銅脅迫對輪葉黑藻無菌苗生理代謝的影響

母丹丹汝雙燕李 濤趙進(jìn)東

（1. 中國科學(xué)院水生生物研究所， 武漢 430072； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）

研究簡報

銅脅迫對輪葉黑藻無菌苗生理代謝的影響

母丹丹1，2汝雙燕1，2李 濤1趙進(jìn)東1

（1. 中國科學(xué)院水生生物研究所， 武漢 430072； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展， 向環(huán)境中排放的重金屬日趨增加， 土壤、地表水、地下水受到的污染日趨嚴(yán)重。所謂重金屬是指原子量大于鐵或密度大于5.0 g/cm3的金屬， 如汞、鎘、鉛、銅、鎳、鋅等， 采礦、冶金、化工、石油、電鍍等多種工業(yè)行業(yè)的生產(chǎn)廢水均含有重金屬元素。而重金屬廢水是對環(huán)境危害最嚴(yán)重和對人類危害最大的工業(yè)廢水［1］。銅作為一種重要的高毒性重金屬污染物， 關(guān)于其對自然水體或模擬的人工水體毒害的研究國內(nèi)已有一些報道［2—4］。沉水植物作為水體生態(tài)系統(tǒng)中行駛重要生態(tài)和環(huán)境功能的初級生產(chǎn)者， 具有很強(qiáng)的修復(fù)重金屬污染水體的潛力［5］。輪葉黑藻是一種廣泛分布于我國各個湖泊的沉水植物， 其在改善水質(zhì)、維持水質(zhì)穩(wěn)定以及增加生物多樣性方面具有良好的生態(tài)效益， 水質(zhì)、溫度、溶解氧、營養(yǎng)鹽狀況都會影響黑藻的生長與存活［6］。銅元素是輪葉黑藻所必需的微量元素， 攝入過多的銅會使輪葉黑藻生長受到抑制甚至死亡。過量的重金屬離子的吸收和富集對水生植物產(chǎn)生怎樣的影響？曾阿妍［7］發(fā)現(xiàn)黑藻對Cu2+有較好的凈化能力， 隨著培養(yǎng)溶液中的銅離子濃度的逐漸增加， 黑藻中的葉綠素含量逐漸降低。周長芳等［8］在Hoagland培養(yǎng)基中加入CuSO4以模擬水體Cu2+污染環(huán)境， 研究重金屬對水花生各項生理指標(biāo)的影響， 發(fā)現(xiàn)水花生可溶性蛋白隨Cu2+濃度的升高而直線下降。徐勤松等［9］發(fā)現(xiàn)重金屬Cd、Zn單一及復(fù)合污染都使水車前細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶SOD、POD和CAT活性比例失調(diào)， 植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除失衡， 這都導(dǎo)致植物的生理代謝紊亂， 從而加速植物的衰老和死亡。

目前已報道的研究［10—13］所采用的材料大都為自然生長的植株， 取材受季節(jié)的限制， 實驗結(jié)果在一定程度上會受到其他生物尤其是水體內(nèi)的微生物的影響。微生物可以調(diào)控植物性狀表達(dá)， 影響植物的性能， 進(jìn)而影響各種生態(tài)系統(tǒng)功能［14］。為了消除以上影響， 本文以輪葉黑藻無菌苗為材料， 研究了Cu2+脅迫條件下輪葉黑藻無菌苗的光合色素、ATP 酶的活性以及抗氧化系統(tǒng)等生理功能的變化， 為進(jìn)一步研究植物應(yīng)對重金屬逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

輪葉黑藻無菌苗培養(yǎng)方法［15］: 選取生長健壯的輪葉黑藻， 用堿性洗滌劑浸泡0.5h， 然后在自來水沖洗1h， 在無菌工作間， 取帶腋芽的健壯莖置于培養(yǎng)皿中， 用75%乙醇滅菌30s， 無菌水反復(fù)沖洗3次， 用0.1%的氯化汞消毒2min， 再用無菌水反復(fù)沖洗5次。將消毒處理后的輪葉黑藻莖剪成5—10 mm長， 辨認(rèn)形態(tài)學(xué)上端后， 置于MS（Murashige Skoog Medium）固體培養(yǎng)基［含0.5 mg/L的6-氨基嘌呤（6-BA）， 0.1 mg/L的萘乙酸（IAA）， pH5.8—6.0］誘導(dǎo)芽分化。7d左右莖間側(cè)芽萌發(fā)， 15d左右長至1.0 cm，然后轉(zhuǎn)入1/2MS （NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4減半）液體繼代培養(yǎng)基（含0.5 mg/ L的6-BA， 0.1 mg/L的IAA， pH 5.8—6.0）繼代培養(yǎng)15d后，轉(zhuǎn)入1/2 MS液體繼代培養(yǎng)基（含0.1 mg/L 的IAA， pH 5.8—6.0）進(jìn)行生根培養(yǎng)以得到完整的無菌苗， 時長為7d。整個組培過程在培養(yǎng)室進(jìn)行， 培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，每天光照12h， 光照強(qiáng)度為40 μe/（m2·s）。

