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    紅花籽粕降糖有效部位的純化工藝

    2016-11-22 03:32:43薩拉麥提艾迪熱斯武鶴婷阿不拉江圖拉克信學(xué)雷阿吉艾克拜爾艾薩
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2016年21期
    關(guān)鍵詞:籽粕大孔降糖

    薩拉麥提·艾迪熱斯 武鶴婷 阿不拉江·圖拉克 田 華 信學(xué)雷 阿吉艾克拜爾·艾薩

    1.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊830011;

    2.省部共建新疆特有藥用資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,新疆烏魯木齊830011;3.中國科學(xué)院大學(xué),北京100049

    紅花籽粕降糖有效部位的純化工藝

    薩拉麥提·艾迪熱斯1,2,3武鶴婷1,2,3阿不拉江·圖拉克1,2,3田 華1,2,3信學(xué)雷1,2阿吉艾克拜爾·艾薩1,2

    1.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊830011;

    2.省部共建新疆特有藥用資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,新疆烏魯木齊830011;3.中國科學(xué)院大學(xué),北京100049

    目的研究以大孔吸附樹脂純化的方法制備紅花籽粕降糖有效部位的最佳工藝。方法以靜態(tài)吸附法考查11種大孔樹脂對(duì)有效部位的吸附和解吸附性能,以純化后有效部位產(chǎn)率和酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)分,選出純化效果最佳的樹脂進(jìn)行下一步動(dòng)態(tài)篩選研究,并確定最佳純化工藝。結(jié)果經(jīng)過靜態(tài)吸附-解吸附實(shí)驗(yàn)篩選出AB-8型大孔樹脂為最佳純化樹脂;動(dòng)態(tài)篩選結(jié)果得出最佳純化工藝為:上樣藥液質(zhì)量濃度為75 mg/mL;上樣量為6 BV;吸附速率為3 BV/h。洗脫前先用水洗至還原糖陰性反應(yīng),再分別用10%、70%、95%乙醇以3 BV/h的速度洗脫,收集10%乙醇洗脫液6 BV和95%乙醇洗脫液5 BV,合并洗脫液,干燥后即獲得有效部位。結(jié)論經(jīng)AB-8型大孔樹脂純化處理后的紅花籽粕有效部位降糖活性明顯提高。此方法簡(jiǎn)便易行、成本低,可以用于工業(yè)化生產(chǎn)紅花籽粕降糖有效部位。

    紅花籽粕;大孔樹脂;純化;降糖作用

    紅花籽,中藥稱“白平子”,是紅花(Carthamus tinctorius L.)的種子。紅花籽粕(Saff1ower mea1)是紅花籽提取紅花籽油后的副產(chǎn)品[1-2]。目前,紅花在國外主要分布在印度、美國、加拿大、歐洲等30多個(gè)國家[3]。我國紅花主要分布于新疆、河南、四川、河北、浙江等省[4-5],主要用作中藥和油料作物,紅花籽榨油后的籽粕部分無毒、無異味,含18種氨基酸,是一種較優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源,并在很多國家和地區(qū)多作為牲畜的飼料或有機(jī)肥料[6-9]。紅花籽粕中也含有許多天然抗氧化物質(zhì),目前對(duì)紅花籽粕的研究大部分是針對(duì)其中的5-羥色胺及其衍生物,包括富集、分離、純化、抗氧化性和清除自由基、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的免疫反應(yīng)、抑制腫瘤和消炎抑菌、保護(hù)機(jī)體中的NK細(xì)胞免受程序性死亡及強(qiáng)烈抑制黑色素生成等生物活性的研究[10-14]。前期工作中已獲得了紅花籽粕的提取物,發(fā)現(xiàn)了它具有蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP-1B)抑制能力[15]。本研究通過對(duì)比11種不同類型的大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸附能力、產(chǎn)率,對(duì)PTP-1B和α-葡萄糖苷酶的抑制活性,篩選出最佳的樹脂,并以提取物對(duì)PTP-1B和α-葡萄糖苷酶的抑制活性以及產(chǎn)率為指導(dǎo),對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳純化工藝,為工業(yè)化生產(chǎn)提供了方法。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    旋蒸發(fā)儀(Buchi R-210型,瑞士產(chǎn));電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司,DHG-9070A型);全溫震蕩培養(yǎng)箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠,HZQF160型);M-5酶標(biāo)儀(美國分子儀器公司);

