鱖肝臟和心臟生物鐘基因表達節(jié)律分析

鄢慧玲褚武英吳 萍，汪建華，劉小燕張建社

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410128； 2. 長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系， 長沙 410003；3. 湖南大學(xué)生物學(xué)院， 長沙 410082； 4. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 桂林 541004）

鱖肝臟和心臟生物鐘基因表達節(jié)律分析

鄢慧玲1，2褚武英2吳 萍2，3汪建華2，4劉小燕1張建社2

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長沙 410128； 2. 長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系， 長沙 410003；3. 湖南大學(xué)生物學(xué)院， 長沙 410082； 4. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 桂林 541004）

在12h光照、12h黑暗交替（Light-Dark； LD）光制下， 研究分析了褪黑素和皮質(zhì)醇水平在鱖血清中的晝夜變化規(guī)律， 以及13個生物鐘基因（Arntl1、Clock、Cry1a、Cry3、Cry-dash、Npas2、Npas4、Nr1d1、Nr1d2、Per1、Per3、Rora和Tim）在鱖（Siniperca chuatsi）肝臟和心臟中的晝夜表達規(guī)律。試驗在一晝夜內(nèi)的ZT0（06:00）、ZT3（09:00）， ZT6（12:00）， ZT9（15:00）， ZT12（18:00）， ZT15（21:00）， ZT18（24:00）， ZT21（03:00， 2ndd），ZT24（06:00， 2ndd） （Zone time， ZT） 9個時間點隨機抽取3尾鱖采集其血清、肝臟和心臟。經(jīng)SPSS 單因素方差分析和Matlab余弦分析， 結(jié)果顯示: 鱖血清中褪黑素和皮質(zhì)醇含量均呈現(xiàn)出晝夜節(jié)律性振蕩， 褪黑素含量白天顯著降低（P≤0.05）， 夜間顯著上升， 皮質(zhì)醇含量白天緩慢降低， 夜間ZT15（21:00）-ZT18（24:00）顯著升高， 隨后開始緩慢降低； 兩種激素最低相位都為ZT15（21:00）。在13個生物鐘基因中， Cry-dash、Npas4、Nr1d1、Per1和Tim 5個基因在鱖肝臟內(nèi)具有明顯的晝夜節(jié)律性， 其中Npas4、Nr1d1、Per1、Tim的表達規(guī)律相似， 皆呈現(xiàn)出光照階段表達降低， 黑暗階段表達升高的趨勢； 但Cry-dash則表現(xiàn)出光照階段先升高后降低， 黑暗階段先降低后升高的規(guī)律。在鱖心臟中， Arntl1、Clock、Cry1a、Npas2、Nr1d1、Nr1d2、Per3、Rora和Tim 9個基因都表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律， 表達趨勢分為兩種: Arntl1、Clock、Nr1d2的表達量在光照階段降低， 黑暗階段升高； 而Cry1a、Npas2、Nr1d1、Per3、Rora和Tim的表達量在ZT0（06:00）-ZT15（21:00）持續(xù)低水平，ZT15（21:00）-ZT18（24:00）表達量顯著上升， ZT18（24:00）-ZT21（03:00）表達量降低。研究結(jié)果表明: 生物鐘基因在鱖肝臟和心臟中所表達的晝夜節(jié)律不同。

鱖； 晝夜節(jié)律； 生物鐘基因； 褪黑素； 皮質(zhì)醇

晝夜節(jié)律是一種普遍存在于各種生物體內(nèi)的周期約為24h的生理現(xiàn)象。機體的睡眠-蘇醒循環(huán)、體溫的波動、激素水平的漲落、識別和記憶能力的變化等都具有晝夜節(jié)律性， 其標志是機體核心溫度和血漿中褪黑素、皮質(zhì)醇的水平［1］。生物體通過褪黑素和皮質(zhì)醇分泌的晝夜節(jié)律的改變， 將外界信息傳遞給體內(nèi)有關(guān)的組織器官， 使各組織內(nèi)相關(guān)生物鐘基因的表達作出相應(yīng)的改變， 從而使它們的功能活動適應(yīng)環(huán)境的變化［2］。即使在缺乏外界因素的條件下， 如光照和溫度等， 晝夜節(jié)律仍能維持原有的生理周期， 具有內(nèi)源性和自我維持運轉(zhuǎn)的特點［3］。晝夜節(jié)律發(fā)生的物質(zhì)基礎(chǔ)是分子計時器， 即晝夜節(jié)律生物鐘， 所有的機體生命活動和生理功能都受到生物鐘的調(diào)控［4，5］。

