jié)論 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)β-分泌酶具有明顯的抑制作用，并能對(duì)抗Aβ神經(jīng)細(xì)胞毒性作用，提示抑制β-分泌酶和拮抗Aβ神經(jīng)細(xì)胞毒性是通絡(luò)醒腦泡騰片發(fā)揮抗阿爾茨海默病的主要作用機(jī)制。

阿爾茨海默病；通絡(luò)醒腦泡騰片；SH-SY5Y-APP細(xì)胞；SH-SY5Y-C99細(xì)胞；Aβ生成；Aβ降解

β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積形成的老年斑是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的典型病理特征[1]。腦內(nèi)Aβ代謝異常是Aβ沉積的關(guān)鍵，Aβ代謝異常與其生成和清除失衡密切相關(guān)[2]。Aβ生成主要取決于α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶對(duì)APP不同剪切作用[3]，而剪切后可溶性α-APP(sAPPα)、可溶性β-APP(sAPPβ)和C99等相關(guān)片段水平的高低可以間接反映相應(yīng)分泌酶的活性；中性內(nèi)肽酶(neprilysin，NEP)和胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)是腦內(nèi)Aβ的主要降解酶，因此IDE和NEP的活性水平可以間接反映腦內(nèi)Aβ的清除水平[4]。已知Aβ1-40和Aβ1-42是APP錯(cuò)誤酶切后的毒性片段，其寡聚化后沉積在神經(jīng)細(xì)胞形成老年斑，損害神經(jīng)元后導(dǎo)致神經(jīng)突觸缺失，參與了AD的發(fā)生和發(fā)展。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)醒腦泡騰片(Tongluoxingnao effervescent tablet，TLXNET)對(duì)Aβ注射AD大鼠[5]、東莨菪堿致擬癡呆小鼠[6]、雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎大鼠[7]等多種癡呆模型均有良好的抗癡呆效應(yīng)，為進(jìn)一步探索TLXNET抗AD作用機(jī)制，本研究擬從Aβ生成和清除角度進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 藥物 通絡(luò)醒腦泡騰片(每片1.2 g，4.5 g原生藥/片)，四川同道堂藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供，批號(hào)：20140215。

1.2 動(dòng)物與細(xì)胞株 SD大鼠(血清供體)，♂，體質(zhì)量280 g～320 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證SCXK(川)2013-24；SH-SY5Y、SH-SY5Y-APP和 SH-SY5Y-C99均由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院馬濤老師惠贈(zèng)。

1.3 試劑 Aβ25-35購(gòu)自Sigma公司；LDH試劑盒購(gòu)自Biovision公司；Human Aβ1-40Colorimetric ELISA Kit和Human Aβ1-42Colorimetric ELISA Kit購(gòu)自Invitrogen公司；β-分泌酶酶活測(cè)定試劑盒購(gòu)自Biovision公司；RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自天根生化科技有限公司；PrimeSTAR HS(Premix)購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶及RT-PCR中其他試劑購(gòu)自Fermentas公司；抗IDE抗體、抗NEP抗體購(gòu)自Abcam公司；抗β-actin單克隆抗體C4購(gòu)自Santa Cruz公司；抗APP抗體購(gòu)自IBL公司；Calbiochem?BACE1抗體購(gòu)自Merck公司；Amersham ECL plus顯色試劑購(gòu)于GE公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑均購(gòu)自Invitrogen公司。

1.4 儀器 BioRad Mini-Protean小型垂直電泳系統(tǒng)(BioRad公司)，ELX800酶標(biāo)儀(BIO-TEK公司)，GeneGnome ECL成像儀(Syngene公司)，5810R臺(tái)式多功能冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)，7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI公司)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備 大鼠按臨床成人用藥量5倍灌胃給藥，每天1次，連續(xù)6 d，d 7重復(fù)給藥2次，間隔時(shí)間2 h。在末次給藥1 h后，從眼眶靜脈取血，室溫靜置1 h以上，待血凝固后，1 500 r·min-1，10 min，分離血清，置于56℃水浴中30 min滅活處理，-20℃保存。使用前，0.2 μm濾膜過(guò)濾除菌。2.2 通絡(luò)醒腦泡騰片含藥血清無(wú)毒濃度的確定及其對(duì)細(xì)胞活性的影響 SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞均用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素、500 mg·L-1G418(用于維持外源基因的表達(dá))的DMEM/F12完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度90%的CO2培養(yǎng)箱中孵育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，分別以2.5×107·L-1接種于96孔板培養(yǎng)，每孔100 μL，待融合度達(dá)75%以上，棄去舊的培養(yǎng)基，對(duì)照孔加含10%普通大鼠血清，給藥孔分別加含1.25%、2.5%、5%、10%、20%、40%含藥血清(不足10%的以普通大鼠血清補(bǔ)足至終濃度10%)的DMEM/F12培養(yǎng)液孵育48 h。采用MTT法確定含藥血清無(wú)毒濃度和LDH-Cytotoxicity Assay Kit檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果以空白對(duì)照組(0%)光吸收值的百分?jǐn)?shù)表示。

