補體旁路激活致小鼠急性肺損傷的炎癥病理機制研究

郭 靜，李 敏，楊付梅，孫黔云

(1.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室藥理與活性篩選中心，貴州 貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

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補體旁路激活致小鼠急性肺損傷的炎癥病理機制研究

郭 靜1，李 敏2，楊付梅1，孫黔云1

(1.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室藥理與活性篩選中心，貴州 貴陽 550002；2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

目的 研究補體旁路激活所導致的小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生發(fā)展及相關指標的變化，為藥物篩選及干預研究提供理想的小鼠肺部急性炎癥病理模型。方法 SPF級昆明小鼠尾靜脈注射眼鏡蛇毒因子(CVF)激活血清補體旁路途徑，根據(jù)注射后取樣時間不同，分為15 min、30 min、1 h、2 h、6 h組，同時平行設置PBS對照組。取肺組織測定肺系數(shù)、肺含水量，并行病理切片檢查，肺組織勻漿測定髓過氧化物酶(MPO)活性；制備支氣管肺泡灌洗液(BALF)和血清，測定BALF中的細胞數(shù)和蛋白含量，采用ELISA法分別測定BALF和血清中的IL-6、TNF-α、P-selectin和ICAM-1含量。結果 小鼠尾靜脈注射CVF后可致肺部炎性細胞明顯浸潤，MPO活性明顯上調(diào)，BALF中細胞總數(shù)和蛋白濃度明顯增加。BALF和血清中的IL-6、TNF-α、P-selectin水平及血清中ICAM-1的含量均明顯升高，其中，BALF中P-selectin含量在30 min時間點出現(xiàn)1個小高峰，IL-6和TNF-α在1 h時間點出現(xiàn)1個高峰，在2 h時間點均無進一步上升，但在6 h時間點各指標均又明顯升高；血清中IL-6和TNF-α含量在1 h時間點達到峰值，隨后濃度降低，P-selectin和ICAM-1水平隨著時間的延長持續(xù)上升。而肺系數(shù)、肺含水量及BALF中ICAM-1的含量與PBS組相比無明顯變化。結論 補體旁路激活可導致小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生，以30 min至1 h的炎癥反應最為明顯，該實驗可以為藥物篩選及干預研究提供理想的動物肺部急性炎癥病理模型。

眼鏡蛇毒因子；急性肺損傷；小鼠模型；補體旁路；炎癥；黏附分子；炎性介質(zhì)

補體旁路激活導致的炎癥反應在一系列臨床急危重癥中扮演重要角色[1-2]，其中補體旁路激活導致的肺部急性炎癥較為典型。補體旁路激活可以誘導大鼠急性肺損傷[3]，但是否能引起小鼠發(fā)生急性肺損傷尚不清楚。天然產(chǎn)物是新藥開發(fā)的重要來源，而絕大多數(shù)分離純化獲得的天然產(chǎn)物樣品無法滿足大鼠實驗用量的需要。因此，基于大規(guī)模篩選貴州民族藥資源相關活性成分的需要，我們選用小鼠開展補體旁路激活誘導急性肺損傷的研究，以期為藥物篩選及干預研究提供理想的動物肺部急性炎癥病理模型。

1 材料

1.1 動物 SPF級昆明小鼠80只，♂♀各半，體質(zhì)量18 g～20 g，購自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證書：SCXK-(軍)-2012-0011。所有的操作和實驗流程均遵守《實驗動物管理條例》。實驗環(huán)境：恒溫(22±2)℃，濕度60%～70%，自由飲水和進食。

1.2 試劑與儀器 眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)，為本課題組制備，其分離純化方法同文獻[4]；MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:20160407)；小鼠IL-6、TNF-α、P-selectin 和ICAM-1 ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號:20160401)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號:20151124)；Revco超低溫冰箱(美國Thermo公司)；Spectra MAX-190連續(xù)波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Elix純水系統(tǒng)和Milli Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；5810R 冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Nikon TS100 倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 80只昆明小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后稱重，分為空白對照組(PBS組)、給藥組(CVF組)。給藥組尾靜脈注射25 μg·kg-1的CVF，空白對照組尾靜脈注射等體積PBS。每組再按給藥后取材時間的不同分為5組，分別為15 min、30 min、1 h、2 h、6 h 組，每組8只。