在多細胞生物中， 晝夜節(jié)律生物鐘可分為主鐘（中樞鐘）和外周鐘（細胞鐘）。主鐘位于中樞部位，外周鐘位于組織（腎臟、心臟、肝臟、骨骼肌等）細胞內(nèi)［6］。生物鐘系統(tǒng)主要由三部分構(gòu)成: 輸入通道、核心振蕩器和輸出通道［7，8］。外界環(huán)境中的光和溫度等變化由輸入途徑傳送至核心振蕩器， 并經(jīng)過一系列的反應(yīng)， 通過輸出途徑驅(qū)動生物節(jié)律的產(chǎn)生。非哺乳類脊椎動物的核心振蕩器位于松果體內(nèi)［9］， 是一種“轉(zhuǎn)錄-翻譯-抑轉(zhuǎn)錄”機制構(gòu)成的反饋環(huán)， 其中的生物鐘基因在許多物種中表達高度保守［10］。在哺乳動物中， 位于主反饋環(huán)路的基因包括Clock及其同源基因Npas2、Arntl1、Per1、Per2、Cry1、Cry2［7］。其中正向調(diào)節(jié)因子包括Clock和Arntl1， 抑制因子包括Per和Cry。為保證節(jié)律振蕩的精確性和穩(wěn)定性， 還存在另一個反饋環(huán)路， 該調(diào)節(jié)環(huán)路包括了通過Clock: Arntl1二聚體轉(zhuǎn)移活化的維A酸相關(guān)孤核受體Rora［11］， 且Rora能激活A(yù)rntl1的轉(zhuǎn)錄。

Science Foundation of China （31472256， 31230076）； Hunan Provincial Natural Science Foundation of China （14JJ2135）］

目前在魚類中， 生物鐘基因的研究對象主要為一些模式物種， 如斑馬魚（Danio rerio）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、綠河豚（Tetraodon nigroviridis）、青鳉（Oryzias latipes）等［12—14］； 僅有少量的養(yǎng)殖物種， 如歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鮭（Salmo salar）、大西洋鱈（Gadus morhua）等［15—20］進行過生物鐘相關(guān)研究。鱖作為一種典型的肉食性魚類， 有著肉食魚類的生活共性， 是研究晝夜節(jié)律的理想的非模式動物。本試驗旨在通過對鱖（Siniperca chuatsi）LD光制（06:00—18:00為光照期， 18:00至第2天06:00為黑暗期， 模擬自然光照條件下約06:00天亮， 18:00天黑的模式）下褪黑素和皮質(zhì)醇水平的測定， 分析晝夜階段鱖激素水平的差異性， 以及對肝臟及心臟中各生物鐘基因mRNA表達量的測定， 檢驗分析各基因在不同組織器官內(nèi)mRNA表達的晝夜節(jié)律性， 初步探討鱖的晝夜生理規(guī)律， 為進一步研究鱖晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集及處理

試驗鱖為翹嘴鱖， 取自常德興達鱖繁養(yǎng)場， 皆為體重（500±50） g的成魚， 共54尾， 隨機分為9組， 每組分別養(yǎng)殖于同一規(guī)格的不同水族箱內(nèi)， 在LD光制（12h光照， 12h黑暗）下馴養(yǎng)21d后取樣。樣品的采集在一晝夜內(nèi)進行， 每間隔3h（每個時間點分別為06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00和24:00、第2天03:00、06:00； 分別對應(yīng)區(qū)時（Zone time， ZT） ZT0、ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21和ZT24）在同一組中隨機抽取3尾鱖于尾靜脈處用5 mL無菌注射器抽取3 mL新鮮血液，分開放入1.5 mL離心管中， 4℃靜置過夜， 隔天用離心機2000 r/min離心15min， 血清充分析出后用200 μL移液槍將血清吸取至無菌離心管內(nèi)， -80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?每個時間點抽血后的3尾鱖立即活體解剖取其肝臟和心臟， 迅速置于液氮內(nèi)， 隨后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 褪黑素的測定

