高脂飼養(yǎng)致小鼠胰島素抵抗對(duì)脂肪肝形成的影響*

韋雪梅， 邱 霓， 熊 燕

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 511436)

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高脂飼養(yǎng)致小鼠胰島素抵抗對(duì)脂肪肝形成的影響*

韋雪梅▲， 邱 霓▲， 熊 燕△

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州蛇毒研究所，廣東 廣州 511436)

目的： 探討高脂飼養(yǎng)致小鼠脂肪肝形成的機(jī)制。方法：隨機(jī)將8周雄性C57BL/6J小鼠分成高脂飼養(yǎng)組(給予含60%卡路里的高飽和脂肪酸飼養(yǎng))和正常對(duì)照組，飼養(yǎng)12周。監(jiān)測(cè)體重、肝重、血甘油三酯、血總膽固醇、血糖和血胰島素水平，通過(guò)高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)反映胰島素敏感性，HE染色、蘇丹IV染色及肝脂含量反映肝組織脂質(zhì)沉積情況，確定高脂飼養(yǎng)致小鼠脂肪肝的形成。通過(guò)Western blot法檢測(cè)磷酸化胰島素受體底物1(IRS1)和蛋白激酶B(Akt)水平反映胰島素信號(hào)通路激活情況，檢測(cè)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)和脂肪酸合成酶(FAS)蛋白水平反映肝內(nèi)脂質(zhì)合成的情況。結(jié)果：高脂飼養(yǎng)組小鼠體重及肝重較正常對(duì)照組小鼠明顯增加。與正常對(duì)照組相比，高脂組血和肝組織內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量顯著升高，血清胰島素水平升高，葡萄糖輸注率減少，磷酸化IRS1和Akt水平降低。肝組織HE染色可見(jiàn)高脂組肝細(xì)胞胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡，蘇丹IV染色可見(jiàn)肝細(xì)胞內(nèi)存在大量大小不一的紅色脂滴；SREBP-1和FAS蛋白水平明顯升高。給予外源性油酸干預(yù)原代正常肝細(xì)胞48 h，磷酸化IRS1和Akt水平呈濃度依賴性減低，而SREBP-1和FAS蛋白表達(dá)明顯升高。結(jié)論：高脂飼養(yǎng)導(dǎo)致小鼠肝臟發(fā)生胰島素抵抗，并通過(guò)激活SREBP-FAS脂肪合成途徑，促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積，從而誘發(fā)脂肪肝。

胰島素抵抗； 脂肪肝； 高脂飲食

隨著全球肥胖人數(shù)的劇增，因肥胖所致的一系列代謝性疾病的發(fā)生率也隨之增加[1]。飲食習(xí)慣的改變，大量高脂、高糖食物的攝入，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)過(guò)剩，是誘發(fā)肥胖的重要因素。胰島素抵抗(insulin resis-tance,IR)是肥胖的主要特征之一，也是代謝性疾病如2 型糖尿病、心血管疾病、非酒精性脂肪肝等發(fā)展過(guò)程中重要的病理基礎(chǔ)[2]。

肥胖患者脂肪組織內(nèi)脂肪分解代謝活動(dòng)旺盛，使細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(triglyceride，TG)分解釋放游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)增加，血液的游離脂肪酸水平升高，導(dǎo)致大量的游離脂肪酸進(jìn)入肝臟和骨骼肌組織中，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，促進(jìn)脂肪肝的形成[3]。脂肪肝作為肝臟疾病的重要病理過(guò)程，如不及時(shí)治療，可能加重并發(fā)生肝組織纖維化，甚至肝硬化。肝臟是胰島素作用的主要靶器官之一；大量臨床資料顯示，幾乎所有肥胖伴脂肪肝患者都存在周圍組織和肝臟的胰島素抵抗，且胰島素抵抗的嚴(yán)重程度與脂肪肝的病情進(jìn)展密切相關(guān)[4-5]，但胰島素抵抗促脂肪肝形成的分子機(jī)制仍未完全闡明，因此深入探討胰島素抵抗所致脂肪肝形成的分子機(jī)制，將有助于預(yù)防和治療肥胖所致脂肪肝的形成。