2.2 取材及標本制備 給藥后15 min、30 min、1 h、2 h、6 h各組摘眼球取血，靜置3 h,4℃ 3 000 r·min-1離心10 min制備血清；然后處死小鼠，開胸腔輕輕挑起右肺，以動脈夾夾住右肺，暴露氣管，行氣管插管，左肺用1.2 mL 4℃生理鹽水分3次進行支氣管肺泡灌洗，每次0.4 mL,反復灌洗3次，得BALF,行細胞計數(shù)。計數(shù)后BALF 3 000 r·min-1離心10 min，取上清液分裝，-80℃凍存?zhèn)溆?。取右肺稱重后，將右肺上葉置于-80℃凍存。右肺中葉稱濕重，然后70℃烘烤48 h至恒重，計算肺水含量。右肺下葉置于10%甲醛溶液中固定，進行病理切片檢查。

2.3 指標檢測

2.3.1 肺系數(shù)、肺含水量及MPO測定 稱取右肺重量，根據(jù)(右肺重量/小鼠體質(zhì)量)公式，計算右肺系數(shù)。右肺上葉取出后，-80℃凍存用于MPO測定，具體方法按照試劑盒說明書進行。右肺中葉稱濕重，然后以70℃烘烤48 h至恒重，根據(jù)公式：(濕重-干重)/ 濕重×100%，計算肺含水量。

2.3.2 BALF細胞計數(shù) BALF回收率約62.5%，行細胞計數(shù)，計算計數(shù)板上5個大格的細胞總數(shù)n，按公式：細胞數(shù)(個· mL-1)=細胞總數(shù)n/80×400×104。

2.3.3 BALF蛋白濃度的測定 取BALF上清液，按照試劑盒說明書，采用BCA法檢測，用酶標儀在562 nm測定吸光度值并計算BALF中蛋白濃度。

2.3.4 炎癥介質(zhì)和黏附分子的測定 取BALF上清液和血清，按照試劑盒說明書，采用ELISA法檢測，用酶標儀在450 nm測定吸光度值，并計算IL-6、TNF-α、P-selectin和ICAM-1的含量。

2.3.5 肺組織病理學檢查 灌洗結束后，取右肺下葉以10%甲醛溶液固定，制作常規(guī)石蠟病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

3 結果

3.1 小鼠肺組織相關指標的檢測 與PBS組相比，CVF組小鼠的肺系數(shù)和肺含水量基本無明顯變化；BALF細胞數(shù)量和MPO活性均明顯增加(P<0.01)。CVF組間比較BALF細胞數(shù)量1 h時間點明顯高于15 min時間點，而2 h時間點與1 h相比差異沒有顯著性，到6 h時間點BALF細胞數(shù)量和MPO活性又明顯升高。BALF中蛋白含量升高，在30 min、6 h兩個時間點差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)(Tab 1)。

3.2 病理組織學觀察 病理切片結果顯示，PBS組肺組織結構正常，少見炎性細胞浸潤；CVF組肺組織結構無明顯改變，肺組織內(nèi)炎性細胞明顯浸潤，以1 h最為明顯，見Fig 1。

3.3 BALF中炎性介質(zhì)和黏附分子的變化情況 與PBS組比較，CVF各組BALF中IL-6、TNF-α、P-selectin水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，其中P-selectin水平在30 min時間點出現(xiàn)1個小高峰，IL-6和TNF-α的水平在1 h時間點呈現(xiàn)1個小高峰，隨后各指標水平有所降低，至6 h時間點又明顯上調(diào)。而不同時間點的ICAM-1含量無明顯變化(P>0.05)，見Fig 2。

3.4 血清中炎性介質(zhì)和黏附分子的變化情況 與PBS組比較，CVF各組血清中IL-6、TNF-α、P-selec-tin、ICAM-1水平明顯升高(P<0.05，P<0.01)，其中IL-6和TNF-α的水平在1 h時間點達到峰值，隨后含量降低；血清中P-selectin 和ICAM-1的含量隨時間的延長持續(xù)上升，見Fig 3。

Tab 1 Related lung items of mice at different time ±s, n=8)

*P<0.05,**P<0.01vsPBS control group;##P<0.01vs15 min CVF group

Fig 1 Histological examination of lung tissue(×100)

