熱痹康湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜P38/NF—κB信號(hào)通路的影響

龐學(xué)豐　蒙宇華

【摘 要】目的：觀察清熱解毒抗風(fēng)濕方藥——熱痹康湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠滑膜P38/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路的影響。方法：將60只SPF級(jí)雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，熱痹康湯低、中、高劑量組，甲氨蝶呤組，每組10只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠采用弗氏不完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)CIA大鼠模型。造模成功后開始給藥，模型對(duì)照組予生理鹽水灌胃，熱痹康湯低、中、高劑量組分別給予熱痹康湯提取物低、中、高劑量灌胃，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤腹腔注射，空白對(duì)照組大鼠自由飲水和進(jìn)食。觀察不同劑量熱痹康湯對(duì)CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信號(hào)通路的影響。結(jié)果：熱痹康湯能下調(diào)CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表達(dá)。結(jié)論：熱痹康湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用與抑制滑膜P38/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；熱痹康湯；P38 MAPK；NF-κB；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（熱痹康湯）on the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of rats with arthritis induced by collagen（CIA）.Methods：Sixty female Wistar rats of grade SPF were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，middle and high dose Rebikang groups，and a methotrexate group，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by typeⅡ collagen to establish CIA rat models.Rat models in the model control group were given intragastric administration of physiological saline.Models in the low，middle and high dose Rebikang groups were given intragastric administration of low，middle and high dose of Rebikang Tang.Rat models in the methotrexate group were given intraperitoneal injection of methotrexate.Rats in the blank control group were only fed with water and food.Effect of Rebikang Tang on the P38/NF-κB signal pathway in each group was observed.Results：Rebikang Tang could down-regulate the expression of related molecules P38 MAPK，NF-κB/P65 and IκBα of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of CIA rats.Conclusion：The role of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis is related to the inhibition of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane.

【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（熱痹康湯）；P38 MAPK；NF-κB；rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoed arthritis，RA）的病因迄今尚未完全明確，未經(jīng)系統(tǒng)規(guī)范治療將會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)破壞和功能喪失。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐，在RA等免疫相關(guān)性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，而P38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在該細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要的中介作用，可能成為RA治療的新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過熱痹康湯對(duì)CIA大鼠滑膜細(xì)胞P38/NF-κB信號(hào)通路影響的研究，進(jìn)一步明確其治療RA的作用原理。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)雌性Wistar大鼠

60只，體質(zhì)量（110±10）g，購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：桂醫(yī)動(dòng)字第11005號(hào)。不限制飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性鼠顆粒飼料飼養(yǎng)1周后，按計(jì)劃進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2 試 劑 牛Ⅱ型膠原蛋白（南京奧多福尼生物科技有限公司）；不完全弗氏佐劑（美國Sigma公司）；P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche公司）；水合氯醛（美國Life technologies公司）；冰醋酸[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 注射用甲氨蝶呤（MTX，5 mg，廣州嶺南制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20054692）。熱痹康湯提取物（RBK）是使用乙醇對(duì)熱痹康湯（秦艽10 g、防風(fēng)10 g、桂枝4 g、威靈仙15 g、制川烏6 g、地龍10 g、桑枝10 g、葛根15 g、忍冬藤20 g、青風(fēng)藤10 g、黃柏10 g、蒼術(shù)10 g）進(jìn)行萃取、溶解并提取上清液制成，實(shí)驗(yàn)前按比例加入乙醇和生理鹽水進(jìn)行溶解配制備用，具體由本院新藥研發(fā)中心制備。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)造模及分組 將所有大鼠放置于鼠籠中進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，觀察7 d后隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，熱痹康湯低、中、高劑量組，MTX組，每組10只。除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠參照文獻(xiàn)[1]方法依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模：在無菌實(shí)驗(yàn)條件下，用冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原蛋白（操作于冰面上進(jìn)行），隨后把它和等體積的弗氏不完全佐劑一起注入醫(yī)用三通管內(nèi)，用注射器互相推吸充分混合乳化成油包水狀，即成CⅡ乳劑，放置4 ℃冰箱保存過夜備用。進(jìn)行造模時(shí)，分別于大鼠背、尾部皮內(nèi)多點(diǎn)注射CⅡ乳劑，14 d后再次注射CⅡ乳劑進(jìn)行免疫（方法和劑量同前）。評(píng)分在4分以上，大鼠四肢足爪均嚴(yán)重腫脹、踝關(guān)節(jié)直徑增長幅度≥2 mm則為造模成功。本次實(shí)驗(yàn)中大鼠造模全部成功，并且沒有死亡大鼠。

2.2 藥物干預(yù) 造模成功后開始給藥，模型對(duì)照組予生理鹽水2 mL·（100 g）-1灌胃，每日

1次；MTX組以MTX 5 mg溶于10 mL生理鹽水為

0.5 mg·mL-1，按70 kg人體質(zhì)量與200 g大鼠換算系數(shù)為0.018，按MTX每周1.9 mg·kg-1腹腔注射給藥；熱痹康湯高劑量組予RBK31.25 g·（100 g）-1·d-1