本研究擬以高脂飼養(yǎng)致肥胖小鼠和經(jīng)油酸處理的原代小鼠肝細(xì)胞為模型，觀察高脂對(duì)肝臟組織及肝細(xì)胞胰島素敏感性及脂質(zhì)形成的影響，以探討肥胖致胰島素抵抗誘導(dǎo)脂肪肝形成的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 抗體和試劑

胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)、p-Akt(Ser473)和Akt抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；p-IRS1(Tyr632)抗體購(gòu)自 Santa Cruz; HRP 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG、ECL 超敏發(fā)光液和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；油酸(oleic acid，OA)購(gòu)自Sigma。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 高脂飼養(yǎng)小鼠模型的建立 30只 8周齡雄性 C57BL/6J小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照(control)組和高脂飼養(yǎng)(high-fat diet，HFD)組，分別給予10%卡路里普通飼料和60%卡路里的高脂飼料喂養(yǎng)12周，每周記錄體重變化。實(shí)驗(yàn)用普通飼料和高脂飼料均購(gòu)買于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2.2 高胰島素正葡萄糖鉗夾試驗(yàn) 高脂飼養(yǎng)第10周末，2組小鼠用10%的水合氯醛(按1 mL/300 g小鼠體重)經(jīng)腹腔注射麻醉后，行頸靜脈埋管術(shù)，待小鼠恢復(fù)1周。在第12周鉗夾前1天晚給予小鼠禁食不禁水12 h；鉗夾當(dāng)天通過(guò)Harvard微量注射泵分別以25 mU/kg的初始濃度和4 mU·kg-1·min-1的維持濃度，持續(xù)120 min靜脈泵入胰島素，同時(shí)以30%葡萄糖液持續(xù)靜脈泵入。每10 min通過(guò)鼠尾靜脈測(cè)定1次血糖值，及時(shí)調(diào)節(jié)葡萄糖溶液的輸注速度，以維持正常血糖水平。待血糖值穩(wěn)定后，記錄最后1 h內(nèi)葡萄糖輸注速率以評(píng)價(jià)胰島素敏感性[6]。

2.3 血糖、血胰島素、血脂和肝臟脂質(zhì)的測(cè)定 雄性小鼠眼球取血，血液凝固后，以3 000 r/min，4 ℃離心10 min分離血清，-80 ℃保存。血清采用南京建成生物工程研究所的總膽固醇(total cholesterol，TC)和TG含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。血清胰島素按照武漢華美生物有限公司的小鼠胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。血糖采用電子感應(yīng)法，用Roche的優(yōu)越血糖儀測(cè)定鼠尾靜脈血糖濃度。

小鼠處死后，迅速取出肝臟并置于液氮中，隨后在-80 ℃保存。取出約30 mg肝臟組織，于300 mL生理鹽水中剪碎并勻漿；12 000 r/min、4 ℃離心10 min后取上清到另一離心管內(nèi)。用BCA法測(cè)定蛋白濃度并調(diào)整各樣本至統(tǒng)一濃度。測(cè)量方法同血脂測(cè)定。

2.4 HE染色 小鼠頸椎脫臼法處死后迅速取出肝臟組織，稱重后取部分肝組織以10%的甲醛溶液固定，制作常規(guī)石蠟切片，行HE染色，在Leica光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