A～E: PBS group, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h respectively; F～J: CVF group, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h respectively

Fig 2 Concentration of inflammatory mediator and adhesion molecule in ±s,n=8)

A:IL-6; B: TNF-α; C: P-selectin; D: ICAM-1. A,B,C,D:*P<0.05,**P<0.01vsPBS control group;##P<0.01vs15 min CVF group;△△P<0.01vs15 min,30 min,1 h and 2 h CVF groups.B:△P<0.05vs1 h and 2 h CVF groups;▲▲P<0.01vs15 min and 30 min CVF groups

4 討論

CVF是來源于眼鏡蛇毒的一種高效補體激活蛋白，CVF在血清中可與B因子形成具有C3/C5轉化酶活性的CVFBb，從而激活補體替代途徑，產(chǎn)生大量C3a、C5a及攻膜復合物(MAC)[5]，導致炎性細胞的聚集和活化以及內(nèi)皮細胞和血小板的炎性活化，CVF激活補體旁路的方式與體內(nèi)病理狀態(tài)下的補體活化高度一致。我們之前的研究表明，通過尾靜脈注射給予小鼠CVF，在0.02 U·g-1(即10 μg·kg-1)的劑量下短時間內(nèi)就可以完全激活血清補體[6]。本研究中我們選用25 μg·kg-1的劑量，這一劑量高于前期采用的激活小鼠血清補體的劑量，因此可確切誘導小鼠血清補體旁路的過度激活。本實驗我們利用CVF開展了補體旁路激活致小鼠急性肺損傷的研究，結果表明補體旁路激活可以導致小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生，其中以30 min至1 h的炎癥反應最為明顯。

Fig 3 Concentration of inflammatory mediator and adhesion molecule in ±s,n=8)

A:IL-6; B: TNF-α; C: P-selectin; D: ICAM-1.*P<0.05,**P<0.01vsPBS control group;##P<0.01vs15 min CVF group;△△P<0.01vs15 min,30 min,1 h and 2 h CVF groups

研究結果顯示，補體旁路激活后引起小鼠肺部的炎癥細胞明顯聚集和浸潤，MPO活性明顯上調(diào)，BALF中蛋白含量增加，提示微血管通透性增加。但從病理學角度來講，補體旁路激活可以引起小鼠肺部的急性炎癥變化，但損傷癥狀并不明顯。上述結果表明，在我們設置的時間點，補體旁路過度激活可以引起小鼠肺部急性炎癥的發(fā)生。而在炎癥發(fā)生的過程中，肺系數(shù)和肺含水量無明顯變化，這一結果可能與補體旁路激活誘導小鼠肺部急性炎癥反應的病變程度有關，也可能與我們實驗設置的時間點有關。

P-selectin和ICAM-1是一類在炎癥啟動和發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用的黏附分子。CVF進入血液后，通過激活補體活化內(nèi)皮細胞，活化的內(nèi)皮細胞表達選擇素等黏附分子，在血管內(nèi)皮上黏附炎癥細胞，從而啟動炎癥和引發(fā)后續(xù)效應。P-selectin主要分布于內(nèi)皮細胞和血小板，可以介導粒細胞和單核細胞在內(nèi)皮細胞表面滾動和最初結合，啟動炎癥的早期反應[7]。本研究顯示，CVF組在給藥30 min后,BALF中P-selectin含量即有明顯增加，在血清中隨時間延長P-selectin水平也持續(xù)上升，因此P-selectin的提高間接提示了炎癥反應的啟動和持續(xù)。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族中的成員之一，可引起炎癥細胞牢固黏附并跨內(nèi)皮移行至血管外，參與炎癥的發(fā)生發(fā)展[8]，ICAM-1通常在炎癥反應數(shù)小時后才會出現(xiàn)高峰。我們之前的研究結果也顯示，補體旁路激活刺激人微血管內(nèi)皮細胞后的數(shù)小時內(nèi)ICAM-1就會出現(xiàn)表達高峰[9]。在本研究中，未檢測到注射CVF后BALF中ICAM-1的表達上調(diào)，但在血清中可以看到ICAM-1含量在1 h時間點后開始明顯增加，其原因尚待進一步研究。