血清褪黑素測定按照魚褪黑素（Melatonin）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（路非凡生物科技有限公司）的操作說明書進行， 最后于酶標儀（Thermo scientific Multiskan GO）上測定結(jié)果。

1.3 皮質(zhì)醇的測定

根據(jù)魚皮質(zhì)醇（cortisol）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（路非凡生物科技有限公司）使用說明書的方法操作， 樣品為鱖血清， 最終結(jié)果采用酶標儀（Thermo scientific Multiskan GO）進行測定。

1.4 總RNA提取

采用Trizol法將采集的鱖肝臟及心臟提取總RNA， 并在1%的瓊脂糖/GoldView凝膠中對所提取的總RNA質(zhì)量和濃度進行電泳檢測。

1.5 cDNA合成

逆轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒使用說明將總RNA合成為cDNA模板。反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件為: 42℃ 2min； 37℃ 15min； 85℃ 5s；-40℃冰箱內(nèi)保存。

1.6 引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中已登錄的鱖（Siniperca chuatsi）Arntl1 （KP702269）、Clock （KP702271）、Cry1a（KP702272）、Cry3 （KP702274）、Cry-dash（KP702275）、Npas2 （KP702276）、Npas4 （KP702277）、Nr1d1 （KP702278）、Nr1d2 （KP702279）、Per1（KP702280）、Per3 （KP702282）、Rora （KP702283）、Tim （KP702284）和RPL13 （BC063378）的序列， 用Primer premier 5.0軟件設(shè)計用于熒光定量PCR反應(yīng)的特異性引物（表 1）， 引物由上海鉑尚公司合成。

1.7 熒光定量PCR

分別取鱖肝臟和心臟總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA模板在熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX96TMReal-Time System）上進行qRT-PCR反應(yīng)， 總反應(yīng)體積為25 μL， 反應(yīng)體系為: TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII （Tli RNaseH Plus） 12.5 μL， dH2O 10.5 μL，cDNA 1 μL， 上下游引物各0.5 μL。PCR反應(yīng)程序為: 95℃ 1min； 95℃ 5s； 56℃ 30s； 39個循環(huán)。將RPL13設(shè)為內(nèi)參， 每個待測樣品和內(nèi)參均設(shè)3個重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

熒光定量數(shù)據(jù)用Bio-Rad CFX Manager軟件導(dǎo)出至Excel 2007后進行初步處理， 按照公式2-ΔΔCt計算出目的基因的表達量。用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）， P≤0.05表示具有時間差異顯著性。用MatLab軟件進行余弦分析，擬合的余弦方程為: ?（t）=M+Acos（t/pi/12-φ）； 其中?（t）是指在給定時間基因的表達水平； M為中值， 即波動變化的中線； A為節(jié)律振蕩的振幅； φ為峰值相位， 是振蕩達到峰值的時刻， 可根據(jù)（360°/24h）將其換算成ZT時間點； 通過計算噪聲/信號振幅比SE（A）/A（P＜0.3）來鑒定基因表達的節(jié)律性。同時滿足ANOVA（P≤0.05）和余弦分析SE（A）/A（P＜0.3）則確定該基因的表達具有晝夜節(jié)律［21］。

表 1 熒光定量引物Tab. 1 The primers of qRT-PCR

2 結(jié)果

2.1 血清褪黑素水平變化

測定結(jié)果顯示: 鱖血清中褪黑素的含量呈現(xiàn)出兩極性的變化。光照開始時激素的含量為最高峰，在光照條件下（ZT0-ZT12）激素水平顯著降低（P≤0.05）， 并在劃定的黑暗階段開始3h后（ZT15）水平降到最低點， 但在持續(xù)的黑暗環(huán)境中， 激素含量于（ZT15-ZT18）之間顯著增高， 并在（ZT18-ZT24）保持恒定高水平（圖 1）。

