UHPLC-MS/MS法測定雷公藤甲素人血漿蛋白結(jié)合率

柏小輝 潘榮華 芮國華 趙艷美 楊旭東

江蘇省溧陽市中醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇溧陽213300

UHPLC-MS/MS法測定雷公藤甲素人血漿蛋白結(jié)合率

柏小輝 潘榮華 芮國華 趙艷美 楊旭東

江蘇省溧陽市中醫(yī)院腎臟內(nèi)科，江蘇溧陽213300

目的研究雷公藤甲素在人血漿中的蛋白結(jié)合率。方法采用UHPLC-MS/MS法測定透析內(nèi)液及外液中雷公藤甲素濃度，同時(shí)估算其與人血漿的蛋白結(jié)合率。結(jié)果雷公藤甲素的線性關(guān)系、精密度與準(zhǔn)確度、提取回收率和穩(wěn)定性均符合方法學(xué)要求。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素低、中、高（0.8、0.4、0.2 μg/mL）3個(gè)濃度中，雷公藤甲素的人血漿蛋白結(jié)合率分別為（88.61±1.45）%、（89.28±2.64）%、（88.67±1.59）%。結(jié)論雷公藤甲素與人血漿具有高強(qiáng)度蛋白結(jié)合率。

雷公藤甲素；血漿蛋白結(jié)合率；平衡透析法；超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜

雷公藤甲素（Tripto1ide）為衛(wèi)矛科木質(zhì)藤本植物雷公藤（Tripterygium wi1fordii）中分離得到的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯類成分，是雷公藤中的活性成分之一［1-3］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，雷公藤甲素具有一系列藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、免疫抑制等藥理作用［4-7］，其中其顯著的抗腫瘤活性越來越得到臨床的認(rèn)可，是潛在的抗腫瘤候選藥物。但是，雷公藤甲素治療窗十分小，同時(shí)，在臨床治療中常常出現(xiàn)多種不良反應(yīng)。另外，有研究表明，雷公藤甲素不僅是雷公藤制劑的有效成分而且也是有毒成分［8-10］。

藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥動(dòng)學(xué)主要參數(shù)之一，和藥物的療效有重要的關(guān)系。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，未見雷公藤甲素有關(guān)血漿蛋白結(jié)合率的報(bào)道。本試驗(yàn)采用平衡透析法研究雷公藤甲素在人血漿蛋白中的結(jié)合率，并建立UHPLC-MS/MS法測定雷公藤甲素在人血漿中的濃度，為進(jìn)一步開展藥代動(dòng)力學(xué)研究提供借鑒。

1 儀器與材料

Agi1ent G6430 LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agi 1ent公司，所配高效液相儀為Agi1ent 1290）；MassHunter數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（version B.05.00）；CentriVap離心濃縮儀（美國照生公司）；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；Maxima超純水機(jī)（美國基因公司）；Biofuge PrimoR冷凍高速離心機(jī)（德國Heraeus公司）；透析袋（美國聯(lián)合碳化公司，14000 D，壓平寬度25 mm）；病毒滅活冰凍人血漿（江蘇省血液中心）。

對照品雷公藤甲素（批號(hào)111567-201404，中國食品藥品檢定研究院）、潑尼松龍（批號(hào)100153-201405，中國食品藥品檢定研究院）；實(shí)驗(yàn)用水為哇哈哈純凈水。

2 方法

2.1 色譜質(zhì)譜條件

Phenomenex Gemini C18色譜柱（3 μm，100 mm× 2.0 mm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%冰醋酸水溶液（含2 mmo1/L醋酸銨）=75∶25；流速：200 μL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：2 μL。離子源：電噴霧電離源（ESI）；正離子方式檢測；定量模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；干燥氣溫度：400℃；毛細(xì)管電壓：4000 V；雷公藤甲素的裂解電壓（Fragmentor）及碰撞電壓（CE）值分別為90、5 V；潑尼松龍（內(nèi)標(biāo)）的Fragmentor及CE值分別為100、20 V。檢測對象：雷公藤甲素m/z 378.2→m/z 361.1；內(nèi)標(biāo)m/z 361.3→m/z 147.0。

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白PBS溶液制備精密稱定2.70gKH2PO4、18.31 g K2HPO4·3H2O、11.18 g KC1，置于1 L容量瓶中，超純水稀釋并定容至1 L，得pH=7.4的PBS溶液［11-12］。