2.3 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)細(xì)胞的Aβ1-40和Aβ1-42分泌量的影響 SH-SY5Y-APP細(xì)胞和SH-SY5Y-C99細(xì)胞分別以2.5×107·L-1接種于24孔板，相應(yīng)濃度含藥血清孵育48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采用Human Aβ1-40Colorimetric ELISA Kit和Human Aβ1-42Colorimetric ELISA Kit測(cè)定培養(yǎng)液中Aβ濃度，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書。

2.4 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)APP基因和蛋白表達(dá)水平的影響 SH-SY5Y-APP細(xì)胞以1×108·L-1接種于6孔板，用相應(yīng)濃度含藥血清孵育48 h，采用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞APP基因水平，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度，采用RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增得到的cDNA，以PrimeSTAR HS(Premix) PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參；APP引物為：上游5′-GGAAGTGGGATTCAGATCC-3′，下游5′-GCATAGTCTGTGTCTGCTC-3′。采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中APP蛋白表達(dá)量，以RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度，160 V電泳1.5 h，295 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，封閉1～2 h，加入抗體4 ℃孵育過(guò)夜，PBST清洗膜4次，5 min每次，加入抗體(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠和羊抗兔IgG)，室溫反應(yīng)1.5～2 h，進(jìn)行ECL顯色。采用X光片曝光，掃描后圖像用Image J軟件(NIH image, MD)分析。2.5 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)sAPPα和sAPPβ蛋白水平的影響 SH-SY5Y-APP細(xì)胞以1×108·L-1接種于6孔板，含相應(yīng)濃度含藥血清孵育48 h，采用Western blot法確定細(xì)胞中sAPPα和sAPPβ蛋白，步驟同“2.4”。

2.6 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)β-分泌酶基因、蛋白和酶活性的影響

2.6.1 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)β-分泌酶基因表達(dá)的影響 SH-SY5Y-APP細(xì)胞以1×108·L-1接種于6孔板，含相應(yīng)濃度含藥血清孵育48 h。采用qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中BACE1基因水平，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增得到的cDNA以SYBR? Green Real-Time PCR Master Mixes在ABI 7300 real time PCR system上擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參。BACE1引物為：上游5′-TGATCATTGTGCGGGTGGAGA-3′，下游5′-AGCTGCTCTCCTAGCCAGAAA -3′。2.6.2 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)β-分泌酶蛋白表達(dá)及酶活性的影響 SH-SY5Y-APP細(xì)胞以1×108·L-1接種于6孔板，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中BACE1的蛋白表達(dá)量，步驟同“2.4”。β-分泌酶活性測(cè)定方法參考試劑盒說(shuō)明書。

2.7 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ降解酶蛋白水平的影響 SH-SY5Y-APP細(xì)胞以1×108·L-1接種于6孔板，相應(yīng)濃度含藥血清孵育48 h，采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中IDE和NEP蛋白水平，步驟同“2.4”。2.8 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護(hù)作用 Aβ25-35以1 mmol·L-1濃度溶解于PBS緩沖液中，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，37℃孵育48 h，制備寡聚化的Aβ蛋白。SH-SY5Y細(xì)胞按“2.1”方法接種于96孔板，待融合至75%以上后，加入老化好的Aβ25-35至終濃度為35 μmol·L-1，同時(shí)加入相應(yīng)濃度的含藥血清，37℃孵育48 h。MTT檢測(cè)細(xì)胞活性，步驟同“2.1”。

3.1 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞活性影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0%)比較，0%～40%含藥無(wú)血清培養(yǎng)液孵育48 h，各濃度的吸光值無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)Fig 1A，即0%～40%濃度范圍內(nèi)，通絡(luò)醒腦泡騰片含藥血清對(duì)SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞無(wú)毒性。LDH法檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0%)比較，1.25%～40% 藥物濃度范圍內(nèi)，吸光度無(wú)顯著性變化(P>0.05)，見(jiàn)Fig 1B，藥物對(duì)細(xì)胞分泌乳酸脫氫酶的活性無(wú)影響。提示0%～40%濃度范圍內(nèi)，通絡(luò)醒腦泡騰片含藥血清對(duì)SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞無(wú)明顯毒性。