銅標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制［16］: 將3.9 g CuSO4·5H2O溶于少量水中， 滴入少量硫酸， 移入1000 mL容量瓶中， 用水稀釋至刻度， 搖勻， 滅菌保存。此溶液含銅1.0 mg/mL。

1.2 實驗設(shè)計

選取生長狀況一致的輪葉黑藻無菌苗在無銅1/2MS液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d， 然后分別加入已滅菌的CuSO4·5H2O（AR）標(biāo)準(zhǔn)液至銅離子濃度為0、0.5、1.0、5.0和10.0 mg/L， 整個毒害實驗都在全封閉培養(yǎng)箱中完成， 條件同培養(yǎng)黑藻無菌苗時一致。第3—4d時， 在相同的時間段內(nèi)取出無菌苗， 去離子水洗凈、揩干， 鮮重（FW）下進(jìn)行各項指標(biāo)測定， 實驗重復(fù)3次。

1.3 實驗方法

光合特征指標(biāo)的測定 光合色素含量的測定采用Lichtenthaler［17］的方法， 通過紫外-可見分光光度計測量分析。

可溶性蛋白含量的測定 采用考馬氏亮藍(lán)G-250法［18］進(jìn)行。

Na+K+-ATP酶（Na+K+-ATPase）和Ca2+Mg2+-ATP 酶（Ca2+Mg2+-ATPase）活性測定 使用南京建成生物工程研究所購買的ATP酶試劑盒測定。

SOD、POD和CAT 活性的測定 取材置于預(yù)冷的研缽中， 加入0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH7.8）， 冰浴，研磨， 10000 r/min， 低溫離心20min， 取上清液。SOD、CAT活性用一般分光光度法； POD活性用愈創(chuàng)木酚法［19］測定。

數(shù)據(jù)分析 運用excel分析各測定指標(biāo)與處理濃度間的相關(guān)性（r）并繪制圖， 用相關(guān)系數(shù)r表示， 各指標(biāo)與Cu2+濃度進(jìn)行相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計； 以 P＜0.05為顯著相關(guān)，P＜0.01為極顯著相關(guān)。由SPSS19.0統(tǒng)計軟件對個數(shù)據(jù)均值進(jìn)行單因素方差分析， 完成數(shù)值間的差異性分析； 以P＜0.05為差異顯著， P＜0.01為差異極顯著。結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。本文圖表中的不同小寫字母表示數(shù)值之間差異顯著（P＜0.05）， 相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果

2.1 Cu2+對輪葉黑藻無菌苗光合色素含量的影響

隨著Cu2+濃度的增加， 各種光合色素的含量均呈現(xiàn)下降的趨勢（圖 1）。最高濃度為10 mg/L時， 葉綠素a（Chl.a）、葉綠素b （Chl.b）、類胡蘿卜素（Car）的含量依次降為對照組的48.1%、80.1%和9.5%?？梢?， Chl.a、Chl.b和Car的含量下降趨勢整體上保持一致。經(jīng)相關(guān)性及顯著性分析， Chl.a、Car與Cu2+濃度均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為r= -0.82， r= -0.90； P＜0.01）， Chl.b與Cu2+濃度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為r=-0.54；P＜0.05）。對于Chl.a， 對照組與0.5 mg/L Cu2+處理組無顯著性差異（P＞0.05）， 與其他組均有顯著性差異（P＜0.05）；對于Chl.b， 對照組與0.5 和1.0 mg/L Cu2+處理組無顯著性差異（P＞0.05）， 與5.0 和10.0 mg/L Cu2+處理組之間有顯著性差異（P＜0.05）。對于Car， 對照組與0.5 和1.0 mg/L Cu2+處理組無顯著性差異（P＞0.05）， 與5.0和10.0 mg/L Cu2+處理組有顯著性差異（P＜0.05）。

圖 1 在Cu2+脅迫下輪葉黑藻無菌苗光合色素的含量變化Fig. 1 Effect of Cu2+stress on photosynthetic pigments contents in sterile seedlings of Hydrilla