    1.2 大孔樹脂類型

    HPD100、HPD300、HPD450、HPD500、HPD600、HPD 750、AB-8、X-5、D101、NKA-9、ADS-17型大孔樹脂(滄州寶恩化工有限公司)。

    1.3 試藥

    實(shí)驗(yàn)材料購自新疆塔城,由中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所標(biāo)本館馮纓研究員鑒定為紅花種子。

    對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(pNPP)、礬酸鈉,α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)和二甲基亞砜(DMSO)均為由美國Sigma公司提供,石油醚和乙醇(食用乙醇)由天津市百世化工有限公司提供,水為純化水。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 紅花籽粕提取液的制備

    稱取榨油后,粉碎的紅花籽粕4.2 kg,按1∶8的固液比,進(jìn)行石油醚滲漉、脫脂,脫脂后的藥材粉末晾干后,在80℃的條件下用70%乙醇加熱回流提取3次,每次1 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮至無醇味,且濃縮藥液相對(duì)密度為1.06 g/mL,放入4℃冰箱保存。

    2.2 大孔樹脂的篩選

    2.2.1 樹脂處理根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]的方法,將11種大孔樹脂用95%乙醇浸泡2~4 h,排出乙醇后,反復(fù)用蒸餾水沖洗至樹脂在試管中加入3倍量水不顯渾濁為止,然后用超凈水充分淋洗至無乙醇?xì)馕?,抽濾。分別稱取11種已處理好的大孔樹脂2 g放入錐形瓶中,加入稀釋的紅花籽粕提取液(樣品濃度P0為29.2286 mg/mL)30 mL。搖床振搖(180 r/min,25℃)2 h。過濾,濾出液烘干至恒重,計(jì)算流出液濃度Pe。過濾后的大孔樹脂水洗抽干,加95%乙醇30 mL,置搖床(180 r/min,25℃)振搖2 h,靜置2 h進(jìn)行靜態(tài)解吸附。解吸附液過濾烘干至恒重,計(jì)算解析液濃度Pd。

    V0為上樣體積,M為樹脂重量。分別按下式計(jì)算吸附量、吸附率、解吸率:

    吸附量(mg/g,濕樹脂)=(P0-Pe)×V0/M,

    吸附率(%)=(P0-Pe)×100/P0,

    解吸率(%)=Pd×100/(P0-Pe)。

    2.2.2 PTP-1B抑制活力檢測(cè)對(duì)解吸附后的樣品進(jìn)行活性測(cè)定。按照文獻(xiàn)[18]的方法以對(duì)-硝基苯基磷酸二鈉(pNPP)作為底物,根據(jù)PTP-1B水解pNPP的磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測(cè)定PTP-1B的活性。PBS緩沖液178 μL,在96孔板中加入PTP-1B蛋白溶液1 μL(0.115 mg/mL),不同濃度的樣品或陽性對(duì)照樣品1 μL或DMSO 1 μL,混勻,10 min后加入35 mmo1/L的pNPP 20 μL,25℃避光孵育20 min后,每孔加10 μL 3 mo1/L NaOH終止反應(yīng)。以不含酶溶液的系統(tǒng)為空白,利用SpectraMax MD5酶標(biāo)儀(美國Mo1ecu1ar Devices)測(cè)定405 nm處的OD值。

    抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白×100%。

    2.2.3 α-葡萄糖苷酶的抑制活力檢測(cè)將文獻(xiàn)[19]的方法進(jìn)行改進(jìn)測(cè)定解吸附的樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。α-葡萄糖苷酶篩選方法:0.1 mo1/L磷酸緩沖液(0.1 mo1/L K2HPO4,0.1 mo1/L KH2PO4,H2O)68.5 μL,在96孔板中加入α-葡萄糖苷酶溶液1.5 μL,測(cè)試樣品或陽性對(duì)照樣品5 μL(將樣品配成濃度梯度)或DMSO 5 μL,混勻后室溫反應(yīng)10 min,再加入20 mmo1/L底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)25 μL,37℃恒溫反應(yīng)20 min后終止反應(yīng)。以不含酶溶液的系統(tǒng)為空白,利用SpectraMax MD5酶標(biāo)儀(美國Mo1ecu1ar Devices)測(cè)定405 nm處的吸收值。