2.2 血清皮質(zhì)醇水平變化

皮質(zhì)醇在鱖血清中表現(xiàn)出的水平變化為: 在光周期階段（ZT0-ZT12）直至黑暗階段的第一個時間點（ZT15）基本保持緩慢下降趨勢， 并在ZT15達到最低值， 隨后在3h內(nèi)（ZT15-ZT18）顯著增加（P≤0.05）至最高值后， 繼續(xù)保持緩慢下降的趨勢（圖 2）。

2.3 生物鐘基因在鱖肝臟內(nèi)的晝夜節(jié)律性表達

LD光制下的不同晝夜時點， 鱖各生物鐘基因在肝臟內(nèi)mRNA表達的統(tǒng)計分析結(jié)果為: Arntl1、Clock、Cry3、Cry-dash、Npas2、Npas4、Nr1d1、 Per1、Tim具有明顯的時間差異顯著性（P≤0.05）（圖 3）。其中， 正向調(diào)節(jié)因子Arntl1 （P=0.50）、Clock（P=0.74）及Npas2 （P=0.57）雖然在各時間點上有顯著性差異（P≤0.05）， 但在鱖肝臟中的表達無晝夜節(jié)律性（P≥0.3）， Npas4 （P=0.13）作為其同源基因， 呈現(xiàn)晝低夜高的節(jié)律性振蕩， 達到峰值的時間為ZT22.84。在作為抑制因子的基因中， Cry-dash（P=0.05）的峰值相位在光照階段（ZT5.46）， mRNA表達趨勢為光周期先升高后降低， 暗周期先降低后升高， Per1 （P=0.06）的峰值相位為ZT1.83， 節(jié)律變化為晝低夜高， 而Cry3 （P=0.91）無節(jié)律性振蕩（P≥0.3），Cry1a （P=0.18）與Per3 （P=0.25）則無表達的時間差異顯著性（P＞0.05）。另一反饋環(huán)路中， Rora（P=0.29）也未在肝臟內(nèi)表現(xiàn)出各時間點的差異顯著性（P＞0.05）。Nr1d1 （P=0.25）峰值相位為ZT23.30，節(jié)律振蕩趨勢為晝低夜高， 但同一基因家族中的Nr1d2 （P=0.01）未表現(xiàn)出時間差異性（P＞0.05）。Tim （P=0.08）的mRNA表達的趨勢為晝低夜高， 峰值相位為ZT22.54。著性差異（P≤0.05）， 但在鱖肝臟中的表達無晝夜節(jié)律性（P≥0.3）， Npas4 （P=0.13）作為其同源基因， 呈現(xiàn)晝低夜高的節(jié)律性振蕩， 達到峰值的時間為ZT22.84。在作為抑制因子的基因中， Cry-dash（P=0.05）的峰值相位在光照階段（ZT5.46）， mRNA表達趨勢為光周期先升高后降低， 暗周期先降低后升高， Per1 （P=0.06）的峰值相位為ZT1.83， 節(jié)律變化為晝低夜高， 而Cry3 （P=0.91）無節(jié)律性振蕩（P≥0.3），Cry1a （P=0.18）與Per3 （P=0.25）則無表達的時間差異顯著性（P＞0.05）。另一反饋環(huán)路中， Rora（P=0.29）也未在肝臟內(nèi)表現(xiàn)出各時間點的差異顯著性（P＞0.05）。Nr1d1 （P=0.25）峰值相位為ZT23.30，節(jié)律振蕩趨勢為晝低夜高， 但同一基因家族中的Nr1d2 （P=0.01）未表現(xiàn)出時間差異性（P＞0.05）。Tim （P=0.08）的mRNA表達的趨勢為晝低夜高， 峰值相位為ZT22.54。

圖 1 LD光制下鱖血清中褪黑素的水平變化Fig. 1 Changes in the blood plasma Melatonin level of Siniperca chuatsi under LD light conditions

圖 2 LD光制下鱖血清中皮質(zhì)醇的水平變化Fig. 2 Changes in the blood plasma Cortisol level of Siniperca chuatsi under LD light conditions

圖 3 LD光制下鱖肝臟生物鐘基因mRNA晝夜節(jié)律性表達的時間模式Fig. 3 Temporal pattems of clock genes mRNA circadian expressions in the liver of Siniperca chuatsi under LD light conditions