2.2 Cu2+對輪葉黑藻可溶性蛋白含量變化的影響

在Cu2+脅迫下， 可溶性蛋白含量隨著Cu2+濃度的增大呈現(xiàn)下降趨勢（圖 2）， 在1.0 mg/L Cu2+處理時呈現(xiàn)回升趨勢， 為對照組的93.7%； 而后隨著處理濃度的加大， 可溶性蛋白含量也呈現(xiàn)驟降的趨勢。經(jīng)相關(guān)性分析可知，輪葉黑藻無菌苗可溶性蛋白的含量與Cu2+處理濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為r= -0.88， P＜0.01）； 顯著性分析顯示對照組和0.5、1.0 mg/L Cu2+處理組之間無顯著性差異（P＞0.05）， 而與5.0、10.0 mg/L Cu2+處理組之間存在顯著性差異， （P＜0.05）。

2.3 Cu2+脅迫下輪葉黑藻無菌苗Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶活性的變化

2.4 Cu2+脅迫對輪葉黑藻無菌苗SOD、POD和CAT活性的影響

圖 2 Cu2+脅迫下輪葉黑藻無菌苗可溶性蛋白的含量變化Fig. 2 Effect of Cu2+stress on soluble protein in sterile seedlings of Hydrilla

圖 3 Cu2+對 Na+K+-ATPase和 Ca2+Mg2+-ATPase的影響Fig. 3 Effect of Cu2+stress on Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase activity of Hydrilla

圖 4 Cu2+對輪葉黑藻SOD、POD、CAT活性的影響Fig. 4 Effect of Cu2+stress on SOD， POD， CAT activity of Hydrilla

隨著Cu2+濃度升高， SOD和POD的活性表現(xiàn)為上升，在Cu2+濃度為10.0 mg/L 時達(dá)到最大， 為對照組的1.1倍和3.6倍（圖 4A、B）； CAT的活性隨Cu2+處理濃度升高均表現(xiàn)為先升后降趨勢， 分別在Cu2+濃度為0.5 mg/L時達(dá)到峰值， 為對照組的1.2倍， 之后酶活性下降， 降為對照組21.5% （圖 4C）。對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)， SOD和POD活性變化與Cu2+處理濃度呈極顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為rSOD= 0.96， rPOD= 0.98， P＜0.01）； CAT活性與 Cu2+處理濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為rCAT= -0.90，P＜0.01）； 差異性分析顯示， SOD活性對照組與1 mg/L Cu2+處理組無顯著性差異（P＞0.05）， 與0.5、5.0和10.0 mg/ L Cu2+處理組存在顯著性差異（P＜0.05， 圖 4）。POD活性對照組與0.5 mg/L Cu2+處理組無顯著性差異（P＞0.05）， 與其他Cu2+處理組均存在顯著性差異（P＜0.05， 圖 4B）；CAT活性對照組與0.5、1.0 mg/L Cu2+處理組無顯著性差異（P＞0.05）， 與其他Cu2+處理組存在顯著性差異（P＜0.05，圖 4C）。

3 討論

已有的報道［6—10］使用野外采集的沉水植物作為實驗對象， 其實驗結(jié)果會受到其他因素的干擾。朱丹婷等［6］在研究光強(qiáng)、溫度、總氮濃度對黑藻生長的影響時， 也選擇非無菌的材料， 且未滅菌的營養(yǎng)液可能存在其他共生植物； 張飲江等［12］選擇了金魚藻， 伊樂藻和苦草3種沉水植物研究去除水體中鎘的效果， 實驗所選擇的水體為開放水體， 自然光照， 研究對象可能會受到不同程度的外界影響。本實驗以輪葉黑藻無菌苗作為實驗對象進(jìn)行重金屬脅迫研究， 盡可能的控制或排除其他不穩(wěn)定因素的影響， 如光照、共生植物、水的運動以及人為作用等的干擾， 選擇生長時間， 狀況一致的無菌苗作為受試材料，在可控的環(huán)境中進(jìn)行試驗。

葉綠素含量與光合速率、營養(yǎng)狀況等密切相關(guān)， 測定葉綠素的含量是表征植物生長狀況重要標(biāo)志［20］。本實驗輪葉黑藻光合色素隨著處理濃度的增加而下降， 這與徐勤松等［9］、曾阿研等［7］的研究結(jié)果一致。輪葉黑藻在Cu2+脅迫下， 0 Cu2+處理組與0.5 mg/L Cu2+處理組植物葉片仍舊鮮綠， 1.0 mg/L處理組植物葉片部分失綠， 而5.0、10.0 mg/L濃度組植物葉片幾乎全部失綠變黑， 甚至死亡。谷巍等［21］用不同濃度的Hg2+和Cd2+溶液處理輪葉狐尾藻， Cd2+脅迫時， 植物葉片和莖出現(xiàn)黑色斑點， Hg2+脅迫時葉片和莖均褪綠， 未出現(xiàn)斑點。電鏡觀察顯示， 葉細(xì)胞受毒害后， 染色質(zhì)呈絮凝狀， 膜系統(tǒng)解體、核糖體消失。由此可見， 重金屬離子脅迫后， 沉水植物葉綠體的結(jié)構(gòu)受到破壞， 光合色素含量下降， 進(jìn)而影響植物正常的光合作用， 代謝紊亂。

