頭頂一顆珠醇提物對新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷的保護作用

邱 勇，李人鵬，劉 粟，譚志鑫，陳龍全，劉 紅，吳 昊

(湖北民族學院 1. 醫(yī)學院、2. 科技學院、3.附屬民大醫(yī)院, 湖北 恩施 445000)

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頭頂一顆珠醇提物對新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷的保護作用

邱 勇1，李人鵬2，劉 粟3，譚志鑫1，陳龍全1，劉 紅1，吳 昊2

(湖北民族學院 1. 醫(yī)學院、2. 科技學院、3.附屬民大醫(yī)院, 湖北 恩施 445000)

頭頂一顆珠；新生大鼠；缺血/缺氧；腦損傷；神經(jīng)元細胞；凋亡

新生兒缺血/缺氧性腦損傷(hypoxia-ischemic brain damage, HIBD)是新生兒在圍產(chǎn)期發(fā)生窒息缺氧，導致部分或整個腦組織的缺血/缺氧性損傷，從而引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)病變[1-3]。這些嚴重的并發(fā)癥包括學習障礙、癲癇，甚至腦癱和精神發(fā)育遲滯等[4-5]。然而，不管如何改善產(chǎn)科和新生兒護理，HIBD伴隨的嚴重的神經(jīng)功能障礙仍然是一個嚴峻的臨床問題[6]。目前，臨床上對于HIBD患兒改善其神經(jīng)發(fā)育障礙的治療尚無明顯效果。越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激和細胞凋亡是HIBD致病的主要因素[7]。因此，根據(jù)發(fā)病機制去尋求改善腦損害的藥物是國內(nèi)外圍產(chǎn)及新生兒醫(yī)學領(lǐng)域的重要課題。

頭頂一顆珠為百合科延齡草屬植物頭頂一顆珠(TrilliumtschonoskiiMaxim.，TTM)的干燥根及根狀莖，是土家四大神藥之一，具有鎮(zhèn)靜安神、活血止血、解毒等功效[8]。其療效確切，但由于屬于民族藥，主要應(yīng)用于土家族、苗族聚集地，尚未得到廣泛應(yīng)用。目前，有研究表明其具有改善腦缺血，改善學習記憶等作用[9-10]。為進一步了解其功能，促進該藥的應(yīng)用，本文就頭頂一顆珠對新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷進行研究，探討其對HIBD后神經(jīng)細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 頭頂一顆珠由我院中草藥標本中心提供，經(jīng)專家王從榮教授鑒定為頭頂一顆珠。稱量頭頂一顆珠100 g，取粗粉，乙醇回流提取3次，去渣除醇，并濃縮至1 kg·L-1備用。氯化三苯基四氮唑(TTC)：美國 Sigma 公司；甲苯胺藍：上海譜振生物科技有限公司；Bax、Bcl-2抗體：Cell Signaling Technology。

1.2 儀器 CY-12C型便攜式數(shù)字測氧儀(杭州梅城電化分析儀器廠)，T18勻漿機(德國IKA集團)，天能EPS300電泳儀(上海天能科技有限公司)，Tanon 4200全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3 實驗動物及分組 健康7日齡SD大鼠，♀♂不限，體質(zhì)量12 g左右，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號SCXK(鄂)2015-0018。隨機分為假手術(shù)組(n=10)、HIBD組(n=20)、頭頂一顆珠組(n=20)。

1.4 HIBD模型建立及給藥 采用Rice 法制作 HIBD模型[11-12]，即將7日齡SD大鼠右側(cè)頸總動脈分離并結(jié)扎后，置入37 ℃ 的密閉盒子，通入體積分數(shù)為0.08的O2和體積分數(shù)為0.92的 N2的混合氣體，持續(xù)缺氧2 h，缺氧后，放回母鼠籠中喂養(yǎng)。假手術(shù)組只用切開皮膚，找到右側(cè)頸總動脈后分離，不結(jié)扎，再將皮膚縫合，不予以缺氧處理。HIBD模型制備完成后，頭頂一顆珠組立即腹腔注射頭頂一顆珠醇提物(0.1 g · kg-1)，每日1次，連續(xù)給藥3 d。假手術(shù)組和模型組給予相同劑量的生理鹽水。

1.5 TTC染色 治療3 d后，予以乙醚吸入麻醉后斷頭取腦，將腦組織放入-20 ℃冰箱速凍20 min后切片，然后將腦片置于2% 的TTC中，用錫箔紙遮光后，放入37 ℃恒溫箱中孵育15～30 min，并不時翻動腦片，使腦片染色均勻。

1.6 尼氏染色 各組動物麻醉后灌注并斷頭取腦，將腦組織放入4%的多聚甲醛溶液中，24 h 后予以石蠟包埋、切片、脫蠟，再將切片置入1% 的甲苯胺藍水溶液中染20 min后，水洗、酒精分化并脫水、封片。在光鏡下觀察神經(jīng)細胞改變。