2.4 生物鐘基因在鱖心臟中的晝夜節(jié)律性表達

在一晝夜內(nèi)的不同時點， 生物鐘基因于鱖心臟內(nèi)mRNA表達的結(jié)果顯示: Arntl1、Clock、Cry1a、Npas2、Nr1d1、Nr1d2、Per3、Rora、Tim具有時間差異顯著性（P≤0.05）（圖 4）。在正向調(diào)節(jié)因子中，Arntl1 （P=0.00）的節(jié)律趨勢為白天表達量降低， 夜間表達量升高， 其峰值相位為ZT21.70， Clock（P=0.29）的峰值相位為ZT21.89， 振蕩趨勢為晝低夜高， Npas2 （P=0.14）雖然也呈現(xiàn)出晝低夜高的振蕩規(guī)律， 但其峰值相位為ZT18.22， 與Arntl1和Clock略有不同， 而Npas4 （P=0.12）在心臟中的表達沒有顯著的時間差異（P＞0.05）。在抑制因子中， Cry1a（P=0.13）則表現(xiàn)出另一種振蕩趨勢， 光照期先降低后升高， 黑暗期先升高后降低， 峰值相位為ZT18.45，Per3 （P=0.13）與Cry1a的表達規(guī)律相似， 峰值相位為ZT18.07， 但同為抑制因子的Cry3 （P=0.25）、Per1（P=0.01）無表達的時間差異性（P＞0.05）， Cry-dash（P=0.43）無節(jié)律性（P≥0.3）。Rora （P=0.04）位于另一反饋環(huán)路中， 在心臟內(nèi)表現(xiàn)出了晝低夜高的節(jié)律變化， 峰值相位為ZT19.14。Nr1d1、Nr1d2雖為相同基因家族中的基因， 卻呈現(xiàn)出不同的晝夜節(jié)律變化， Nr1d1的表達與抑制因子中基因的節(jié)律變化相近， 峰值相位為ZT20.06， Nr1d2卻與正向調(diào)節(jié)因子中的Arntl1和Clock基因節(jié)律變化相似， 峰值相位為ZT22.08。Tim （P=0.05）的mRNA表達節(jié)律為白天降低夜晚升高， 峰值相位為ZT19.67。

3 討論

晝夜節(jié)律參與了生物體所有的生理活動， 其重要作用越來越受到人們的廣泛關(guān)注。而生物的生理節(jié)律是受一系列與節(jié)律相關(guān)基因構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來進行調(diào)控的， 研究相應(yīng)激素（褪黑素、皮質(zhì)醇）與節(jié)律基因的時空表達模式對于了解生物鐘系統(tǒng)的調(diào)控機制與作用規(guī)律至關(guān)重要。相關(guān)研究證明，褪黑素的合成及釋放受光調(diào)節(jié)， 黑暗可刺激褪黑素合成及釋放， 光線可抑制褪黑素合成及釋放［2］。皮質(zhì)醇濃度在睡眠階段顯著升高， 日間活動期間持續(xù)降低［22，23］。本研究對LD光制下鱖褪黑素和皮質(zhì)醇的晝夜含量進行了測定， 結(jié)果顯示: 鱖血清中褪黑素水平在光照階段顯著降低（P≤0.05）， 黑暗階段顯著上升； 皮質(zhì)醇在早上含量高， 白天降低， 并在午夜顯著升高至最高值后又開始持續(xù)降低。兩種激素所測得的晝夜節(jié)律性與正常自然節(jié)律大致相同［22—24］，且最低值都出現(xiàn)在ZT15。由于LD光制是模擬自然條件來進行光照控制， 據(jù)此推測， 鱖的生理性暗周期可能在ZT15（21:00）開始， 而生理性光周期則可能在ZT0（06:00）開始， 對于這一觀點還需進一步的研究論證。