IL-6和TNF-α是介導急性期炎癥反應重要的炎癥介質(zhì)，廣泛參與了炎癥反應的啟動、放大過程，可激活內(nèi)皮細胞產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)和黏附分子，引起急性期反應，啟動炎癥的級聯(lián)反應[10-11]。本研究中，注射CVF后BALF和血清中IL-6和TNF-α的變化模式不同，BALF中IL-6和TNF-α的水平在1 h和6 h時間點呈現(xiàn)雙高峰，血清中IL-6和TNF-α的水平在1 h時間點達到峰值，隨后表達降低，說明肺部中的炎癥反應持續(xù)進行，而血液中的炎癥效應呈一過性，提示肺部組織是補體旁路激活引發(fā)炎癥效應的主要效應靶器官之一。在我們測定的指標中，P-selectin、ICAM-1、IL-6和TNF-α雖然在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中分別扮演著不同的角色，但它們共同參與和推動了這一急性炎癥的病理變化過程。

綜上所述，補體旁路激活可以在小鼠肺部引起急性炎癥，主要表現(xiàn)為肺部組織炎性細胞浸潤、黏附分子和炎性因子釋放增加，其病理變化以靜脈注射后30 min至1 h最為明顯，呈現(xiàn)出急性肺損傷的早期炎癥病理變化，本研究可以為后續(xù)的模型構建和篩選實驗提供明確的參考依據(jù)。

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Inflammatory mechanism of acute lung injury in mice induced by activation of complement alternative pathway

GUO Jing1, LI Min2, YANG Fu-mei1, SUN Qian-yun1

(1.CenterforPharmacologyandDrugScreening,KeyLaboratoryofChemistryforNaturalProducts,GuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China;2.GeneralWard,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang550002,China)

Aim To study the development of acute lung inflammation in mice induced by activation of the complement alternative pathway and the changes of the related indicators, and to provide an ideal pathological model of acute lung inflammation in mice for drug screening and intervention.Methods Cobra venom factor(CVF) was used to activate complement alterna-tive pathway of SPF Kunming mice by intravenous injection. According to different sampling time, the mice were divided into 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h group, and the parallel PBS control groups were set at the same time. Lung coefficient, lung water content, myeloperoxidase(MPO) activity, BALF cell number and protein content were tested. The pathological changes of lung tissue were observed by HE staining. The concentration of IL-6, TNF-α, P-selectin and ICAM-1 in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and serum were determined by ELISA.Results CVF caused pulmonary inflammatory cell infiltration in mice obviously. Compared with PBS groups, MPO activity of lung tissue, BALF cell and the protein concentration were significantly increased. The contents of IL-6, TNF-α, P-selectin in BALF and serum were increased, and the content of ICAM-1 in serum was also increased. The content of P-selectin in BALF reached the first peak at 30 min point, the content of IL-6 and TNF-α in BALF reached the first peak at 1 h point, but the indicators had no further changes at 2 h point, and all the indicators rose again at 6 h point. The levels of IL-6 and TNF-α in serum reached peak at 1 h point,then the content showed lower levels at the subsequent time points. The levels of P-selectin and ICAM-1 in serum increased along the time. Lung coefficient, lung water content and ICAM-1 of the BALF showed no significant alteration.Conclusion The activation of the complement alternative pathway can lead to acute lung inflammation in mice and the inflammatory response is the most obvious at 30 min to 1 h. The study could provide an ideal pathological model of acute lung inflammation in mice for drug screening and intervention.

cobra venom factor(CVF)；acute lung injury；mouse model；alternative complement pathway；inflammation; adhesion molecules；inflammatory mediator

2016-07-22，

2016-08-22

國家自然科學基金資助項目(No 30560035)；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊項目[No 黔科合平臺人才(2016)5625號]；貴州省高層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項目(百層次)[No黔科合人才(2016)4018號]

郭 靜(1988-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學，E-mail：gjing21@sina.com；

李 敏(1967-)，女，主任醫(yī)師，研究方向：急性肺損傷的發(fā)病機制及防治，通訊作者，E-mail：limin_67@hotmail.com；

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.018.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.009

A

1001-1978(2016)11-1521-06

R-332；R322.35；R364.5；R392.11；R392.12； R563.022；R996.3

孫黔云(1968-)，男，博士，研究員，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，E-mail：sunqy@hotmail.com