中藥心康方對(duì)心力衰竭大鼠心肌 miR-25-3p 表達(dá)水平和SERCA2a活性的影響

吳錦波， 葉小漢， 冼紹祥， 董明國(guó)

(1廣州市中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站，廣東 廣州 510405； 2東莞市中醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 東莞 523000；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510405)

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中藥心康方對(duì)心力衰竭大鼠心肌 miR-25-3p 表達(dá)水平和SERCA2a活性的影響

吳錦波1, 2△， 葉小漢2， 冼紹祥3， 董明國(guó)2

(1廣州市中醫(yī)藥大學(xué)博士后流動(dòng)站，廣東 廣州 510405；2東莞市中醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 東莞 523000；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州 510405)

目的： 觀察中藥心康方對(duì)心力衰竭大鼠心肌miR-25-3p表達(dá)水平和肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a(SERCA2a)活性的影響。方法: 采用阿霉素腹腔注射法建立大鼠心力衰竭模型，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、心康方組和卡托普利組，分別以蒸餾水、心康方和卡托普利連續(xù)灌胃35 d。觀察大鼠心功能指標(biāo)，ELISA法檢測(cè)血漿腦鈉肽水平，定磷法測(cè)定心肌SERCA2a活性，Western blot法檢測(cè)心肌SERCA2a和受磷蛋白(PLB)的蛋白表達(dá)水平，莖環(huán)引物實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌miR-25-3p的表達(dá)水平。結(jié)果: 心康方組和卡托普利組大鼠心輸出量、左室短軸縮短率和射血分?jǐn)?shù)明顯高于模型組，血漿腦鈉肽水平明顯低于模型組， miR-25-3p表達(dá)水平明顯低于模型組，SERCA2a和PLB的蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0．01)。心康方組SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性明顯高于模型組(P<0．05)，卡托普利組與模型組比較無(wú)明顯差異。結(jié)論: 中藥心康方可以改善心力衰竭大鼠心功能，機(jī)制可能與下調(diào)心肌miR-25-3p表達(dá)水平、提高SERCA2a的蛋白表達(dá)水平及增強(qiáng)SERCA2a活性有關(guān)。

心康方； 心力衰竭； 微小RNA； 肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a； 受磷蛋白

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，隨著人口老年化，CHF的患病人數(shù)不斷增加，據(jù)估算，目前全球有超過(guò)3 800萬(wàn)例心衰患者[1]，雖然醫(yī)學(xué)發(fā)展改善了心衰患者的預(yù)后，但其5年病死率仍高達(dá)50%，因此迫切需要尋求新的治療方法[2]。心肌收縮和/或舒張功能受損，心肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)障礙是CHF最基本的病理生理改變。肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a)對(duì)興奮-收縮偶聯(lián)具有重要調(diào)控作用，是CHF治療研究的重要靶點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)SERCA2a基因治療可以改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和CHF患者的心功能[3-4]。抑制miR-25表達(dá)也可以提高SERCA2a表達(dá)水平，改善心功能[5]。然而這些基因治療方法未能馬上應(yīng)用于臨床。中藥被廣泛用于CHF的治療，但由于作用機(jī)制不明確和缺乏令人信服的證據(jù)等原因，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。中藥心康方由東莞市中醫(yī)院心內(nèi)科根據(jù)中醫(yī)理論及多年臨床實(shí)踐而研制，功能宣肺平喘、降氣利水、益氣活血；臨床觀察顯示中藥心康方能改善CHF患者心功能，降低NT-proBNP，增加患者6 min步行距離，提高患者生活質(zhì)量[6]，因此有必要對(duì)其治療機(jī)制作進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射阿霉素建立大鼠CHF模型，觀察中藥心康方對(duì)大鼠心功能、SERCA2a活性及miR-25-3p表達(dá)水平的影響，為中藥心康方用于臨床提供有效的科學(xué)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，平均體質(zhì)量(230±20)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 [動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(粵)2013-0020；動(dòng)物合格證號(hào)為No.440059000]。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)凈化空間，生長(zhǎng)條件為12 h/12 h光照周期，溫度(22±3)℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由攝食、飲水。

中藥心康方由葶藶子15 g、杏仁10 g、茯苓15 g、黃芪15 g、陳皮5 g和三菱10 g 組成，由廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司嚴(yán)格按照GMP生產(chǎn)程序加工制成干浸膏粉。每劑中藥復(fù)方含生藥85 g，制得干浸膏粉約17 g，-4 ℃凍干儲(chǔ)存。由于心康方是東莞市中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，方劑組成固定，并已進(jìn)行了臨床觀察研究[6]，為了與臨床觀察研究用藥保持一致，我們按照人類與大鼠體表面積進(jìn)行換算，直接采用單一換算劑量，得到大鼠干浸膏用藥劑量為1.5 g/kg(相當(dāng)于中藥生藥7.7 g/kg)，臨用時(shí)蒸餾水配制成濃度為0.15 kg/L的溶液，灌胃容量為每天10 mL/kg?？ㄍ衅绽?中美上海施貴寶)1 575 mg加無(wú)菌蒸餾水1 500 mL，制成濃度為1.05 g/L的溶液，灌胃劑量為每天10.5 mg/kg。阿霉素(doxorubicin，DOX)；氯胺酮(福建古田藥業(yè))；地西泮(天津金耀藥業(yè))。

