葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、血管內(nèi)皮生長因子及增殖細(xì)胞

張欣 吳立平 康保潔

[摘要] 目的 探討葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Glut1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)和相關(guān)性。 方法 研究標(biāo)本取自濰坊市人民醫(yī)院胸外科2013年8月～2015年6月期間住院行肺部手術(shù)的患者113例，其中93例NSCLC組織作為實(shí)驗(yàn)組，20例肺部良性病變組織作為對(duì)照組，采用免疫組化法檢測(cè)Glut1、VEGF及PCNA在NSCLC組織和肺部良性病變組織中的表達(dá)，并分析其與NSCLC臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系及三者間的相關(guān)性。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組中Glut1、VEGF陽性率及PCNA標(biāo)記指數(shù)（PCNA-LI）分別為89.25%（83/93）、80.65%（75/93）和（67.65±26.11）%，均高于對(duì)照組[15.00%（3/20）、25.00%（5/20）和（25.25±9.34）%]，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。Glut1表達(dá)與病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05）。VEGF表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05）。PCNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05）。Glut1與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.312，P < 0.01）。Glut1、VEGF的表達(dá)與PCNA均呈正相關(guān)（r = 0.306，P < 0.01；r = 0.415，P < 0.01）。 結(jié)論 Glut1、VEGF及PCNA與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)三者有助于判斷NSCLC的預(yù)后。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；血管內(nèi)皮生長因子；增殖細(xì)胞核抗原

[中圖分類號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（a）-0073-04

Expression and its correlation of Glut1， VEGF and PCNA in non-small cell lung cancer

ZHANG Xin1 WU Liping2 KANG Baojie1

1.Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang 261053， China； 2.Department of Respiratory Medicine， Weifang People's Hospital， Shandong Province， Weifang 261041， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and its correlation of glucose transporter 1 （Glut1）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods The samples in this study were obtained from 113 cases of patients taking chest surgery hospitalized in Weifang People's Hospital from August 2013 to June 2015， among whom， 93 cases of NSCLC tissues were taken as experimental group and 20 cases of benign lesion lung tissues were taken as control group. Expression of Glut1， VEGF and PCNA in NSCLC tissues and benign lesion lung tissues was detected by immunohistochemistry， and the relationship of their expression with the clinical pathological parameters of NSCLC and their correlation were analyzed. Results The positive rate of Glut1， VEGF and PCNA labeling index （PCNA-LI） in the experimental group was 89.25% （83/93）， 80.65% （75/93） and （67.65±26.11）% respectively， which were higher than those of control group [15.00% （3/20）， 25.00% （5/20） and （25.25±9.34）%]， the differences were all highly statistically significant （P < 0.01）. The expression of Glut1 was correlated with pathological types， TNM stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. The expression of VEGF was correlated with TNM stage and lymph node metastasis （P < 0.05）. The expression of PCNA was correlated with lymph node metastasis （P < 0.05）. There was a positive correlation between Glut1 and VEGF expression （r = 0.312， P < 0.01）， and the expressions of Glut1， VEGF with PCNA both showed positive correlation （r = 0.306， P < 0.01； r = 0.415， P < 0.01）. Conclusion The positive expressions of Glut1， VEGF and PCNA in NSCLC may play an important role in the occurrence and development of NSCLC. Combined detection of the three indicators will help to estimate the prognosis of NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer； Glucose transporter1； Vascular endothelial growth factor； Proliferating cell nuclear antigen

肺癌發(fā)病率及死亡率均居全球惡性腫瘤首位，盡管診斷、手術(shù)、放化療等已取得一定成效，但肺癌尤其是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療效果及預(yù)后較差，而惡性腫瘤治療失敗的重要原因?yàn)榍忠u和轉(zhuǎn)移。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Glut1）為葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，對(duì)細(xì)胞能量代謝起著關(guān)鍵性作用。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）為惡性腫瘤血管生成中重要的調(diào)節(jié)因子。它在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用，是近年的研究熱點(diǎn)[1]。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是DNA多聚酶σ的輔助蛋白，其合成與DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖直接相關(guān)[2]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)NSCLC組織中Glut1、VEGF和PCNA蛋白的表達(dá)水平，探討三者在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取濰坊醫(yī)學(xué)院附屬濰坊市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）胸外科2013年8月～2015年6月行肺段葉切除手術(shù)的原發(fā)性NSCLC患者93例的組織標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，所有患者在接受手術(shù)之前均未行放療、化療等相關(guān)治療。實(shí)驗(yàn)組中男54例，女39例；年齡35～76歲，平均（58.84±8.02）歲；組織類型：肺鱗癌32例，肺腺癌61例；按1997年UICC修訂的標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行TNM分期：Ⅰ期49例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅳ期7例；組織學(xué)分化程度：高分化29例，中分化42例，低分化22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者47例；有吸煙史42例，無吸煙史51例。對(duì)照組選取我院同期肺良性病變組織20例，其中包括11例炎性病變，5例肺大皰，4例肺結(jié)核。實(shí)驗(yàn)中采用的NSCLC及良性病變組織標(biāo)本均經(jīng)病理切片證實(shí)。本研究所入選的患者均已知情同意并簽署知情同意書，醫(yī)院倫理委員會(huì)均通過。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人Glut1多克隆抗體、鼠抗人PCNA單克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體購自北京中杉金橋生物有限公司。所有標(biāo)本均由中性甲醛固定，采用免疫組化SP法、石蠟包埋組織經(jīng)切片，微波行抗原修復(fù)，其余均按照試劑盒說明嚴(yán)格執(zhí)行，采用PBS液代替一抗來作為陰性對(duì)照，用已知陽性的癌組織作陽性對(duì)照。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

