腺病毒及脂質(zhì)體法介導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究

李　彪　蘭　靜　肖　鳴（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院口腔科內(nèi)江641000）

腺病毒及脂質(zhì)體法介導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)研究

李彪蘭靜肖鳴（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院口腔科內(nèi)江641000）

目的：利用腺病毒載體和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞探討轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的理想條件。方法：分別使用腺病毒載體和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體介導(dǎo)VEGF165基因轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后通過倒置熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，對比探討轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的理想方法。結(jié)果：采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞效果不理想，轉(zhuǎn)染率約11.60％。采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染率明顯高于脂質(zhì)體法，且隨感染復(fù)數(shù)增加而增加。結(jié)論：采用腺病毒介導(dǎo)VEGF165轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞較脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染效率高，當(dāng)M0I= 50時可作為轉(zhuǎn)染安全有效的條件．這為細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

臍靜脈內(nèi)皮 細(xì)胞細(xì)胞轉(zhuǎn)染 腺病毒載體 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

種子細(xì)胞的培養(yǎng)是組織工程的基本要素，VEGF是目前已知誘導(dǎo)血管再生作用最強(qiáng)的生長因子，但人工添加VEGF的活性時間短。Hudson N等[1]研究認(rèn)為如果在正常氧分壓下VEGF165的生物半衰期30～45min，在低氧環(huán)境下是6～8h。參與血管形成的主要細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞，通過內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖、分化和結(jié)構(gòu)重建形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)[2]。許多研究證實(shí)，通過將特定的目的基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)可以使目的基因長期穩(wěn)定持續(xù)性表達(dá)。如能將VEGF基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至內(nèi)皮細(xì)胞，使其能保持局部VEGF高濃度活性促進(jìn)血管再生。轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵之一是將VEGF基因安全有效轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞中并持續(xù)表達(dá)，因此需要尋求轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的合適方法。本實(shí)驗(yàn)選擇臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，用不同腺病毒滴度及不同脂質(zhì)體濃度轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，探討適合臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染的有效條件。

1　材料與方法

1.1材料：腺病毒過表達(dá)載體pHBAd-MCMV-GFP-VEGF165以及質(zhì)粒pIRES-GFP-VEGF165構(gòu)建（漢恒生物有限公司），HUVECs（Sciencell公司），DMEM培養(yǎng)基（北京賽默飛世爾生物化學(xué)有限公司），胎牛血清（FBS）（北京賽默飛世爾生物化學(xué)有限公司），二甲基亞砜（美國Sigma公司），0.25％胰蛋白酶（美國Sigma公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）。

1.2臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的復(fù)蘇培養(yǎng)：快速將凍存管從液氮罐里拿出，放入37℃水浴鍋升溫，2min內(nèi)將凍存管中液體解凍。復(fù)溫后吸出細(xì)胞至15mL離心管，1∶1緩慢加入培養(yǎng)液，離心去除培養(yǎng)液后用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.3脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至約80％～90％融合時，消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，按1×105個細(xì)胞每孔接種到24孔板，加入培養(yǎng)基500μL混勻放進(jìn)37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。細(xì)胞貼壁后小心棄掉舊培養(yǎng)基，各孔中加入400μL培養(yǎng)基，按每孔4μg質(zhì)粒和10μL Lipofectamine 2000脂質(zhì)體，輕輕搖晃孔板混合后在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h觀察轉(zhuǎn)染情況。

轉(zhuǎn)染效率（％）=熒光視野下細(xì)胞數(shù)/普通視野下細(xì)胞數(shù)×100％

1.4腺病毒感染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至約80％～90％融合時，消化成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，按1×105個細(xì)胞每孔接種到24孔板，加入培養(yǎng)基500μL混勻放進(jìn)37℃5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。各孔以10、25、50、100的感染復(fù)數(shù)加入攜帶VEGF165的腺病毒載體，培養(yǎng)72h后觀察轉(zhuǎn)染情況。

轉(zhuǎn)染效率（％）=熒光視野下細(xì)胞數(shù)/普通視野下細(xì)胞數(shù)×100％

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率低，100倍顯微鏡下拍照后采用Image-pro Plus軟件分析測得熒光蛋白表達(dá)量。結(jié)果示轉(zhuǎn)染率為11.60％。見圖1。

2.2腺病毒轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞：采用腺病毒轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)MOI=10，25，50時見有少量懸浮死細(xì)胞，HUVECs細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，在M0I=100有較多懸浮死細(xì)胞，HUVECs細(xì)胞收縮，變圓，胞核不清，核仁消失。鏡下拍照后Image-pro Plus軟件分析測得熒光蛋白表達(dá)量，結(jié)果提示，感染復(fù)數(shù)為10、25、50、100時轉(zhuǎn)染率分別為10.80％、45.37％、90.85％和94.7％，轉(zhuǎn)染率明顯高于脂質(zhì)體法，但當(dāng)感染復(fù)數(shù)為100時鏡下見培養(yǎng)基中有較多漂浮的死細(xì)胞。所以M01=50為最佳感染復(fù)數(shù)。見圖1。

3　討論

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將有生物功能的外源性基因片段導(dǎo)入細(xì)胞并使其表達(dá)的技術(shù)。隨著細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)等研究的不斷發(fā)展，其應(yīng)用越來越廣泛。選擇理想載體是基因轉(zhuǎn)染的重要環(huán)節(jié)，合適的載體會有更高的轉(zhuǎn)染效率，因此基因轉(zhuǎn)染需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，選擇更好的載體及轉(zhuǎn)染方法。本實(shí)驗(yàn)通過腺病毒及脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，探討臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染的理想條件。