Fig 1 Effect of TLXNET on cell viability of SH-SY5Y-APP and SH-SY5Y-C99

3.2 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ1-40和Aβ1-42含量的影響 與對(duì)照組(0%)比較，2.5%～20%藥物濃度范圍內(nèi)，TLXNET含藥血清可明顯抑制SH-SY5Y-APP細(xì)胞的Aβ分泌(P<0.05)，且存在濃度依賴性，見(jiàn)Fig 2。與對(duì)照組(0%)比較，1.25%～10%藥物濃度范圍內(nèi)，SH-SY5Y-C99細(xì)胞的Aβ含量無(wú)明顯變化(P>0.05)，說(shuō)明TLXNET對(duì)SH-SY5Y-C99細(xì)胞中Aβ的分泌無(wú)抑制作用，見(jiàn)Fig3。提示TLXNET不是通過(guò)γ-分泌酶調(diào)控，可能是通過(guò)α-分泌酶或β-分泌酶影響Aβ的生成。

Fig 2 Effect of TLXNET on level of Aβ1-40 (A)and Aβ1-42 (B) in SH-SY5Y-APP cell

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3.3 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)APP基因及蛋白水平的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0%)比較，1.25%～20%藥物濃度范圍內(nèi)，APP基因和蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)Fig 4、5，提示TLXNET對(duì)APP基因和蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響。

Fig 3 Effect of TLXNET on levels of Aβ1-40and Aβ1-42 in SH-SY5Y-C99 cell

Fig 4 Effect of TLXNET on transcription of APP mRNA

3.4 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)APP酶切活性片段蛋白水平的影響 sAPPα和sAPPβ是APP分別經(jīng)α-分泌酶與β-分泌酶剪切后的產(chǎn)物。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0%)比較，1.25%～5%藥物濃度范圍內(nèi)，sAPPα蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而sAPPβ蛋白含量明顯減少(P<0.05)，并呈藥物濃度依賴性，見(jiàn)Fig 6。提示TLXNET抑制Aβ生成與調(diào)控β-分泌酶有關(guān)，但與α-分泌酶關(guān)系不大。

3.5 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)SH-SY5Y-APP細(xì)胞β-分泌酶的基因、蛋白及酶活的影響

3.5.1 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)β-分泌酶的基因表達(dá)的影響 采用2-ΔΔCT方法對(duì)qRT-PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)Tab 1，與對(duì)照組(0%)比較，2.5%～10% TLXNET含藥血清可以以劑量依賴方式下調(diào)BACE1基因表達(dá)。

Fig 5 Effect of TLXNET on the protein expression of APP

Fig 6 Effect of TLXNET on expression of shearing fragment of APP

Theconcentrationsofmedicatedserum/%ΔCT2-ΔΔCT2.50.770.58551.150.451101.350.393

3.5.2 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)β-分泌酶的蛋白表達(dá)的影響 Fig 7 Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組(0%)比較，1.25%～5%藥物濃度范圍內(nèi)，TLXNET以劑量依賴方式明顯抑制BACE1蛋白表達(dá)(P<0.01)。

**P<0.01vscontrol

3.5.3 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)β-分泌酶活性的影響 酶活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)Fig 8，與對(duì)照組(0%)比較，1.25%～5%藥物濃度范圍內(nèi)，TLXNET以劑量依賴方式明顯抑制BACE1酶活性(P<0.01)。

3.6 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ降解酶蛋白水平的影響 Fig 9 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0%)比較，1.25%～5%藥物濃度范圍內(nèi)，TLXNET對(duì)IDE和NEP蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響(P>0.05)。3.7 通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ25-35神經(jīng)毒性的影響 與對(duì)照組比，Aβ25-35孵育48 h后，SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.01)；在2.5%～10%藥物濃度范圍內(nèi)，TLXNET明顯提高SH-SY5Y細(xì)胞存活率(P<0.01)，并呈劑量依賴方式，見(jiàn)Fig 10。提示TLXNET具有拮抗Aβ神經(jīng)細(xì)胞毒性的作用。