植物在逆境或者衰老的情況下， 蛋白質(zhì)合成速度減緩， 含量下降［22］。在本實驗中， 可溶性蛋白含量隨著Cu2+濃度的增大呈現(xiàn)下降趨勢， 與賈榮等［23］以菹草無菌苗為材料在銅脅迫下可溶性蛋白含量的變化所得的結(jié)論基本一致。輪葉黑藻無菌苗在Cu2+濃度低于1.0 mg/L時，可溶性蛋白含量差異不顯著， 這與植物本身的抗逆性反應(yīng)有關(guān)； 而高于1.0 mg/L時， 植物的抗逆程度遭致破壞，無法正常維持內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定， 因此無法滿足自生生存需要， 導(dǎo)致死亡。

機(jī)體在缺氧及疲勞等狀態(tài)下， ATP酶受到損傷， 活力

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SOD、POD以及CAT是防御過氧化系統(tǒng)的重要保護(hù)酶， 能有效消除自由基， 因此SOD、POD和CAT都是反應(yīng)植物的受損程度的逆境生理指標(biāo)［24，25］。本研究發(fā)現(xiàn)SOD、POD的含量隨銅離子濃度上升而上升， CAT的含量在低濃度時上升， 在高濃度Cu2+脅迫下CAT活性的急劇下降， 可能是由于自由基的積累導(dǎo)致。陳霖等［26］通過鎳脅迫菹草無菌苗發(fā)現(xiàn)， SOD、POD和CAT的活性隨鎳離子濃度增加， 均表現(xiàn)為先升后降的趨勢。這與本研究的結(jié)果不一致， 表明不同植物， 不同重金屬離子存在不同的污染機(jī)制， 其原因有待進(jìn)一步探討。

綜上所述， 在Cu2+脅迫下， 葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞， 光合色素含量降低， 植物無法進(jìn)行正常的光合作用； 可溶性蛋白和ATP酶系統(tǒng)的含量減少表明植物內(nèi)部酶系統(tǒng)受到較大破壞， 無法維持正常的生理活動； Cu2+脅迫也可誘導(dǎo)活性氧等在植物體內(nèi)大量積累， 抗氧化酶系統(tǒng)能在一定范圍內(nèi)降低體內(nèi)活性氧的過量積累， 隨著Cu2+的增加， 活性氧超過一定范圍， 致使抗氧化酶系統(tǒng)負(fù)荷過重， 進(jìn)而導(dǎo)致輪葉黑藻的穩(wěn)態(tài)被破壞。1.0 mg/L的Cu2+濃度是本實驗輪葉黑藻的耐受臨界點， 超過這個界限， 輪葉黑藻的各項生理機(jī)能都遭致嚴(yán)重破壞， 代謝紊亂， 植株不能繼續(xù)生長。Acta Hydrobiologica Sinica， 2006， 30（1）: 107—112 ［徐勤松， 施國新， 王學(xué)， 等. 鎘、銅和鋅脅迫下黑藻活性氧的產(chǎn)生及抗氧化酶活性的變化研究. 水生生物學(xué)報，2006， 30（1）: 107—112］

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EFFECT OF COPPER STRESS ON PHYSIOLOGICAL METABOLISM IN STERILE SEEDLINGS OF HYDRILLA VERTICILLATA （L. F.） ROYLE

MU Dan-Dan1，2， RU Shuang-Yan1，2， LI Tao1and ZHAO Jin-Dong1
（1. Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Science， Wuhan 430072， China； 2. University of chinese Academy Sciences， Beijing 100049， China）

輪葉黑藻無菌苗； Cu2+脅迫； 光合色素； 可溶性蛋白； ATP酶； 抗氧化酶系統(tǒng)

Sterile seedlings of Hydrilla verticillata （L. F.）； Cu2+stress； Chlorophyll content； Soluble protein； ATPase； Antioxidant enzyme system

10.7541/2016.56

Q948.1

A

1000-3207（2016）02-0419-06

2015-03-05；

2015-07-25

國家水體污染與治理科技重大專項項目（2012ZX07105004）資助 ［Supported by Major Science and Technology Project of Water Pollution control and management in China （2012ZX07105004）］

母丹丹（1990—）， 女， 羌族； 四川綿陽人； 碩士研究生； 研究方向為藻類基因組學(xué)。E-mail: dia_533@163.com

李濤， E-mail: litao@ihb.ac.cn