豬藍(lán)耳病活疫苗生產(chǎn)工藝探索

趙輝 葛俊偉/東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院

秦立鑫 郭立權(quán)/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

豬藍(lán)耳病活疫苗生產(chǎn)工藝探索

趙輝 葛俊偉/東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院

秦立鑫 郭立權(quán)/哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又稱“藍(lán)耳病”，自2006年的夏秋季節(jié)，我國陸續(xù)暴發(fā)一種以高熱為典型癥狀的綜合癥，給全國養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大浩劫。2007年1月，確定變異豬藍(lán)耳病病毒是豬“高熱病”主要病原，并定名為高致病性豬藍(lán)耳病 (Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)。該病是由 HP-PRRS 病毒(HP-PRRSV)引起的一種急性高致病性疫病。該病仔豬發(fā)病率可達(dá) 100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上，育肥豬也可發(fā)病死亡是其特征。HP-PRRS同其他病毒性疾病一樣，目前尚沒有較為有效的治療藥物，除按傳統(tǒng)的隔離、消毒、控制人員活動對該病進(jìn)行控制外，重中之重就是要有安全、穩(wěn)定、高效的疫苗進(jìn)行正確的免疫接種。因此, 研制出安全、高效、生產(chǎn)工藝簡單、成本較低而又適應(yīng)市場需求的高致病性豬藍(lán)耳病疫苗成為生產(chǎn)企業(yè)努力的方向。

本研究對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F112株）的生產(chǎn)工藝關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行探索。從細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)的傳代比例、培養(yǎng)液血清濃度、毒種繁殖時(shí)的接毒量、培養(yǎng)液體積、病毒原液收獲時(shí)間、半成品原液保存溫度及保存時(shí)間等幾方面參數(shù)對原液的病毒效價(jià)的影響，展開對比試驗(yàn)，最終確定最佳參數(shù)，為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗（HuN4-F112株）的大批量生產(chǎn)提供參考，不但要保障疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量，更要大大降低疫苗的生產(chǎn)成本和生產(chǎn)人員的勞動強(qiáng)度。

一、試驗(yàn)方案

（一）確定Marc-145細(xì)胞傳代比率試驗(yàn)。

將長滿單層的Marc-145細(xì)胞棄去營養(yǎng)液，用分散液分散后按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5傳代比例傳代，確定生產(chǎn)時(shí)最適合的傳代比率。

1∶2傳代：將轉(zhuǎn)瓶中分散好的Marc-145細(xì)胞加入已配制好的營養(yǎng)液，轉(zhuǎn)瓶中加入2 000 ml培養(yǎng)液，將細(xì)胞搖勻后無菌分裝到2個轉(zhuǎn)瓶中。

1∶3傳代：將轉(zhuǎn)瓶中分散好的Marc-145細(xì)胞加入已配制好的營養(yǎng)液，轉(zhuǎn)瓶中加入3 000 ml培養(yǎng)液，將細(xì)胞搖勻后無菌分裝到3個轉(zhuǎn)瓶中。

1∶4傳代：將轉(zhuǎn)瓶中分散好的Marc-145細(xì)胞加入已配制好的營養(yǎng)液，轉(zhuǎn)瓶中加入4 000 ml培養(yǎng)液，將細(xì)胞搖勻后無菌分裝到4個轉(zhuǎn)瓶中。

1∶5傳代：將轉(zhuǎn)瓶中分散好的Marc-145細(xì)胞加入已配制好的營養(yǎng)液，轉(zhuǎn)瓶中加入5 000 ml培養(yǎng)液，將細(xì)胞搖勻后無菌分裝到5個轉(zhuǎn)瓶中。

將轉(zhuǎn)瓶置于37℃溫室中進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁增殖狀況，并做好記錄。

（二）不同接毒量對比試驗(yàn)

取形成良好單層的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別按培養(yǎng)液總量的1%、2%、3%、4%接入毒種，充分吸附后，

加入1%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液1 000 ml（維持液），置37℃培養(yǎng)，每日觀察并記錄CPE，當(dāng)CPE達(dá)到80%時(shí)收獲，測定病毒原液的TCID50，綜合考慮后，選出既能保證生產(chǎn)又能降低生產(chǎn)成本的最佳接毒量。

（三）培養(yǎng)液中不同血清含量的比較試驗(yàn)

取形成良好單層的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)瓶，按1%接入毒種，充分緩慢旋轉(zhuǎn)吸附，然后加入不同含量犢牛血清為1%、2%、3%、4%的培養(yǎng)液，置37℃恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，每日觀察記錄CPE，CPE達(dá)80 %時(shí)，收獲病毒液，分別測定TCID50。

（四）培養(yǎng)液的不同加入量對比試驗(yàn)

取形成單層的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每次選擇8瓶細(xì)胞生長狀況大致相同的培養(yǎng)瓶，按培養(yǎng)液總量1%接入毒種，加入含1%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)液，一組2瓶，各加入800 ml培養(yǎng)液，二組2瓶，各加入1 000 ml培養(yǎng)液，三組2瓶，各加入1 200 ml培養(yǎng)液，四組2瓶，各加入1 400 ml培養(yǎng)液，置37℃恒溫旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，當(dāng)CPE達(dá)到80%時(shí)，收毒，取樣，分別測定含毒原液的TCID50。