1.7 Western blot 取0.1 g腦組織，加RIPA細胞裂解液和PMSF后勻漿，4 ℃、12 000 r· min-1離心20 min，取上清，BCA定量后，加loading buffer水煮10 min，取適量樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用脫脂奶粉室溫封閉3 h，用相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，每次15 min，室溫孵育相應(yīng)的二抗2 h后，繼續(xù)用TBST洗膜3次，再以ECL顯色。隨后用Quantity One軟件測定分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 頭頂一顆珠對HIBD的影響 觀察新鮮腦組織發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腦組織整體形態(tài)完好；模型組可見明顯腫大，且右側(cè)腦部可見缺血的白色壞死區(qū)；治療組可見大腦形態(tài)完好，未見明顯腫脹及壞死。通過TTC染色，了解腦缺血/缺氧的情況。在假手術(shù)組中，TTC染色未見缺血現(xiàn)象；模型組可見右側(cè)腦部出現(xiàn)明顯缺血區(qū)，提示造模成功；頭頂一顆珠治療組腦缺血區(qū)面積較模型組明顯減少，見Fig 1。

2.2 頭頂一顆珠對海馬神經(jīng)元的影響 由Fig 2可見，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元分布整齊、排列密集，且神經(jīng)元胞體大，細胞核大而圓，內(nèi)含有豐富的尼氏小體。模型組海馬神經(jīng)元分布紊亂，數(shù)量較假手術(shù)組明顯減少，且神經(jīng)元胞體形態(tài)缺失或不全，部分尼氏小體可見溶解現(xiàn)象。頭頂一顆珠治療組海馬神經(jīng)元排列有序，數(shù)量稍有減少，但比模型組密集，胞體大小正常，內(nèi)含豐富尼氏小體。

2.3 頭頂一顆珠對皮層神經(jīng)元的影響 假手術(shù)組可見皮層區(qū)的神經(jīng)元細胞排列密集，神經(jīng)元胞體飽滿，細胞核大而圓，內(nèi)含有豐富的尼氏小體。經(jīng)HIBD造模后，可見皮層神經(jīng)元排列較假手術(shù)組明顯稀疏，且神經(jīng)元胞體萎縮，形態(tài)缺失，大部分尼氏小體溶解。頭頂一顆珠治療組可見皮層神經(jīng)元排列較模型組稍密集，且細胞形態(tài)尚可，胞體較飽滿，尼氏小體溶解現(xiàn)象較模型組好轉(zhuǎn)。見Fig 3。

Fig 1 Effect of TTM against HIBD

A: Sham group; B: Model group; C: TTM group

2.4 頭頂一顆珠對凋亡蛋白的影響 與假手術(shù)組相比，HIBD模型組Bcl-2明顯降低(P<0.01)，Bax明顯升高(P<0.01)；經(jīng)頭頂一顆珠治療后，可見Bcl-2明顯升高(P<0.01)，Bax明顯降低(P<0.01)。見Fig 4。

3 討論

HIBD是臨床上常見的兒科疾病，其病因機制復雜多樣。有研究表明，凋亡在整個缺血/缺氧損傷中起著重要的作用[13]，其中可能涉及能量衰竭、自由基損傷、細胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性毒性及caspase依賴介導等最終導致細胞凋亡[14-16]。目前認為，Bcl-2家族是與 HIBD中細胞凋亡關(guān)系最密切的影響因素之一[17]， 其中，Bcl-2及Bax均屬于Bcl-2家族，是存在于線粒體膜上的一對相互拮抗的蛋白。在缺氧/缺血過程中，激活了多種通路的凋亡刺激信號，Bcl-2 及Bax所保持的抑制和促進凋亡的平衡被打破，而線粒體外膜通透性增加，導致促凋亡因子釋放，從而出現(xiàn)細胞凋亡[18]。因此，對神經(jīng)元細胞凋亡的發(fā)生機制及抗凋亡治療的研究可能為HIBD的治療開辟新的途徑，從而減少 HIBD后遺癥的發(fā)生。

目前有研究表明，部分天然藥物的有效成分具有抗神經(jīng)細胞凋亡的作用[19]。因此，我們嘗試應(yīng)用中草藥頭頂一顆珠治療HIBD。通過動物模型的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)HIBD后大腦可見水腫，并出現(xiàn)明顯缺血區(qū)域，伴有神經(jīng)元細胞的大量壞死。通過腹腔注射頭頂一顆珠治療后，發(fā)現(xiàn)頭頂一顆珠可明顯改善腦缺血情況，并可緩解大腦缺血/缺氧后水腫情況，也可減少神經(jīng)元細胞的死亡，同時，頭頂一顆珠可明顯上調(diào)Bcl-2的表達(P<0.01)，減低Bax的表達(P<0.01)。實驗結(jié)果表明，頭頂一顆珠對HIBD具有保護作用，而其機制可能與降低神經(jīng)元細胞凋亡有關(guān)。