Fig 8 Effect of TLXNET on enzyme activity of BACE1 in SH-SY5Y-APP cells

**P<0.01vscontrol

Fig 9 Effect of TLXNET on expression of Aβ degrading enzyme protein

4 討論

Aβ異常沉積具有神經(jīng)毒性，可引起Tau蛋白磷酸化、突觸的變化、遞質(zhì)丟失、神經(jīng)膠質(zhì)增生和炎癥反應(yīng)等病理反應(yīng)，導(dǎo)致老年斑塊形成、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)突觸缺失，進(jìn)而可導(dǎo)致神經(jīng)元的變性或死亡，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[8]?？梢?jiàn)Aβ異常沉積及其神經(jīng)毒性是AD的早期核心事件，神經(jīng)細(xì)胞的損傷是導(dǎo)致AD發(fā)生的關(guān)鍵，而有學(xué)者提出對(duì)抗 Aβ神經(jīng)毒性是“對(duì)因治療” AD 的主要目標(biāo)[9]，TLXNET是否具有該作用呢？課題組采用Aβ25-35致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型考察了其神經(jīng)保護(hù)作用，結(jié)果顯示TLXNET明顯提高SH-SY5Y細(xì)胞存活率，提示其能夠拮抗Aβ的神經(jīng)細(xì)胞毒性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。

Fig 10 Effect of TLXNET on neurotoxicity induced by Aβ25-35

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

Aβ生成和清除失衡是導(dǎo)致Aβ異常沉積的關(guān)鍵因素[10]，而Aβ生成與APP剪切途徑密切相關(guān)。APP可經(jīng)α-分泌酶或β-分泌酶剪切作用分別生成sAPPα、C83和sAPPβ、C99，C99再經(jīng)γ-分泌酶剪切產(chǎn)生Aβ[11-12]。本實(shí)驗(yàn)采用的SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可自主分泌過(guò)量的Aβ，是AD研究中較為理想的細(xì)胞模型[13]。課題組首先檢測(cè)了無(wú)毒濃度下TLXNET含藥血清對(duì)SH-SY5Y-APP和SH-SY5Y-C99細(xì)胞Aβ分泌的影響，結(jié)果顯示TLXNET可明顯抑制SH-SY5Y-APP細(xì)胞的Aβ分泌，而對(duì)SH-SY5Y-C99細(xì)胞Aβ分泌無(wú)影響。TLXNET導(dǎo)致Aβ分泌量下降究竟是通過(guò)抑制其生成還是促進(jìn)其降解，亦或是二者兼而有之呢？為回答這一問(wèn)題，課題組先從Aβ生成途徑進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)TLXNET對(duì)SH-SY5Y-C99細(xì)胞的Aβ分泌量無(wú)明顯影響，提示抑制Aβ的分泌不是通過(guò)抑制γ-分泌酶作用而實(shí)現(xiàn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)sAPPα蛋白表達(dá)水平亦無(wú)影響，提示該作用亦不是通過(guò)抑制α-分泌酶產(chǎn)生；但TLXNET可以明顯下調(diào)sAPPβ蛋白水平，說(shuō)明抑制Aβ的分泌與β-分泌酶密切相關(guān)。為了進(jìn)一步確認(rèn)TLXNET對(duì)β-分泌酶的抑制作用，我們檢測(cè)了BACE1基因、蛋白表達(dá)及酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLXNET對(duì)β-分泌酶的基因、蛋白和酶活性均有劑量依賴性的抑制作用，提示其通過(guò)抑制β-分泌酶抑制了Aβ的分泌。

TLXNET導(dǎo)致Aβ分泌量的減少是否與促進(jìn)其降解亦有關(guān)系呢？正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體自身存在有效的清除機(jī)制，Aβ的產(chǎn)生和清除能保持動(dòng)態(tài)平衡，但隨著機(jī)體逐漸衰老，Aβ清除降解機(jī)能下降，進(jìn)而導(dǎo)致Aβ過(guò)量沉積[11]。NEP和IDE是清除Aβ重要的降解酶，可由神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生或在腦血管上分泌，將Aβ降解為小分子肽類從體內(nèi)清除[14]，當(dāng)Aβ清除受抑制，Aβ可大量聚集進(jìn)而加劇神經(jīng)原纖維的纏結(jié)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，促使AD的形成發(fā)展[15]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)醒腦泡騰片對(duì)Aβ降解酶NEP和IDE的蛋白水平無(wú)影響，提示其降低Aβ分泌與促進(jìn)降解無(wú)關(guān)，但這與我們前期在體研究的結(jié)果不一致。前期發(fā)現(xiàn)藥物可提高Aβ25-35海馬注射癡呆大鼠的NEP水平[16]，但藥物對(duì)IDE的影響并沒(méi)有研究。而出現(xiàn)藥物調(diào)控NEP水平結(jié)果不一的可能原因：一是藥物在體內(nèi)代謝過(guò)程十分復(fù)雜，通絡(luò)醒腦泡騰片在體給藥是否產(chǎn)生了某種內(nèi)源性的活性物質(zhì)產(chǎn)生了作用；二是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)因?yàn)閮?nèi)環(huán)境不同，導(dǎo)致產(chǎn)生了不一致的結(jié)果；三是兩個(gè)研究的檢測(cè)方法不同，前者采用了免疫組化技術(shù)，本次采用Western blot技術(shù)，前者是否出現(xiàn)了假陽(yáng)性的結(jié)果等，具體原因有待進(jìn)一步深入研究分析。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，研究發(fā)現(xiàn)通絡(luò)醒腦泡騰片通過(guò)抑制β-分泌酶進(jìn)而抑制Aβ生成，并通過(guò)拮抗Aβ神經(jīng)細(xì)胞毒性保護(hù)神經(jīng)元是其發(fā)揮抗AD的主要作用機(jī)制之一。