    抑制率=(OD405空白-OD405樣品)/OD405空白× 100%。

    2.2.4 檢測(cè)結(jié)果通過分析11種大孔樹脂對(duì)紅花籽粕樣品吸附、解吸能力及樣品對(duì)PTP1B酶和α-葡萄糖苷酶抑制能力,由表1可以看出,HPD500、HPD600、HPD750、AB-8、X-5、NKA-9-17、D101型號(hào)樹脂對(duì)紅花籽粕提取液有較強(qiáng)的吸附效果,AB-8、X-5和D101解吸效果比較好。由于純化的目的是選出吸附和解吸效果優(yōu)異,并且活性較高的有效部位,因此加入了活性因素綜合評(píng)分后(吸附率25%、解吸率25%、PTP1B抑制率25%、α-葡萄糖苷酶抑制率25%),AB-8得分最高,因此選擇AB-8為純化紅花籽粕有效部位的最優(yōu)大孔吸附樹脂。見表1。

    表1 11種大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸附情況

    2.3 上樣藥液純化條件的研究

    根據(jù)大孔樹脂篩選結(jié)果,分別對(duì)提取藥液上樣濃度、吸附速率、上樣量、洗脫劑濃度和洗脫劑用量進(jìn)行考察。

    2.3.1 上樣藥液濃度的考察取紅花籽粕提取液(濃縮藥液相對(duì)密度為1.06 g/mL),將其稀釋成100 mg/mL(濃縮藥液相對(duì)密度為1.04 g/mL)、75 mg/mL(濃縮藥液相對(duì)密度為1.02 g/mL)、50 mg/mL(濃縮藥液相對(duì)密度為1.01 g/mL)、25 mg/mL(濃縮藥液相對(duì)密度為1.00 g/mL)的溶液,分別吸取15 mL吸附到AB-8大孔樹脂柱上,以2 BV/h的速度進(jìn)行放流,收集流出液,計(jì)算其吸附量。再以5 BV/h的流速使用蒸餾水洗至還原糖陰性反應(yīng),再用95%乙醇洗脫5 BV,收集流出液,結(jié)合其吸附率和解析率進(jìn)行綜合評(píng)分的計(jì)算(綜合評(píng)分=吸附率×50%+純化組分百分比×50%)。藥物濃度越高其吸附量越高,上樣液濃度為100 mg/mL時(shí)有較強(qiáng)的吸附效果,但上樣液濃度為75 mg/mL時(shí),其解吸效果為最好。因此,通過對(duì)4種上樣液濃度進(jìn)行綜合評(píng)分后,選擇75 mg/mL上樣濃度為最佳上樣濃度(密度相當(dāng)于1.02 g/mL)。見表2。

    表2 上樣液濃度對(duì)吸附率和解析率的影響

    2.3.2 吸附速率的確定取紅花籽粕提取液(最佳上樣液濃度為75 mg/mL,相對(duì)密度為1.02 g/mL)30 mL,吸附在15 mL AB-8大孔樹脂柱上,分別以1、2、3、4、5、6 BV/h的流速進(jìn)行吸附,收集流出液,計(jì)算吸附量。再以5 BV/h的流速使用蒸餾水洗至還原糖陰性反應(yīng),再用95%乙醇洗脫5 BV,收集流出液,結(jié)合其吸附量和解析液干重進(jìn)行綜合評(píng)分的計(jì)算(綜合評(píng)分=吸附量×50%+解吸量×50%)。當(dāng)藥液吸附速度增加時(shí),流出液吸附量和解吸液先增后減,當(dāng)吸附速度達(dá)到3 BV/h時(shí),藥液吸附量和解吸液干重達(dá)到最大,對(duì)6種吸附速度進(jìn)行的綜合評(píng)分結(jié)果表明3 BV/h吸附速率為最佳藥液吸附速率。見表3。