2.2.2 制備對照品儲(chǔ)備液精密稱定雷公藤甲素10.12mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲10 min，搖勻，即得濃度為1012 μg/mL雷公藤甲素儲(chǔ)備液；精密稱定潑尼松龍10.04 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲10 min，搖勻，即得濃度為1004 μg/mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.2.3 制備透析外液分別精密稱定雷公藤甲素8、4、2 mg，加入適量PBS溶液溶于1 L容量瓶，超聲30 min，PBS溶液定容至刻度，搖勻，分別取上述溶液適量，用PBS溶液稀釋10倍，即得濃度為0.8、0.4、0.2 μg/mL的透析外液。

2.3 樣品處理

2.3.1 透析內(nèi)液淵血漿冤吸取100 μL透析內(nèi)液樣品，加入濃度為1 μg/mL內(nèi)標(biāo)潑尼松龍10 μL，震蕩30 s，加入萃取溶劑乙酸乙酯1.5 mL，震蕩5 min，12000 r/min離心5 min，移出上清液。30℃下氮?dú)獯蹈桑?00 μL 75%甲醇復(fù)溶，震蕩5 min，12 000 r/min離心5 min，2 μL上清液進(jìn)行LC-MS分析。

2.3.2 透析外液淵PBS冤吸取透析外液100 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下操作流程處理。

2.4 平衡透析試驗(yàn)

透析袋預(yù)處理后備用，將其中一端扎緊，并加入1 mL空白人血漿，扎緊透析袋的另一端，同時(shí)袋內(nèi)保留部分空氣，將扎好的透析袋置于裝有30 mL含雷公藤甲素PBS溶液的帶蓋玻璃瓶中，調(diào)節(jié)透析袋的位置，保證袋內(nèi)血漿與袋外PBS溶液液面一致，保證透析袋不接觸瓶壁，將玻璃瓶放入4℃冰箱中。當(dāng)透析袋內(nèi)外液藥物擴(kuò)散平衡后，透析實(shí)驗(yàn)即結(jié)束，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用10%高氯酸溶液檢測袋外PBS溶液，驗(yàn)證袋內(nèi)血漿蛋白是否漏出。

圖1 雷公藤甲素及內(nèi)標(biāo)色譜圖

3 結(jié)果

3.1 專屬性

在本實(shí)驗(yàn)檢測方法下，雷公藤甲素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別約為1.17、1.12 min，未發(fā)現(xiàn)有其他物質(zhì)干擾檢測，見圖1。

3.2 線性關(guān)系

3.2.1 透析內(nèi)液樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線用甲醇溶液對雷公藤甲素儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋，制備7個(gè)濃度梯度的系列工作液。分取雷公藤甲素工作液10 μL，加入空白血漿100 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，取2 μL上清液直接進(jìn)樣。以雷公藤甲素峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）對血藥濃度（X）作圖，求得回歸方程。結(jié)果見表1。表明雷公藤甲素在1～512 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 透析外液樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線按“3.2.1”項(xiàng)下方法配制7個(gè)不同濃度的雷公藤甲素工作液，分別吸取雷公藤甲素工作液和內(nèi)標(biāo)工作液各10 μL，N2吹干，精密吸取空白PBS緩沖溶液100 μL，按“2.3.2”項(xiàng)下操作流程進(jìn)行，取2 μL上清液進(jìn)LC-MS分析。以雷公藤甲素的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）對透析外液濃度（X）作圖，求得回歸方程，結(jié)果見表1，表明雷公藤甲素在0.2～51.2 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 準(zhǔn)確度和精密度

按“3.2”項(xiàng)下方法配制低、中、高3個(gè)濃度的雷公藤甲素QC樣品（透析內(nèi)液QC樣品濃度為2、64、384ng/mL。透析外液QC樣品濃度為0.4、12.8、38.4 ng/mL），考察準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表2。雷公藤甲素日內(nèi)精密度RSD小于8.34%，符合生物樣品分析要求。

3.4 提取回收率

制備“3.3”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)濃度的模擬血漿（透析外液）樣品；每個(gè)濃度平行5份；另取空白人血漿（空白透析外液）處理用于制備未經(jīng)提取含雷公藤甲素的透析內(nèi)液、外液樣品；精密吸取1 mL乙酸乙酯，置于100 μL空白人血漿（空白PBS溶液）中，振蕩3 min，12000 r/min離心10 min，吸取上清液，室溫N2吹干，精密吸取低、中、高3個(gè)濃度的雷公藤甲素質(zhì)控樣品10 μL、內(nèi)標(biāo)工作液10 μL以及75%甲醇80 μL，振蕩5 min，12 000 r/min離心5 min，取2 μL上清液進(jìn)LC-MS分析，記錄雷公藤甲素的峰面積，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合生物樣品分析方法的要求。