2 試劑和儀器

腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP) ELISA試劑盒購(gòu)自RayBiotech；超微量Ca2+-ATP酶檢測(cè)試劑盒由南京建成提供；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供；抗β-actin和SERCA2a抗體由Santa Cruz提供；抗受磷蛋白(phospholamban,PLB)抗體購(gòu)自Abgent；ECL發(fā)光液購(gòu)自Millipore。RT-qPCR試劑由DBI提供。

HP5500心臟超聲儀(HP)；GDS7600凝膠掃描系統(tǒng)(UVP)；ABI9700 PCR擴(kuò)增儀(ABI)。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 動(dòng)物造模及分組 雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，參照文獻(xiàn)[7]，采用阿霉素腹腔注射法(用滅菌注射用水溶解成250 mg/L溶液,每次注射劑量為2.5 mg/kg，2周內(nèi)分6次注射，總劑量15 mg/kg)建立大鼠心衰模型。首次腹腔注射5周后應(yīng)用心臟超聲儀檢測(cè)并計(jì)算左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)，以心腔擴(kuò)大，LVFS<30%作為心衰成模標(biāo)準(zhǔn)[8]。80只大鼠分別隨機(jī)選取10只作為正常對(duì)照組，10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組腹腔注射10 mL/kg的生理鹽水。剩余60只大鼠用于造模，將成功造模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：模型組、心康方組和卡托普利組；心康方組和卡托普利組分別以心康中藥浸膏(1.5 g/kg)和卡托普利(10.5 mg/kg)灌胃，每天1 次，連續(xù)35 d；其余各組以10 mL/kg的蒸餾水灌胃。

3.2 大鼠心功能指標(biāo)檢測(cè) 干預(yù)前后采用腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)混合麻醉大鼠，胸前剃毛，大鼠取仰臥位，固定在木板上，應(yīng)用心臟超聲儀，分別測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)等，計(jì)算LVFS、心輸出量(cardiac output, CO)和左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

3.3 ELISA法檢測(cè)血漿BNP的水平 處死大鼠時(shí)腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃冰箱保存，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3.4 定磷法測(cè)定SERCA2a的活性 心肌組織冰水浴機(jī)械勻漿，2 500 r/min離心10 min；酶標(biāo)板加入去離子水、標(biāo)準(zhǔn)溶液和相應(yīng)濃度蛋白液體；樣品稀釋20倍，取25 μL置于酶標(biāo)板中，根據(jù)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，按50∶1配制BCA工作液；各孔加入200 μL BCA工作液，振蕩器上振蕩30 s，37 ℃放置30 min，于570 nm處讀取吸光度(A)值。以蛋白濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測(cè)樣品的吸光值及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到相應(yīng)的樣品濃度。超微量Ca2+-ATP酶檢測(cè)試劑加樣品混勻，37 ℃水浴反應(yīng)10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清、雙蒸水和0.02 mmol/L磷標(biāo)準(zhǔn)液各150 μL、定磷劑應(yīng)用液500 μL混勻，室溫靜止2 min，加終止劑500 μL混勻，室溫靜置5 min，波長(zhǎng)636 nm，光徑0.5 cm，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光值。每小時(shí)每毫克SERCA2a蛋白分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活性單位。計(jì)算公式：組織中SERCA2a活性(U/mg)=(測(cè)定A值-對(duì)照A值)÷(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.02 mmol/L)×6×2.8÷待測(cè)樣本蛋白濃度(g/L)。

3.5 Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞SERCA2a和PLB的蛋白表達(dá)水平 取100 mg心肌組織，加入裂解液，冰上裂解1 h，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用牛血清蛋白封閉，經(jīng)Ⅰ抗結(jié)合后洗膜，Ⅱ抗結(jié)合，洗膜后采用ECL顯色，軟件分析。并以SERCA2a和PLB的平均灰度值與相應(yīng)內(nèi)參照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算SERCA2a/PLB比值。

3.6 莖環(huán)引物實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)大鼠心肌miR-25-3p的表達(dá)水平 取大鼠心室肌組織100 mg勻漿后，用TRIzol法抽提心肌總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，莖環(huán)引物實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定miR-25-3p的表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)均由廣州維伯鑫生物科技有限公司完成。具體引物序列見表1。

表1 莖環(huán)引物實(shí)時(shí)定量PCR引物

RT: reverse transcription; F: forward; R: reverse.