目前，用做基因轉(zhuǎn)染的載體主要有病毒載體和非病毒載體兩大類。常用的病毒類載體有4種：逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒以及腺病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒只能用于轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高、基因表達(dá)穩(wěn)定；慢病毒可轉(zhuǎn)染非分裂期和分裂期細(xì)胞，可攜帶基因片段較長，目的基因表達(dá)效率較高，但慢病毒載體的生物安全性低；腺相關(guān)病毒是目前可攜帶外源基因容量最大的，轉(zhuǎn)染效率高，但細(xì)胞毒性大；腺病毒載體以其低毒性，相比之下安全性能高，可轉(zhuǎn)染非分裂期及分裂期細(xì)胞，宿主范圍廣，不整合入宿主細(xì)胞染色體，可攜帶的外源性基因量較大等優(yōu)越性能成為應(yīng)用最廣泛的病毒載體[3]。非病毒載體轉(zhuǎn)染法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、陽離子聚合物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染及電擊基因轉(zhuǎn)導(dǎo)等[4～5]，在非病毒載體中脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法最為常用。本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體介導(dǎo)和腺病毒載體這兩種方法轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率較腺病毒載體低，在使用腺病毒作為轉(zhuǎn)染載體時轉(zhuǎn)染率隨MOI的增加而升高，當(dāng)MOI=50時，轉(zhuǎn)染率為90.85％。腺病毒是一種線性雙鏈病毒，無包膜，直徑60～90nm，廣泛分布于自然界。腺病毒可分為禽腺病毒屬和哺乳動物腺病毒屬，其中人腺病毒是哺乳動物腺病毒屬的代表，人腺病毒可分為A-F六種亞型及50多個血清型，其中血清型C組2和5型目前應(yīng)用較多，常用的腺病毒刪除了其中基因組E1區(qū)因此可避免腫瘤的發(fā)生安全性較高[6]。腺病毒可分為三代：第一代腺病毒載體刪除了基因序列中E1和E3表達(dá)盒，由于僅E1區(qū)缺失它在能夠?yàn)槠涮峁〦1缺失蛋白的宿主細(xì)胞時可能會引起細(xì)胞病變；第二代腺病毒載體在第一代基礎(chǔ)上刪除了E2a和E4表達(dá)盒修正了不足并降低了免疫性，不過目標(biāo)基因持續(xù)表達(dá)時間仍較短；第三代腺病毒載體只保留包裝信號和復(fù)制信號去除了大部分腺病毒基因，可攜帶的外源基因較大，持續(xù)表達(dá)目的基因的時間也大大提高，轉(zhuǎn)染后無病毒自身蛋白表達(dá)并且避免了免疫反應(yīng)，擁有很好的應(yīng)用前景[7]。腺病毒載體具有許多優(yōu)點(diǎn)，但MOI過高會造成細(xì)胞毒性，本實(shí)驗(yàn)中腺病毒載體轉(zhuǎn)染時轉(zhuǎn)染率隨MOI增加而增加，感染復(fù)數(shù)為10、25、50、100時轉(zhuǎn)染率分別為10.80％、45.37％、90.85％和94.7％，同時在MOI=10、25、50時可見有少量懸浮死細(xì)胞，HUVECs細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，而在M0I=100有較多懸浮死細(xì)胞，HUVECs細(xì)胞收縮，變圓，胞核不清，核仁消失，這可能是由于腺病毒載體濃度過高引起宿主細(xì)胞中毒。由此可見，當(dāng)MOI=50時腺病毒載體對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率高，同時無明顯毒性作用，這為臍靜脈內(nèi)皮組織工程的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]Hudson N,Powner MB,Sarker MH.Differential apicobasal VEGF signaling at vascular blood-neural barriers.DevCell.2014 Sep 8；30（5）∶541-52.

[2]Ahsan A,Han G,Pan J,Tang Z.Phosphocreatine protects endothelial cells from oxidized lowdensity lipoprotein induced apoptosis by modulating the PI3K/Akt/eNOS pathway.Apoptosis[J]. 2015 Dec；20（12）∶1563-76.

[3]胡奇嬋，陳玥，王麗，等.腺病毒載體用于基因治療的研究進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2011，5∶76-80.

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Experimental reserch of human umbilical vein endothelial cells transfected by adenovirus and liposome

Li biao Lan jing Xiao ming（The first people's hospital of neijiang，department of stomatology，Sichuan Neijiang，641000）

Objective∶To discuss the ideal conditions for transfection of human umbilical vein endothelial cells by adenovirus and Liposomes.Method∶Transfection VEGF165 gene into human umbilical vein endothelial cells by using adenovirus vector and Lipofectamine 2000.After transfection，the transfection efficiency was detected by inverted fluorescence microscope to explore the ideal way of transfection umbilical vein endothelial cells.Result∶By liposome transfection of human umbilical vein endothelial cells is not satisfactory as the expression was measured rate of about 11.6％.The transfection efficiency of adenovirus vector was significantly higher than that of liposome，and increased with the increase of the number of infection.Conclusion∶The transfection efficiency of human umbilical vein endothelial cells transfected with adenovirus vector was higher than that of liposome method，and when M0I=50 can be used as a safe and effective transfection，which provides experimental basis for the research of human umbilical vein endothelial cells.

Human umbilical vein endothelial cells Cell transfection Adenovirus vector Lipofection

R 543

B

1672-8351（2016）11-0130-02