(致謝：本項(xiàng)工作主要在四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地和北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局細(xì)胞分子技術(shù)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室共同完成，在此感謝陳歡、任香怡、付昆等同學(xué)在實(shí)驗(yàn)中的幫助。)

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Effects of Tongluoxingnao effervescent tablet on Aβ metabolism in transgenic cell model

FU Wen-jun1,2, DAI Yuan2,WEI Jiang-ping1,2, ZHENG Hang1,2, MA Tao3, XU Shi-jun1,2,WANG Yong-yan4

(1.SichuanProvincialKeyLaboratory,SystematicResearchandDevelopmentofChineseMedicinalResources,Province-Ministry

Co-constructedStateKeyLabIncubationBase,Chengdu611137,China; 2.ChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China;3.DongfangHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China;4.ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China)

Aim Tongluoxingnao effervescent tablets (TLXNET) ,based on the ancient formula of QiongGui Tang, can improve cognitive dysfunction in different AD models. This research is aimed to study the effects of TLXNET on the Aβ metabolism and explore the anti-AD mechanism in SH-SY5Y-APP and SH-SY5Y-C99 cells. Methods Cells were incubated for 48h in different concentrations of medicated serum (containing 0%～40% of TLXNET in the serum). Firstly, the non-toxic concentration was measured by MTT assay, the activity of cells was detected by LDH methods, and ELISA was used to measure the levels of Aβ1-40and Aβ1-42. Then, the gene and protein expressions of APP were detected via RT-PCR and Western blot of which the expressions of shearing fragments such as sAPPα and sAPPβ were investigated by Western blot, the same as the expressions of IDE and NEP. Additionally, the level of mRNA, protein and activity of BACE1 were measured by qRT-PCR, Western blot and fluorescence detection kits respectively. Eventually, MTT assay was performed to detect the cell viability after the SH-SY5Y cells were treated with various concentrations of medicated serum and Aβ25-35for 48h. Results There was no significant toxicity of TLXNET medicated serum in SH-SY5Y-APP and SH-SY5Y-C99 cells (P>0.05). TLXNET could significantly inhibit Aβ secretion in SH-SY5Y-APP cells (P<0.05), but had no effect on Aβ secretion in SH-SY5Y-C99 cells, the same as the level of APP mRNA and protein in SH-SY5Y-APP cells and the expressions of IDE and NEP (P>0.05). Additionally, TLXNET could still notably inhibit the expression of sAPPβ protein in a dose-dependent way, with statistical significance (P<0.05). Meanwhile, the level of mRNA, protein and activity of BACE1 were also significantly decreased by TLXNET (P<0.01). Moreover, the medicated serum of TLXNET had a protective effect on SH-SY5Y apoptosis induced by Aβ25-35(P<0.01). Conclusion TLXNET could obviously inhibit β-secretase enzyme, and has an antagonistic effect against Aβ neurotoxicity, which suggests that the inhibition of β-secretase enzyme and antagonism against Aβ neurotoxicity are the main anti-AD mechanism of TLXNET .

Alzheimer’s disease; Tongluoxingnao effervescent tablet; SH-SY5Y-APP cells; SH-SY5Y-C99 cells; Aβ generation; Aβ degradation

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.036.html

2016-07-10,

2016-08-06

國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No 2013ZX09103002-008)；四川省學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人培養(yǎng)資金資助項(xiàng)目(No 2015058)；中藥藥理四川省青年科技創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)(No 2014TD0007)

付文君(1992-)，女，碩士生，研究方向：中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)，Tel: 028-61800231，E-mail: fwj10330@163.com；

徐世軍(1975-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥神經(jīng)與精神藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 028-61800231，E-mail:docxu@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.018

A

1001-1978(2016)11-1571-08

R282.71；R329.24；R394.2；R745.702.2；R977.3；R977.6