2.5 蘇丹Ⅳ染色 小鼠頸椎脫臼法處死后迅速取出部分肝臟組織包埋于OCT中，于冰凍切片機(jī)中進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為5 μm。將冰凍切片置于丙二醇中靜止2 min后，置于蘇丹Ⅳ染色缸內(nèi)染色20 min；然后，將玻片分別置于85%乙醇、50%丙二醇中分化，用蘇木精細(xì)胞核復(fù)染1 min，封片后在Leica光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 小鼠原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 小鼠麻醉后，打開(kāi)腹腔經(jīng)下腔靜脈插管，先以流速為5.5 mL/min灌注D-Hanks液(含10 mmol/L HEPES和0.5 mmol/L EDTA， pH 7.4， 37 ℃)，待肝臟充分膨脹后，剪斷門靜脈；繼續(xù)灌流3 min 后，改用含0.1%胰蛋白酶的D-Hanks液灌注，流速為4.5 mL/min；見(jiàn)包膜下肝組織呈龜背狀裂開(kāi)，取下肝臟，用4 ℃預(yù)冷PBS清洗肝臟，撕開(kāi)包膜，制成肝細(xì)胞懸液。100目細(xì)胞篩過(guò)濾后，4 ℃、400 r/min離心5 min，棄上清，以含10% 胎牛血清的高糖DMEM重懸細(xì)胞，接種到6孔板中；5% CO2、37 ℃培養(yǎng)4 h后更換新鮮完全培養(yǎng)基，次日加藥處理。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 取肝臟組織約30 mg，加入300 μL RIPA(含100 μmol/L PMSF)，用彎眼科剪剪碎組織，使用機(jī)械勻漿機(jī)勻漿后，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清；采用BCA法測(cè)蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；用含5%脫脂奶粉封閉1 h 后依次加入 I 抗和 II 抗，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，通過(guò)ChemiDoxTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度掃描。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 11.5 和Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高脂飼養(yǎng)對(duì)小鼠體重、肝臟重量的影響

飼養(yǎng)12周后，高脂飼養(yǎng)組小鼠體重明顯超過(guò)正常對(duì)照組(P<0.01)；高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟重量也較正常對(duì)照組增加(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，高脂飼養(yǎng)組小鼠的肝臟質(zhì)量/體重比也明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 高脂飲食組和正常對(duì)照組小鼠體重、肝重及肝重/體重的比較

Table 1.The body weight, liver weight and ratio of liver weight to body weight in control group and HFD group (Mean±SD.n=10)

GroupBodyweight(g)BeforeAfterLiverweight(g)Liverweight/bodyweightControl22．5±1．730．6±1．11．25±0．200．041±0．006HFD22．3±1．337．2±1．6??1．71±0．12?0．048±0．002?

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2 高脂飼養(yǎng)對(duì)小鼠葡萄糖、胰島素及胰島素敏感性的影響

雖經(jīng)高脂飼養(yǎng)12周后，高脂飼養(yǎng)組和正常對(duì)照組小鼠空腹血糖濃度無(wú)顯著差異，但高脂飼養(yǎng)組小鼠的血清胰島素水平比正常對(duì)照組升高近2倍(P<0.01)，見(jiàn)表2；同時(shí)，高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高脂飼養(yǎng)組小鼠平均葡萄糖輸注率為(24.32±2.45) mg·kg-1·min-1，較正常對(duì)照組[(65.67±5.31) mg·kg-1·min-1]減低(P<0.01)，說(shuō)明為維持正常血清葡萄糖水平，在給予同等水平外源性胰島素的情況下，高脂飼養(yǎng)組小鼠對(duì)外源性葡萄糖的處理能力僅為正常對(duì)照組的1/3水平(圖1)。上述結(jié)果表明高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠已處于胰島素抵抗階段。

Figure 1.The result of hyperinsulinemic englycemic clamp experiment. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖1 小鼠高胰島素正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 高脂飼養(yǎng)致肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

正常對(duì)照組小鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，質(zhì)地柔軟；而高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟色澤較正常組暗淡，偏向于黃色，質(zhì)地偏硬。HE染色可見(jiàn)高脂飼養(yǎng)組小鼠出現(xiàn)不同程度的彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，表現(xiàn)為肝細(xì)胞的胞漿內(nèi)充滿大量脂肪空泡。蘇丹IV染色結(jié)果顯示，對(duì)照組肝臟中未見(jiàn)明顯的脂滴沉積，而高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟中存在大量大小不一的紅色脂滴，進(jìn)一步提示高脂導(dǎo)致小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積顯著增多,見(jiàn)圖2。

Figure 2.The HE staining (A) and Sudan IV staining (B) of the liver (×100).