Fig 2 Effect of TTM against HIBD induced hippocampus activities

A:Sham group (×100); B: Model group (×100); C: TTM group (×100); D: Sham group (×400); E: Model group (×400); F: TTM group (×400)

Fig 3 Effect of TTM against HIBD induced cortex activities

A: Sham group (×100); B: Model group (×100); C: TTM group (×100); D: Sham group (×400); E: Model group (×400); F: TTM group (×400)

Fig 4 Effect of TTM against HIBD induced related apoptosis protein

##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group

本實驗表明，頭頂一顆珠可改善HIBD引起的腦缺血損傷，并可通過減少神經(jīng)元細胞凋亡來保護腦組織。該研究為治療HIBD的藥物提供了新的方向，并有利于頭頂一顆珠的應(yīng)用。

(致謝：本文實驗在武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院神經(jīng)及免疫相關(guān)疾病實驗室完成，在此，對實驗室的各位老師及同學表示衷心的感謝！)

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The protective effects of ethanol extract ofTrilliumtschonoskiiMaxim.on hypoxia- ischemia brain damage in neonatal rats

QIU Yong1, LI Ren-peng2, LIU Su3, TAN Zhi-xin1, CHEN Long-quan1, LIU Hong1, WU Hao2

(1.CollegeofMedicine, 2.ScienceandTechnologyCollege, 3.AffiliatedHospital，HubeiUniversityforNationalities,EnshiHubei445000,China)

Aim To investigate the effect ofTrilliumtschonoskiiMaxim(TTM) ethanol extract on hypoxia ischemia brain damage (HIBD) in neonatal rats and potential mechanisms. Methods Fifty healthy SD rats of 7 day-old were randomly divided into three groups: the sham operation group (n=10), the model group (n=20) and TTM treatment group (n=20), which received 3-day intraperitoneal injection of normal saline or ethanol extract of TTM respectively. TTC staining and Nissl staining were performed to detect the cerebral ischemia area and neuronal death. Western blot was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax. Results The brain tissue of model group was slightly swollen, and white necrotic zone induced by ischemia occured on the right side of the brain, while the brain morphology of TTM treatment group was good. After TTC staining, ischemia zone was clearly seen on the right side of the brain in model group, while after TTM treatment, the size of ischemic zone was decreased. Compared with the model group , Nissl staining showed the neuronal cells increased in TTM treatment group. Western blot showed the expression of Bcl-2 protein in TTM group increased than that in HIBD model group (P<0.01),while the expression of Bax protein decreased (P<0.01). Conclusion TTM therapy is beneficial for HIBD,which may be related to reducing neuronal apoptosis.

TrilliumtschonoskiiMaxim.; neonatal rats; hypoxic-ischemic; brain damage; neuronal cells; apoptosis

2016-07-03，

2016-07-27

湖北省教育廳科研基金資助項目(No D200729005)；湖北民族學院科技學院自然科學項目(No KJZ201610)

邱 勇(1989-)， 男，碩士生，研究方向：中醫(yī)藥對神經(jīng)疾病的研究，E-mail：backblack10@163.com；

劉 紅(1963-)，男，教授，碩士生導師，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail: 2548449651@qq.com；

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.028.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.014

A

1001-1978(2016)11-1548-05

R-332；R284.1；R322.81；R329.25；R338.1；R743.022；R743.053.1摘要:目的 探討頭頂一顆珠醇提物對新生大鼠缺血/缺氧性腦損傷(HIBD)的保護作用及可能機制。方法 50只7日齡SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=20)、頭頂一顆珠治療組(n=20)，各組分別予以3 d相應(yīng)的生理鹽水及頭頂一顆珠醇提物腹腔注射。分別通過氯化三苯基四氮唑(TTC)和尼氏染色檢測腦缺血及神經(jīng)細胞死亡情況，通過Western blot檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達。結(jié)果 HIBD模型組可見腦組織稍有腫大，且右側(cè)腦部可見缺血的白色壞死區(qū)；治療組可見大腦形態(tài)完好，未見明顯腫脹及壞死，TTC染色后，模型組可見右側(cè)腦部出現(xiàn)明顯缺血區(qū)，經(jīng)治療后缺血區(qū)域減少。尼氏染色結(jié)果提示模型組可見神經(jīng)元細胞減少，而治療后神經(jīng)元細胞增加。Western blot顯示HIBD后Bcl-2表達減少(P<0.01)，Bax表達增加(P<0.01)，而經(jīng)過頭頂一顆珠治療后，Bcl-2表達增加(P<0.01)，Bax表達降低(P<0.01)。結(jié)論 頭頂一顆珠對HIBD具有保護作用，其機制可能與降低神經(jīng)元細胞凋亡有關(guān)。

吳 昊(1986-)，男，碩士，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，E-mail：3640689@qq.com