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況

采用阿霉素腹腔注射法造模共60只，造模過(guò)程中有21只大鼠因出現(xiàn)重度心衰和肝硬化腹水而死亡，死亡率為35%；LVFS不達(dá)標(biāo)9只，成模率為50%。30只成功造模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、心康方組和卡托普利組，術(shù)后體重分別為(325.0+50.8)g、(334.4 ±58.9)g和(342.3±77.1)g，均明顯低于正常對(duì)照組的(443.2±69.3)g和假手術(shù)組的(444.7±44.5)g (P<0.01)；術(shù)后5周內(nèi)模型組、心康方組和卡托普利組大鼠體重有不同程度回升，分別為(343.5±86.1)g、(488.1±29.6)g和(484.4±28.7)g，心康方組和卡托普利組明顯高于模型組(P<0.01)。

2 大鼠心功能指標(biāo)

干預(yù)后，模型組LVFS、CO和LVEF明顯低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)；心康方組和卡托普利組LVFS、CO和LVEF明顯高于模型組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2。

3 血漿BNP的水平

模型組血漿BNP水平顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)，心康方組和卡托普利組顯著低于模型組(P<0.01)，見表2。

4 大鼠心肌SERCA2a的活性

模型組SERCA2a的活性顯著低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.01)，心康方組的SERCA2a活性顯著高于模型組(P<0.05)，卡托普利組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖1。

5 大鼠心肌細(xì)胞SERCA2a和PLB的蛋白表達(dá)水平

模型組SERCA2a和PLB的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0．01)。心康方組和卡托普利組SERCA2a和PLB的表達(dá)水平顯著高于模型組(P<0．01)。心康方組SERCA2a/PLB比值顯著高于模型組(P<0．05)，卡托普利組與模型組比較無(wú)明顯差異，見圖2。

表2 大鼠心功能指標(biāo)與血漿的BNP水平

**P<0．01vsnormal group;##P<0．01vsmodel group.

Figure 1.Myocardial SERCA2a activity in the rats. Mean±SD.n=6.**P<0．01vsnormal group;#P<0．05vsmodel group.

圖1 大鼠心肌SERCA2a活性

6 大鼠心肌miR-25-3p的表達(dá)水平

模型組miR-25-3p的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0．01)，心康方組和卡托普利組明顯高于模型組(P<0．01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。

討 論

作為Ca2+儲(chǔ)存庫(kù)，肌漿網(wǎng)通過(guò)SERCA2a在舒張期回?cái)zCa2+，積極維持心肌細(xì)胞在收縮和舒張過(guò)程中的Ca2+濃度。衰竭心臟中SERCA2a的含量和/或活性下降使肌漿網(wǎng)攝取Ca2+減少，胞漿中Ca2+濃度下降速度和幅度不足，心肌舒張延緩和不夠充分；肌漿網(wǎng)的Ca2+儲(chǔ)存量減少，心肌收縮時(shí)釋放的Ca2+減少，心肌收縮功能下降[3]。SERCA2a的含量與心臟指數(shù)、肺動(dòng)脈壓等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相關(guān)，與去甲腎上腺素正相關(guān)，與心鈉素的mRNA含量負(fù)相關(guān)[9]。心肌SERCA2a活性主要受PLB調(diào)控，PLB與SERCA2a結(jié)合可誘導(dǎo)其構(gòu)象變化，減少SERCA2a與Ca2+的親和力，降低肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率；SERCA2a/PLB比值降低可抑制SERCA2a活性[3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SERCA2a具有正性肌力和正性變舒效應(yīng)，能夠提高心肌收縮力和改善舒張功能[3]。有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)轉(zhuǎn)染SERCA2a，可以改善重度收縮期心衰患者的癥狀，降低死亡率和心衰相關(guān)住院率，減少心衰加重情況[4]，但Greenberg等[10]的研究卻未能取得預(yù)期效果。

Figure 2.The relative expression of SERCA2a and PLB in the rat cardiomyocytes. Mean±SD.n=6.**P<0．01vsnormal group;##P<0．01vsmodel group.

圖2 大鼠心肌細(xì)胞SERCA2a和PLB的相對(duì)表達(dá)水平

Figure 3.The relative expression of miR-25-3p in rat myocar-dium. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsnormal group;##P<0.01vsmodel group.