晝夜節(jié)律參與生物體的新陳代謝、免疫調(diào)節(jié)等生命活動。在哺乳動物中， 敲除Clock基因會使小鼠表現(xiàn)出生物鐘節(jié)律紊亂， 食欲增強， 過度肥胖，并容易形成高脂高糖血癥［25］。在小鼠肝臟組織中，有100多個與代謝相關(guān)的基因表現(xiàn)出晝夜節(jié)律， 敲除Clock基因后的小鼠肝臟中這些基因的表達都出現(xiàn)不同程度的降低， 但在敲除Cry基因的小鼠肝臟中表達出現(xiàn)了升高［26］， 這進一步證明了肝臟代謝活動受生物鐘基因的調(diào)控。Velarde等［21］對LD光制下Cry1、Cry2、Cry3、Per1、Per2、Per3在金魚肝臟內(nèi)的晝夜節(jié)律進行了研究， 得到的結(jié)果為: Cry1、Per1、Per2無明顯的晝夜節(jié)律， Cry2的峰值在白天， Cry3的mRNA表達峰值在晝夜交替時出現(xiàn)，Per3的mRNA水平在半夜是最高的。在本研究結(jié)果中（表 2）， Cry1a、Cry3、Per3在鱖肝臟中無晝夜節(jié)律， Per1的mRNA表達在清晨最高， Clock、Arntl1、Npas2、Nr1d2、Rora在肝臟中無晝夜節(jié)律， Cry-dash的表達峰值位于中午， Nr1d1的最高峰值在凌晨， Npas4、Tim的峰值在黑暗階段。相同生物鐘基因在鱖與金魚的肝臟中表達規(guī)律不一致表明生物鐘基因在不同種類的魚中表達的晝夜規(guī)律可能不一樣。

圖 4 LD光制下鱖心臟生物鐘基因mRNA晝夜節(jié)律性表達的時間模式Fig. 4 Temporal pattems of clock genes mRNA circadian expressions in the heart of Siniperca chuatsi under LD light conditions

目前研究證明哺乳動物的心臟活動具有明顯的晝夜節(jié)律［27］。在對人類的研究中， 多種心血管疾病的發(fā)生表現(xiàn)出了節(jié)律性， 如心肌梗塞、心肌缺血等疾病主要在早晨高發(fā)［28，29］。黃潔［30］對出生后小鼠心臟中的生物鐘基因發(fā)育過程進行了研究， 在小鼠出生后的第3天觀察到生物鐘基因Arntl1、Cry1、Per2、Rev-erba開始在心臟中表達晝夜節(jié)律， 并且晝夜節(jié)律逐漸發(fā)展變化。Peirson等［31］研究發(fā)現(xiàn)， 在相同的環(huán)境下Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Arntl1在小鼠心臟和肝臟中的表達節(jié)律相似。據(jù)報道， 在斑馬魚心臟中Clock基因的mRNA表達水平在黑暗開始時出現(xiàn)最高峰［14］， 而生物鐘基因在歐洲鱸心臟中的表達趨勢則為: Per1的最高峰出現(xiàn)在清晨［32］， Cry1的表達峰值出現(xiàn)在上午［33］。在本研究中（表 3）， Clock在鱖心臟中的表達于深夜接近黎明時出現(xiàn)最高峰， Per1在鱖心臟中沒有顯示出晝夜節(jié)律， Cry1a的表達峰值在半夜出現(xiàn)， Arntl1和Nr1d2的mRNA最高峰位于黎明， Cry3、Cry-dash、Npas4無節(jié)律性， Per3、Npas2、Nr1d1、Rora、 Tim在心臟中的峰值相位出現(xiàn)在深夜。所得結(jié)果也與斑馬魚和歐洲鱸心臟中的生物鐘基因節(jié)律不相同， 進一步表明了不同魚類有著不同的生物鐘基因表達規(guī)律。

表 2 鱖肝臟中生物鐘基因mRNA表達的晝夜節(jié)律性參數(shù)Tab. 2 Circadian rhythmic parameters of clock genes mRNA expressions in the liver of Siniperca chuatsi

表 3 鱖心臟中生物鐘基因mRNA表達的晝夜節(jié)律性參數(shù)Tab. 3 Circadian rhythmic parameters of clock genes mRNA expressions in the heart of Siniperca chuatsi