灌胃，中劑量組予15 g·（100 g）-1·d-1灌胃，低劑

量組予7.5 g·（100 g）-1·d-1灌胃，每日分2次進(jìn)行；空白對(duì)照組大鼠自由飲水和進(jìn)食。

2.3 取材及組織處理 28 d后，所有大鼠以水合氯醛進(jìn)行腹腔注射，迅速麻醉后頸椎脫臼法處死，逐層分離膝關(guān)節(jié)各層組織，打開關(guān)節(jié)腔，可見由髕骨下極向下延續(xù)有一層淺淡黃色平滑光亮的滑膜組織，用手術(shù)刀片小心切下，再用眼科直鑷進(jìn)行鈍性分離并完整剝離滑膜組織，冰凍保存?zhèn)錅y(cè)。

2.4 P38和NF-κB檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)中采用Western blot 法依次檢測(cè)各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞P38MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表達(dá)，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，步驟如下：于低溫下將各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行勻漿，隨后加入適量蛋白裂解液，放置于冰上40 min，置入12 000 r·min-1離心機(jī)進(jìn)行離心后取上清。以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，應(yīng)用Bradford 法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量。選取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜上，一起放入封閉液中37 ℃封閉1 h；一抗4 ℃過夜。實(shí)驗(yàn)中采用不含抗體TBS-T液孵育作為陰性對(duì)照。多次反復(fù)洗膜后，將膜與堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgG抗體進(jìn)行孵育，輕輕搖蕩1 h（室溫下進(jìn)行），再次洗膜后，用Western blot印跡進(jìn)行觀察研究，最后采用圖像分析測(cè)定各帶吸光度（A）值作定量分析，作出結(jié)果判斷。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用方差分析或t檢驗(yàn)對(duì)各組間資料進(jìn)行比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的滑膜細(xì)胞P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表達(dá)量均有不同程度的升高（P < 0.05）。與模型對(duì)照組比較，熱痹康湯各治療組與MTX組大鼠滑膜細(xì)胞P38 MAPK、

NF-κB/P65的表達(dá)量均有降低（P < 0.05或P < 0.01）。低劑量RBK對(duì)大鼠滑膜細(xì)胞IκBα無明顯抑制作用，高、中劑量RBK與MTX對(duì)大鼠滑膜細(xì)胞IκBα的表達(dá)均有抑制作用。見圖1、表1。

4 討 論

RA的發(fā)病過程中存在著眾多細(xì)胞因子的參與，P38/NF-κB信號(hào)通路在細(xì)胞因子的激活過程中起著“開關(guān)”作用，研究表明，P38 MAPK是炎性細(xì)胞應(yīng)答過程中最重要的家族成員之一，

P38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路可被多種刺激因子激活，可參與細(xì)胞的多種生理過程[2]。研究資料證實(shí)，P38 MAPK可調(diào)控與RA骨侵蝕有關(guān)的破骨細(xì)胞的

分化[3]。

NF-κB與抑制物IκB結(jié)合以后存在于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，但其本身沒有活性，主要通過降解IκB而激活[4]。NF-κB活化后啟動(dòng)炎癥遞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)IκB的表達(dá)增強(qiáng)，新生的IκB進(jìn)入細(xì)胞核后與NF-κB反應(yīng)，使NF-κB從DNA上解離并轉(zhuǎn)移到胞漿中，變成無活性狀態(tài)，IκB還與游離的NF-κB結(jié)合，抑制其活化[5]。研究表明，體內(nèi)NF-κB信號(hào)通路的活化過程調(diào)控是通過經(jīng)細(xì)胞外的正反饋途徑以及經(jīng)細(xì)胞內(nèi)、外的負(fù)反饋途徑實(shí)現(xiàn)的[6]。

NF-κB的調(diào)控與活化在RA的病理變化占有重要地位。在RA發(fā)病的過程中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-2、IL-8等致炎細(xì)胞因子均是通過NF-κB信號(hào)通路，激活相關(guān)因子，參與免疫應(yīng)答過程，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)的損傷。本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在致炎后的膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠中NF-κB的活性明顯升高，結(jié)果提示，NF-κB參與了膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的炎癥調(diào)控過程。有研究表明，NF-κB表達(dá)增加與MAPK信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)有關(guān)，如TNF-α和IL-1等通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，進(jìn)而激活中性鞘磷脂酶，再進(jìn)一步活化神經(jīng)酰胺活化蛋白而激活MAPK通路，誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)而產(chǎn)生炎性因子[7]。因此，抑制P38/NF-κB信號(hào)通路的活化成為RA新的治療

靶點(diǎn)。

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹病”“歷節(jié)病”等范疇，多因稟賦不足，人體正氣虧虛，衛(wèi)外不固，或病后、產(chǎn)后腠理疏松，感受濕熱之邪，痹阻肌肉、經(jīng)絡(luò)，氣血凝滯而致。本虛標(biāo)實(shí)是本病的病理性質(zhì)，本虛為氣血、陰陽、臟腑虧損，標(biāo)實(shí)為外受濕熱之邪。熱痹康湯是筆者根據(jù)多年臨床體會(huì)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒、利濕除痹止痛功效，前期臨床應(yīng)用表明具有較好的療效，無明顯毒副作用[8]。前期課題研究發(fā)現(xiàn)，熱痹康湯能降低CIA大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α及基質(zhì)金屬蛋白酶-3水平，升高IL-4、IL-10的水平[9-12]。

本研究結(jié)果提示，熱痹康湯對(duì)P38 MAPK、NF-κB/P65以及IκBα的表達(dá)均有抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴型，能下調(diào)CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，這一研究結(jié)果為熱痹康湯對(duì)RA的靶向治療及臨床研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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收稿日期：2016-08-24；修回日期：2016-09-22