    表3 吸附速率對(duì)吸附率的影響

    2.3.3 提取藥液上樣體積的確定分別取1~8 BV的紅花籽粕提取物(濃縮藥液相對(duì)密度為1.02 g/mL),上15 mL樹脂柱,以3 BV/h速度進(jìn)行吸附后收集流出液,計(jì)算吸附量。再以5 BV/h的流速使用蒸餾水洗至還原糖反應(yīng)呈陰性結(jié)果,再用95%乙醇洗脫5 BV,收集流出液,計(jì)算其吸附量、樣品上樣量與樹脂飽和度之間的關(guān)系。上樣量到6 BV時(shí),樣品穿透速度趨于平緩,并流出液與上樣濃度幾乎相等,樹脂處于飽和狀態(tài)。因此得出結(jié)論,6 BV為最佳上樣體積。見圖1。

    2.3.4 洗脫劑濃度的確定取紅花籽粕提取液(濃縮藥液相對(duì)密度為1.02 g/mL)90 mL,加入15 mL樹脂柱上,以3 BV/h速度進(jìn)行吸附,在以5 BV/h的流速用水洗至還原糖反應(yīng)呈陰性結(jié)果,再分別以10%、30%、50%、70%、95%等不同濃度的乙醇溶液洗脫,洗脫液用量為50 mL,收集洗脫液測(cè)定PTP1B和α-葡萄糖苷酶半數(shù)抑制濃度IC50,計(jì)算純化組分產(chǎn)量與活性抑制率并進(jìn)行綜合評(píng)分(綜合評(píng)分=純化組分產(chǎn)量×30%+ PTP1B抑制活性×35%+α-葡萄糖苷酶抑制活性× 35%),選擇最佳洗脫濃度。吸附在樹脂上的樣品在使用不同的洗脫劑洗脫下來的成分不同,其活性也有明顯的差異。隨乙醇濃度的升高,洗脫下組分的重量減少,而且只有10%和95%乙醇洗脫部分有較好的PTP1B和α-葡萄糖苷酶抑制活性。通過對(duì)純化組分產(chǎn),量與活性進(jìn)行綜合評(píng)分,選用10%和95%乙醇作為最佳乙醇洗脫濃度。見表4。

    圖1 樣品穿透曲線

    表4 不同濃度乙醇洗脫組分PTP1B和α-葡萄糖苷酶抑制IC50

    2.3.5 洗脫劑用量的考察將吸附飽和的樹脂先用水洗至還原糖反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果呈陰性,再以10%、70%、95%乙醇溶液,以3 BV/h的速率分別洗脫6、4、5 BV,收集流出液測(cè)定PTP1B半數(shù)抑制濃度IC50,再次確定具有降糖活性的紅花籽粕有效部位。首先10%乙醇6 BV體積洗脫,并收集液都具有PTP1B抑制活性,所得到的純化組分為224.8 mg。中間部分用70%乙醇4 BV體積洗脫并未檢測(cè)到PTP1B活性。最后部分全部以95%乙醇5 BV體積洗脫,得到的純化組分為250.6 mg,95%洗脫劑在5 BV體積下大孔樹脂上吸附的樣品基本被洗脫干凈并檢測(cè)到PTP1B活性。因此對(duì)工業(yè)生產(chǎn)來說,為了高效又節(jié)約成本,選擇洗脫劑的用量為10%乙醇6 BV,95%乙醇5 BV。見表5。

    2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

    稱取紅花籽粕3份,每份為500 g,在80℃的條件下使用70%酒精加熱回流提取3次,每次1 h,過濾,合并濾液,減壓濃縮至無醇味。分別取紅花籽粕提取物(濃縮藥液相對(duì)密度為1.02 g/mL),上AB-8樹脂柱,以3 BV/h速度進(jìn)行吸附后,再以5 BV/h的流速使用蒸餾水洗至還原糖反應(yīng)呈陰性,再分別用10%、70%、95%乙醇洗脫,洗脫體積液用量為5 BV,收集10%和95%部位的流出液,減壓濃縮至無醇味后烘干,計(jì)算其粗提物得率(%)和PTP-1B抑制率。