圖2 肝臟組織HE染色圖和蘇丹IV染色圖

4 高脂飼養(yǎng)對(duì)小鼠血脂和肝脂的影響

高脂飼養(yǎng)顯著增加小鼠血清甘油三酯和總膽固醇濃度(P<0.01)，見(jiàn)表2。與病理形態(tài)學(xué)結(jié)果一致，高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟內(nèi)甘油三酯和總膽固醇的含量明顯高于正常對(duì)照組小鼠(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 高脂飼養(yǎng)組和正常對(duì)照組小鼠血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的比較

Table 2.The serum biochemical indexes in the mice of control group and HFD group (Mean±SD.n=10)

GroupTG(mmol/L)TC(mmol/L)Insulin(mU/L)Glucose(mmol/L)Control0．62±0．322．27±0．559．56±2．315．55±0．18HFD1．48±0．50??3．37±0．60??17．44±4．03??5．82±0．33

**P<0.01vscontrol group.

表3 高脂飼養(yǎng)組和正常對(duì)照組小鼠肝臟脂肪相關(guān)指標(biāo)的比較

Table 3.The contents of TG and TC in the liver of control group and HFD group (mmol/L. Mean±SD.n=10)

GroupTGTCControl3．17±0．952．51±0．27HFD4．94±1．14?2．82±0．14?

*P<0.05vscontrol group.

5 高脂飼養(yǎng)對(duì)小鼠肝臟組織胰島素信號(hào)通路的影響

高脂飼養(yǎng)小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗的表現(xiàn)，肝臟作為胰島素的靶器官之一，是否也存在胰島素抵抗，我們隨后檢測(cè)了肝臟組織的胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白——IRS1和Akt的磷酸化水平。與正常對(duì)照組相比，高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟內(nèi)IRS1的第632位酪氨酸磷酸化水平明顯下調(diào)，表明高脂飼養(yǎng)小鼠肝臟對(duì)胰島素的反應(yīng)性降低，見(jiàn)圖3。

6 高脂飼養(yǎng)對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)合成的影響

為明確肝臟脂肪沉積的機(jī)制，我們檢測(cè)了脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，高脂飼養(yǎng)顯著增加小鼠肝臟內(nèi)脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵蛋白固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1(sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1)及其下游蛋白脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)的表達(dá)，見(jiàn)圖4。

7 油酸促原代肝細(xì)胞胰島素抵抗及脂質(zhì)合成

為進(jìn)一步明確高脂致胰島素抵抗促脂肪肝形成的機(jī)制，我們采用酶消化法體外分離出8周正常雄性小鼠的肝臟細(xì)胞，并給予不同濃度油酸處理48 h。結(jié)果表明，隨著油酸濃度的增加，IRS1磷酸化水平下調(diào)，其下游信號(hào)分子Akt的磷酸化水平也隨之降低(圖5)，而肝細(xì)胞內(nèi)SREBP-1和FAS的蛋白水平逐漸增加(圖6)。

Figure 3.The expression of insulin signaling proteins in the liver of control group and HFD group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vswithout insulin；#P<0.05，##P<0.01vscontrol group.

圖3 肝臟組織胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Figure 4.The expression of lipid synthesis proteins in the liver of control group and HFD group. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖4 肝臟組織脂質(zhì)合成通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Figure 5.The expression of insulin signaling proteins in the primary hepatocytes incubated with oleic acid for 48 h. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol.