表2 雷公藤甲素基質(zhì)效應(yīng)、回收率、準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果（n=5）

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

取1.5 mL EP管若干，分別加入10 μL低、中、高3個(gè)濃度的雷公藤甲素QC樣品及內(nèi)標(biāo)10 μL，復(fù)溶液75%甲醇80 μL，振蕩3 min，取2 μL進(jìn)行LC-MS分析，記錄峰面積A1。除不加內(nèi)標(biāo)外，另按“2.3”項(xiàng)下操作流程制備空白血漿或空白PBS若干，N2吹干后同上操作，記錄峰面積A2?；|(zhì)效應(yīng)等于A1與A2的比值。結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合生物樣品分析方法的要求。

3.6 穩(wěn)定性

考察低、中、高3個(gè)濃度的含有雷公藤甲素的透析內(nèi)、外液樣品置于室溫環(huán)境下靜置0、4 h，在進(jìn)樣室中放置待測樣品12 h及4℃放置12、24 h，考察其穩(wěn)定性。以線性回歸方程進(jìn)行測定，各個(gè)濃度樣品RSD均小于4.28%，結(jié)果表明雷公藤甲素在室溫4 h、4℃放置24 h及進(jìn)樣室放置樣品12 h均穩(wěn)定。

3.7 平衡時(shí)間考察

用空白PBS代替人血漿置于透析袋內(nèi)，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別于8、12、24、48 h結(jié)束實(shí)驗(yàn)并考察平衡時(shí)間。結(jié)果表明雷公藤甲素在12 h內(nèi)外液濃度達(dá)到平衡。

3.8 血漿蛋白結(jié)合率

血漿蛋白結(jié)合率（%）=（透析內(nèi)液濃度-透析外液濃度）/透析內(nèi)液濃度×100%。按照以上公式計(jì)算雷公藤甲素的血漿蛋白結(jié)合率，結(jié)果見表3。

表3 雷公藤甲素在人血漿中蛋白結(jié)合率（n=3）

4 討論

雷公藤甲素是雷公藤制劑中抗腫瘤、抗炎、免疫抑制的重要活性物質(zhì)，但同時(shí)也是毒性物質(zhì)。雷公藤相關(guān)制劑的確切療效已經(jīng)得到了臨床的充分認(rèn)可，同時(shí)其治療窗十分狹窄的不足之處也相當(dāng)明顯，在臨床治療中常常出現(xiàn)多種不良反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)建立UHPLC/MS/MS聯(lián)合平衡透析法測定雷公藤甲素的人血漿蛋白結(jié)合率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷公藤甲素在人血漿中屬于高結(jié)合型藥物，雷公藤甲素的濃度與其蛋白結(jié)合率沒有相關(guān)性，該結(jié)果為臨床合理使用雷公藤相關(guān)制劑提供數(shù)據(jù)支持。

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Determination of the Protein-binding rate of triPtolide with human Plasma by UHPLC-MS/MS

BAI XiaohuiPAN RonghuaRUI GuohuaZHAO YanmeiYANG Xudong
Department of Nephro1ogy，Liyang Hospita1 of TCM，Jiangsu Province，Liyang213300，China

Objective To study the protein-binding rate of tripto1ide with human p1asma.Methods A UHPLC-MS/MS method was carried to determine the protein-binding rate in vitro.A UHPLC-MS/MS method for the determination of tripto1ide both in inner and outer dia1ysis was estab1ished and then the protein-binding rate with human p1asma was ca1cu1ated.Results Linear re1ationship，precision and accuracy，extraction recovery and stabi1ity of tripto1ide a11 comp1ied with the methodo1ogy requirements.Within the high，midd1e and 1ow concentration（0.8，0.4，0.2 μg/mL）of tripto1ide，the protein-binding rates of tripto1ide were（88.61±1.45）%，（89.28±2.64）%and（88.67±1.59）%，respective1y.Conclusion Tripto1ide has high capacity in binding to human p1asma protein in vitro.

Tripto1ide；Protein-binding rate；Equi1ibrium dia1ysis method；UHPLC-MS/MS

R917

A

1673-7210（2016）07（c）-0046-04

2016-02-05本文編輯：趙魯楓）

江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目（LZ11144）。

潘榮華（1964-），男，主任醫(yī)師，主要從事臨床腎科工作。