（五）不同收獲時(shí)間對比試驗(yàn)

取形成良好單層的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)瓶，按培養(yǎng)液的1 %接入毒種，充分緩慢旋轉(zhuǎn)吸附，然后加入含1%犢牛血清的培養(yǎng)液，分別于CPE達(dá)到70%、80%、90%收獲病毒液，并詳細(xì)記錄收獲時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。分別測定TCID50，以便選出最佳收毒時(shí)間。

（六）病毒原液不同保存溫度和時(shí)長的對比試驗(yàn)

將收獲的病毒原液，分成8組，使用滅菌西林瓶分裝，濕毒保存，每瓶5ml，每組兩瓶。分別儲存于4℃、-20℃、-40℃、-70℃溫度，保存0 d、5 d、15 d、30 d、60 d、90 d、120 d、150 d、180 d，比較不同保存溫度及保存時(shí)間對病毒液毒價(jià)的影響。

二、試驗(yàn)結(jié)果

（一）Marc-145細(xì)胞傳代比率的確定

在Marc-145細(xì)胞傳代時(shí)用胰酶-EDTA分散液，按1∶2、1∶3、1∶4、1∶5傳代比例傳代培養(yǎng)。72 h觀察，按1∶2比例傳代細(xì)胞生長過于緊密，死細(xì)胞較多；按1∶3、1∶4比例傳代的細(xì)胞長滿單層，形態(tài)良好；按1∶5傳代的細(xì)胞沒有長滿單層。72 h傳代后又繼續(xù)傳代，連續(xù)傳代4次，按1∶2比例得傳代細(xì)胞生長依然過于緊密，細(xì)胞層較厚，死細(xì)胞較多；按1∶5比例的傳代細(xì)胞仍未能長成符合要求的細(xì)胞單層；按1∶3、1∶4比例的傳代細(xì)胞均能達(dá)到所需厚度，而且生長形態(tài)良好。

（二）確定不同接毒量對病毒增殖的影響

在培養(yǎng)條件相同的情況下，以CPE達(dá)80%左右時(shí)收獲，測定原液病毒含量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，1%、2%的接毒量制備的原液病毒含量最高，并且原液效價(jià)非常穩(wěn)定，CPE達(dá)80%左右收獲時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間也大致相同。

（三）培養(yǎng)液中不同血清含量的比較試驗(yàn)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，4種血清濃度均能很好的復(fù)制病毒，4種收獲原液病毒含量相差不多，考慮到疫苗成本和以及血清含量增加所帶來的安全性隱患等因素，所以在該疫苗生產(chǎn)時(shí)，選用了1 %血清濃度。

（四）培養(yǎng)液不同加入量的對比試驗(yàn)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，瓶裝量為1 000 ml和1 200 ml的原液病毒含量測定結(jié)果相近，但考慮到確保細(xì)胞生長和病毒增殖過程中有足夠的營養(yǎng)供應(yīng)。在疫苗生產(chǎn)時(shí)，選用了1 200 ml瓶裝量。

（五）病毒液不同收獲時(shí)間的對比試驗(yàn)

在培養(yǎng)過程中，隨時(shí)觀察CPE變化，分別于CPE達(dá)70%、80%、90%以上時(shí)，收獲病毒原液，測定TCID50，比較不同收毒時(shí)間對病毒原液毒價(jià)的影響。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，以CPE達(dá)80%左右時(shí)，原液的病毒含量最高，即該疫苗的收獲時(shí)間為接毒后56～58 h收毒為宜。

（六）不同保存溫度和時(shí)間對病毒原液病毒含量的影響

不同保存溫度和保存時(shí)間對病毒效價(jià)的影響非常明顯。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，4℃僅可以短期保存，不可用該溫度長期保存該病毒原液。-80℃保存毒價(jià)效果最好，但對于大批生產(chǎn)的原液儲存條件過于苛刻。-20℃保存毒價(jià)下降較為緩慢，可以作為長期儲存條件?？紤]生產(chǎn)成本和生產(chǎn)連續(xù)性，多采取4℃短期保存，快速凍干的生產(chǎn)工藝。

三、結(jié)論

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4-F112株)在大批生產(chǎn)中，最適宜細(xì)胞傳代比例為1∶4；接毒量為培養(yǎng)液總量的1%；細(xì)胞培養(yǎng)血清濃度為1%；制苗用病毒繁殖收獲時(shí)間為細(xì)胞80%病變程度時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間約為56～58 h收獲；采用收獲后快速凍干原則，特殊情況-20℃保存不得超過2個月。這樣即可保證半成品原液的效價(jià)，又可以降低生產(chǎn)成本，節(jié)約勞動力，能夠給藍(lán)耳病疫苗的生產(chǎn)帶來一定的工藝優(yōu)化成效。