    粗提物得率(%)=粗提物量/原料量×100%。

    驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與提取工藝結(jié)果相近,可以判斷出本提取工藝實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果較為穩(wěn)定,可以用于工業(yè)大量生產(chǎn)紅花籽粕降糖有效部位。見表6。

    表5 洗脫劑用量的影響

    表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

    3 討論

    大孔吸附樹脂是高吸附性和高選擇性兼具的多孔高分子材料,其吸附能力是范德華力和氫鍵共同作用的結(jié)果,有吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、易于構(gòu)成閉路循環(huán)和成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)中,通過靜態(tài)吸附-解吸附法篩選了11種不同類型的樹脂的吸附-解吸附能力,并結(jié)合活性篩選結(jié)果確定弱極性的AB-8型樹脂為最佳吸附劑。通過動(dòng)態(tài)吸附法研究AB-8的純化條件時(shí),10%、95%乙醇洗脫組分的活性較好。總體來說,紅花籽粕中降糖有效組分可能主要為中小極性成分和大極性成分。本實(shí)驗(yàn)利用糖尿病相關(guān)因子蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)和α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選結(jié)果作為工藝篩選指標(biāo),其方法可靠,對(duì)藥品純化工藝研究有一定的參考意義。

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    Purification of antidiabtic comPositions from safflower meal by macroP-orous resin

    EDIRS Salamet1,2,3WU Heting1,2,3TURAK Ablajan1,2,3TIAN Hua1,2,3XIN Xuelei1,2AISA Haji Akber1,2
    1.The Key Laboratory of P1ant Resources and Chemistry of Arid Zone Xinjiang Technica1 Institute of Physics and Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi830011,China;2.State Key Laboratory Basis of Xinjiang Indigenous Medicina1 P1ants Resource Uti1ization,Xinjiang Technica1 Institute of Physics and Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi830011,China;3.University of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China

    Objective To exp1ore the best way on purification hypog1ycemic effective parts from saff1ower seed mea1 by using macroporous adsorption resin.Methods 11 kinds of macroporous resin were screened by comparing the abi1ity of adsorption and desorption performance for effective parts,the production and the inhibition on protein-tyrosine phosphatase-1B and a1pha g1ycosidase,which are two key enzymes in diabetic drug screening,were combined to choose the most suitab1e macroporous resin for purifying the antidiabetic fraction;then the best one was subjected to dynamic absorption screening to optimize the best purification process.Results AB-8 macroporous resin was the best purification resin,and the optimization process was:concentration of samp1e was 75 mg/mL,samp1e vo1ume on adsorption was 6 BV,f1ow rate on adsorption was 3 BV/h,e1ution by water to reduce the sugar negative reaction,f1ow rate of adsorption and e1ution was 3 BV/h for 4 BV,then e1ution so1vent was 10%,70%,95%ethano1,and 6 BV 10%and 5 BV 95%ethano1 part were co11ected.Conclusion Compared with the extraction before purification,purified parts significant1y inhibit PTP-1B and a1pha g1ycosidase.This method is simp1e and 1ow cost,it can be used for producing antidaibetic parts from saff1ower seed mea1 in industry.

    Saff1ower mea1;Macroporous resin;Purification;Anti-diabetic

    R93

    A

    1673-7210(2016)07(c)-0016-05

    2016-04-08本文編輯:趙魯楓)

    國家自然科學(xué)基金新疆聯(lián)合基金項(xiàng)目國家聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1203203);國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011 BAI05 B05)。

    薩拉麥提·艾迪熱斯(1988-),女,中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所2014級(jí)有機(jī)化學(xué)專業(yè)在讀博士研究生;研究方向:有機(jī)化學(xué)。

    阿吉艾克拜爾·艾薩(1965-),男,碩士,主要從事民族藥學(xué)研究。信學(xué)雷(1971-),女,碩士,主要從事民族藥生物活性篩選與作用機(jī)制研究。

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