圖5 原代正常肝細(xì)胞油酸干預(yù)48 h后胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化情況

討 論

本研究采用高飽和脂肪酸飲食飼養(yǎng)小鼠12周，發(fā)現(xiàn)小鼠體重及血脂水平高于正常對(duì)照組,提示高脂致肥胖小鼠模型建立成功；HE染色發(fā)現(xiàn)高脂飼養(yǎng)小鼠肝臟存在彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性,表明高脂飼養(yǎng)致小鼠脂肪肝形成。目前高脂飲食致脂肪肝的機(jī)制仍不清楚。有研究報(bào)道，高脂飲食可導(dǎo)致胰島素抵抗，表現(xiàn)為空腹胰島素水平增加， 胰島素敏感性降低[7-8]。我們也觀察到高脂飼養(yǎng)小鼠的血胰島素水平增加，機(jī)體對(duì)外源性葡萄糖的清除能力明顯減弱，提示小鼠已存在胰島素抵抗的表現(xiàn)；也進(jìn)一步證實(shí)本研究通過(guò)高飽和脂肪酸飼養(yǎng)致胰島素抵抗小鼠模型成功建立。

Figure 6.The expression of lipid synthesis proteins in the primary hepatocytes incubated with oleic acid for 48 h. Mean±SD.n= 3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

圖6 原代正常肝細(xì)胞油酸干預(yù)48 h后脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白變化情況

肥胖發(fā)生時(shí)，脂肪組織分解形成FFA的能力明顯增加，導(dǎo)致經(jīng)過(guò)門靜脈輸送到肝臟的FFA增加[9]。高FFA水平能干擾胰島素在肝臟組織中與受體結(jié)合，顯著減低胰島素激活的IRS1酪氨酸磷酸化及下游信號(hào)分子Akt等活性，使胰島素的生物效應(yīng)降低，發(fā)生胰島素抵抗[10]。本研究通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝臟組織胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，高脂飼養(yǎng)組小鼠肝臟組織的IRS1酪氨酸磷酸化水平和下游Akt絲氨酸磷酸化水平顯著下降；另外，給予外源性油酸刺激原代肝細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)，IRS1酪氨酸磷酸化水平和下游Akt絲氨酸磷酸化水平的活化呈劑量依耐性抑制，提示高脂不僅使小鼠發(fā)生全身胰島素抵抗，還導(dǎo)致肝臟組織胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損，胰島素敏感性降低。

在正?；A(chǔ)生理狀態(tài)下，肝內(nèi)脂質(zhì)僅有 5%來(lái)源于內(nèi)源性脂質(zhì)從頭合成途徑；然而，在病理狀態(tài)下如高脂環(huán)境，內(nèi)源性脂質(zhì)從頭合成途徑是肝內(nèi)脂質(zhì)沉積的一個(gè)重要來(lái)源[11]。SREBP是調(diào)節(jié)脂質(zhì)從頭合成酶類表達(dá)的最重要的上游轉(zhuǎn)錄因子，其下游靶基因編碼的蛋白為肝臟脂質(zhì)從頭合成的3個(gè)下游關(guān)鍵酶：乙酰輔酶 A 羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、FAS和硬脂酰輔酶A脫飽和酶(stearyl-CoA desaturase，SCD)[13]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，高脂飲食增加小鼠肝臟SREBP-1 蛋白及其下游 FAS 蛋白表達(dá)，這結(jié)果也表明高脂致脂肪肝的形成主要與肝臟內(nèi)脂質(zhì)從頭合成途徑過(guò)度激活有關(guān)。一直以來(lái)，肥胖致肝臟脂質(zhì)沉積和胰島素抵抗之間的因果關(guān)系尚無(wú)定論；有研究者認(rèn)為在脂肪肝形成過(guò)程中是先發(fā)生脂質(zhì)的異常沉積再導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生胰島素抵抗，即所謂的“脂毒性”；也有研究者認(rèn)為是因?yàn)榘l(fā)生了胰島素抵抗才導(dǎo)致脂質(zhì)合成通路的異常激活，從而發(fā)生脂質(zhì)的沉積[4, 10,13]。另外，IRS1/Akt信號(hào)通路對(duì)SREBP-1的作用在不同組織也存在差異。有報(bào)道證實(shí)，在HaCaT cells中，磷酸化的Akt可直接激活SREBP-1，促進(jìn)脂肪酸合成[14]；而在骨骼肌和肝臟中，磷酸化的Akt則主要通過(guò)激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路而抑制SREBP-1的活化[15-17]。在本研究中觀察到，給予外源性油酸刺激原代肝細(xì)胞，導(dǎo)致IRS1/Akt胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受抑制，在尚未出現(xiàn)明顯肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積之前，SREBP-1 蛋白及 FAS 蛋白表達(dá)已明顯升高，提示高脂飲食首先引起肝細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)通路受損，進(jìn)而激活肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)從頭合成信號(hào)通路，促使肝臟發(fā)生脂質(zhì)沉積；但進(jìn)一步的分子機(jī)制還有待后續(xù)深入研究。