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在長期的進化過程中， 每種生物都形成了自身的晝夜節(jié)律， 現(xiàn)在關(guān)于這方面的研究還處于種屬水平的資料累積階段。目前還沒有關(guān)于鱖晝夜節(jié)律方面的報道。本研究結(jié)果對鱖褪黑素、皮質(zhì)醇和13個生物鐘基因的晝夜變化規(guī)律進行了初步的研究分析， 為魚類生物鐘調(diào)節(jié)機制的進一步研究和魚類生理學(xué)的研究提供一定價值的基礎(chǔ)資料。

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CIRCADIAN RHYTHMICITY OF CLOCK GENES IN LIVER AND HEART OF MANDARIN FISH （SINIPERCA CHUATSI）

YAN Hui-Ling1，2， CHU Wu-Ying2， WU Ping2，3， WANG Jian-Hua2，4， LIU Xiao-Yan1and ZHANG Jian-She2
（1. College of Animal Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China； 2. Department of Bioengineering and Environmental Science， Changsha University， Changsha 410003， China； 3. College of Biology， Hunan University，Changsha 410082， China； 4. College of Life Science， Guangxi Normal University， Guilin 541004， China）

Clock genes are the molecular core of circadian rhythm of vertebrates. In the present study， we investigated the expression of clock genes which contained Arntl1， Clock， Cry1a， Cry3， Cry-dash， Npas2， Npas4， Nr1d1， Nr1d2，Per1， Per3， Rora and Tim in liver and heart of Mandarin fish （Siniperca chuatsi） under the 12h-light and 12h-dark （LD）cycle condition. Melatonin and cortisol levels were also investigated under the same condition. Livers， hearts and plasma of Mandarin fish were collected at ZT0（06:00）， ZT3（09:00）， ZT6（12:00）， ZT9（15:00）， ZT12（18:00），ZT15（21:00）， ZT18（24:00）， ZT21（03:00， 2ndday）， ZT24（06:00， 2ndday） （Zone time， ZT） with three fishes at each time point. The total mRNA was extracted from each sample， the semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to determine the temporal changes in mRNA levels. Blood plasma melatonin and cortisol were quantified by competitive ELISA. The data were analyzed both by the One-Way ANOVA （SPSS 17.0） and the cosine function （Matlab 7.0） to investigate the circadian rhythm of these genes. The result indicated that: Cry-dash，Npas4， Nr1d1， Per1 and Tim displayed daily rhythmic expression in the liver. Except for Cry-dash， the expression of the other genes decreased during the light phase and increased in the dark phase. In addition， there were two rhythmic characters of the 9 genes which contained Arntl1， Clock， Cry1a， Npas2， Nr1d1， Nr1d2， Per3， Rora and Tim in the heart of Mandarin fish: 3 genes including Arntl1， Clock and Nr1d2 were reduced at light but increased at dark phase and the mRNA levels of the others sustained low in ZT0 （06:00）-ZT15 （21:00）， while increased significantly in ZT15 （21:00）-ZT18 （24:00） and then decreased in ZT18 （24:00）-ZT21 （03:00）. Plasma melatonin levels showed a biphasic diurnal pattern， with higher concentrations during the dark phase than the light phase， its lowest level was observed at ZT15（21:00）. Changes in the serum cortisol levels exhibited circadian pattern over a 24h period that the peak detected at ZT18 （24:00） and the trough detected at ZT15 （21:00）. In summary， most of the clock genes were expressed in a circadian manner in liver and heart of Mandarin fish （Siniperca chuatsi）， with differences in phase and amplitude.

Mandarin fish （Siniperca chuatsi）； Circadian rhythm； Clock gene； Melatonin； Cortisol

10.7541/2016.34

Q344+.1

A

1000-3207（2016）02-0243-09

2015-05-05；

2015-10-06

國家自然科學(xué)基金項目（31472256， 31230076）； 湖南省自然科學(xué)基金項目（14JJ2135）資助 ［Supported by the National Natural

鄢慧玲（1990—）， 女， 湖南常德人； 碩士； 研究方向為水生生物學(xué)。E-mail:yanhuiling90@163.com

劉小燕（1965—）， 女， 湖南益陽人； 博士， 教授； 研究方向為水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)。E-mail:liuxy186@163.com；

褚武英（1971—）， 男， 江西南昌人； 博士， 教授； 研究方向魚類肌肉分化調(diào)控。E-mail: 2621372124@qq.com