圖3 大鼠心肌 miR-25-3p 的相對(duì)表達(dá)水平

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守的由18至25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，主要見于基因的內(nèi)含子(intron)，有些則存在于基因間隔區(qū)的轉(zhuǎn)錄單位。作為基因的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，miRNA主要通過(guò)抑制蛋白質(zhì)翻譯或mRNA降解調(diào)控基因表達(dá)[11]。miR-25在重癥心衰患者的心肌標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-25選擇性作用于SERCA2a mRNA 3’非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，干擾SERCA2a的合成,從而降低心肌SERCA2a水平；通過(guò)給經(jīng)主動(dòng)脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的心衰小鼠注射anti-miR-25可以降低miR-25水平，增加SERCA2a水平。

本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)阿霉素腹腔注射建立大鼠CHF模型，可以觀察到CHF大鼠SERCA2a蛋白表達(dá)水平明顯降低，miR-25-3p表達(dá)水平明顯升高，推測(cè)miR-25-3p抑制了SERCA2a蛋白合成，導(dǎo)致SERCA2a蛋白表達(dá)水平明顯降低。中藥心康方能明顯降低miR-25-3p表達(dá)水平，增加SERCA2a蛋白表達(dá)水平，推測(cè)可能是中藥心康方降低miR-25-3p表達(dá)水平，miR-25-3p對(duì)SERCA2a的抑制作用減弱，SERCA2a蛋白合成增加。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CHF大鼠SERCA2a蛋白表達(dá)水平降低的同時(shí)，PLB的蛋白表達(dá)水平也降低，但是PLB的降幅少于SERCA2a，SERCA2a/PLB比值降低，這與既往的研究結(jié)果相一致[3]；中藥心康方提高SERCA2a蛋白表達(dá)水平的同時(shí)也提高PLB的蛋白表達(dá)水平，但是，PLB的升幅少于SERCA2a，SERCA2a/PLB比值升高，沒有與PLB結(jié)合的SERCA2a蛋白增加，SERCA2a活性增強(qiáng)，心肌收縮和舒張功能得以改善。

本研究證明，通過(guò)非基因治療的口服藥物治療也能調(diào)節(jié)SERCA2a含量和活性，為以SERCA2a為靶點(diǎn)的心衰治療提供新的思路和方法，也為該中藥的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。另外，有研究指出miR-25通過(guò)下調(diào)線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial calcium uniporter，MCU)而抗氧化損傷，減輕線粒體Ca2+超載和細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞[12]。中藥心康方抑制miR-25-3p的綜合效應(yīng)尚待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of Xinkang recipe on myocardial miR-25-3p expression and SERCA2a activity in heart failure rats

WU Jin-bo1, 2, YE Xiao-han1, XIAN Shao-xiang3, DONG Ming-guo1

(1PostdoctoralResearchStation,GuangzhouUniversityofTraditionalChinesMedicine,Guangzhou510405,China;2DepartmentofCardiology,DongguanHospitalofTraditionalChineseMedicine,Dongguan523000,China;3DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China.E-mail:wujinbocn@163.com)

AIM: To investigate the effects of Xinkang recipe on myocardial miR-25-3p expression and sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a (SERCA2a) activity in heart failure rats.METHODS: Male SD rats were randomly divided into normal group, sham group, model group, Xinkang recipe group (Xinkang group), and captopril group. The heart failure rat model was induced by intraperitoneal injection of doxorubicin. Distilled water, Xinkang recipe and captopril were administrated by gastric gavage for 35 d, respectively. The indexes of cardiac function and plasma level of brain natriuretic peptide (BNP) were measured. The SERCA2a activity was determined by the inorganic phosphorus method. The myocardial protein expression of SERCA2a and phospholamban (PLB) was detected by Western blot. The myocardial expression of miR-25-3p was detected by stem-loop RT-qPCR. RESULTS: Cardiac output (CO), left ventricular fractional shortening (LVFS) and left ventricular ejection fraction (LVEF) in Xinkang group and captopril group were significantly higher while the plasma levels of BNP were significantly lower than those in model group (P<0．01). The myocardial expression levels of miR-25-3p in Xinkang group and captopril group were significantly lower while the myocardial protein le-vels of SERCA2a and PLB were significantly higher than those in model group (P<0．01). The SERCA2a/PLB ratio and SERCA2a activity in Xinkang group were significantly higher than those in model group (P<0．05), and no significant change was observed between captopril group and model group.CONCLUSION: Xinkang recipe therapy may improve cardiac function in heart failure rats, which may be related to inhibiting the expression of miR-25-3p, increasing the SERCA2a/PLB ratio and enhancing SERCA2a activity in the myocardium.

Xinkang recipe; Heart failure; MicroRNA; Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a; Phospholamban

1000- 4718(2016)10- 1770- 05

2016- 07- 08

2016- 09- 01

△通訊作者 Tel: 0769-26385087； E-mail: wujinbocn@163.com

R541.6； R289

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.007

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