綜上所述，長(zhǎng)期高脂飲食導(dǎo)致機(jī)體脂肪代謝紊亂，血脂含量增加，機(jī)體及肝臟組織對(duì)胰島素敏感性下降，肝臟內(nèi)脂質(zhì)從頭合成通路被激活，可能是導(dǎo)致肝臟組織內(nèi)脂質(zhì)大量沉積，脂肪肝形成的主要原因。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of insulin resistance on fatty liver in high-fat diet-fed miceWEI Xue-mei, QIU Ni, XIONG Yan

AIM: To study the influence of insulin resistance on fatty liver in the mice fed with high-fat diet (HFD). METHODS: Male 8-week-old C57BL/6J mice were randomly divided into HFD group (with 60% calories by high saturated fatty acid) and control group (with chow diet).The mice in both groups were fed for 12 weeks. The body weight, liver weight, serum triglyceride (TG) and total cholesterol (TC), and blood glucose and insulin levels were measured. Hyperinsulinemic euglycemic clamp experiment was applied to reflect insulin sensitivity. The lipid deposition in the liver was analyzed by HE staining, Sudan IV staining and measurement of liver fat content. The phosphorylation levels of IRS1 and Akt, and the protein levels of SREBP-1 and FAS were determined by Western blot to reflect the activities of insulin signaling and lipid synthesis. RESULTS: Compared with control group, the body weight and liver weight were significantly increased in HFD group. TG and TC contents in serum and liver tissues were remarkably increased in HFD group. High-fat diet induced insulin resistance, as evidenced by increased serum insulin levels, reduced glucose infusion rate and decreases in IRS1 and Akt phosphorylation levels. In livers of HFD group, HE staining showed that the cytoplasm of hepatocytes was filled with vacuoles. Sudan IV staining also displayed that many different sizes of red lipid drops existed in the hepatocytes, and the protein levels of SREBP-1 and FAS were significantly increased. In primary normal hepatocytes with exogenous oleic acid intervention for 48 h, the phosphorylation levels of IRS1 and Akt were reduced, and the protein expression of SREBP-1 and FAS was significantly increased in a dose-dependent manner. CONCLUSION: Feeding with HFD leads to insulin resistance, resulting in activation of lipid synthesis and accumulation of lipid deposition in the liver, thus inducing fatty liver.

Insulin resistance; Fatty liver; High-fat diet

1000- 4718(2016)10- 1875- 06

2016- 04- 27

2016- 06- 20

中國(guó)博士后基金資助項(xiàng)目(No.2012M521590; No.2013T60792)；廣東省自然科學(xué)基金資金項(xiàng)目(No.s2013040014350)

△ 通訊作者 Tel: 020-37103273; E-mail: xiongyan2001@yahoo.com

▲ 并列第 1 作者

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.022

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