參考Cooper等[4]報(bào)道的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，將胞質(zhì)和/或胞膜染為棕黃色的細(xì)胞定義為Glut1陽性細(xì)胞，在高倍鏡（×400）下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞百分率，無癌細(xì)胞染色為陰性（-），<10%癌細(xì)胞染色為弱陽性（+），10%～50%癌細(xì)胞染色為中度陽性（++），>50%癌細(xì)胞染色為強(qiáng)陽性（+++）。VEGF參考Ye等[5]報(bào)道的判斷標(biāo)準(zhǔn)，胞質(zhì)染為棕黃色即為VEGF陽性細(xì)胞，在400倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野各計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，標(biāo)本中無癌細(xì)胞染色即為（-），1%～<25%癌細(xì)胞染色即為（+），25%～50%癌細(xì)胞染色即為（++），>50%癌細(xì)胞染色即為（+++）。將細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為PCNA陽性細(xì)胞，每張切片觀察5個(gè)高倍（400×）視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算PCNA陽性細(xì)胞百分率，將其定義為PCNA標(biāo)記指數(shù)（PCNA-LI）；其中陽性細(xì)胞所占百分比<50%定義為低表達(dá)，≥50%定義為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，其中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Pearson等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Glut1、VEGF和PCNA在NSCLC組織中的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組中Glut1、VEGF陽性率及PCNA-LI分別為89.25%（83/93）、80.65%（75/93）和（67.65±26.11）%，均高于對(duì)照組[15.00%（3/20）、25.00%（5/20）和（25.25±9.34）%]，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）（圖1～3）。

2.2 Glut1、VEGF和PCNA與臨床病理因素間的關(guān)系

Glut1在NSCLC組織中的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型有關(guān)（P < 0.05），而與患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、吸煙無關(guān)（P > 0.05）。VEGF表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P < 0.05），而在不同年齡、性別、組織分化程度、腫瘤病理類型及是否有吸煙史方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PCNA的陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P < 0.05），而與其他因素?zé)o關(guān)。見表1。

2.3 Glut 1、VEGF、PCNA表達(dá)的相關(guān)性

NSCLC組織中，通過Pearson等級(jí)相關(guān)分析，Glut1與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)（r = 0.312，P < 0.01）。見表2。Glut1、VEGF的表達(dá)與PCNA 均呈正相關(guān)（r = 0.306，P < 0.01；r = 0.415，P < 0.01）。見表3。

3 討論

惡性腫瘤細(xì)胞主要特點(diǎn)是增殖迅速，其耗氧量不斷增加導(dǎo)致供能和耗能之間不平衡，因此細(xì)胞對(duì)氧和營養(yǎng)的過度消耗導(dǎo)致腫瘤低氧、低糖的微環(huán)境，為適應(yīng)此微環(huán)境，通過增加葡萄糖攝取來獲取能量，Glut1是葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)最重要的載體，它同惡性腫瘤的進(jìn)展有直接的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中Glut1的陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中Glut1的陽性表達(dá)明顯高于無轉(zhuǎn)移者，中晚期的表達(dá)高于早期者，這與Noguchi等[6]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。另外一些研究也發(fā)現(xiàn)，Glut1同惡性腫瘤的TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，因此可用于判斷惡性腫瘤的預(yù)后[7]。在NSCLC組織中，鱗癌Glut1的陽性表達(dá)明顯高于腺癌，且鱗癌在腫瘤的癌巢中央染色較深。這與Meijer等[8]研究的結(jié)果相符，其研究表明，鱗癌相較于腺癌能更多地表達(dá)Glut1，這可能同鱗癌多以巢狀生長有關(guān)，其中央的血供較差，為滿足其快速增殖的能量供應(yīng)，繼發(fā)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)增多，其與病理類型的相關(guān)性機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。Glut1對(duì)肺癌攝取葡萄糖起著重要作用，而正常組織及腫瘤組織對(duì)葡萄糖的攝取存在差異，由此推斷高表達(dá)Glut1可能是腫瘤早期診斷和惡化進(jìn)展的重要指標(biāo)，并提示腫瘤具有侵襲性和不良的預(yù)后。

實(shí)體腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的前提是血管生長，它在實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[9]。肺癌相較于其他惡性腫瘤更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其可能的原因是肺組織毛細(xì)血管比其他的組織更為豐富[10]。VEGF是最主要的血管生長促進(jìn)因子之一，可促使新生血管的生長和延伸，從而促進(jìn)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，VEGF在實(shí)驗(yàn)組中的陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，另外還發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF陽性表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，中晚期的VEGF陽性表達(dá)率高于早期者（P < 0.05）。因此可推測(cè)VEGF在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用，并且同肺癌的惡性程度有關(guān)，提示該因子有可能作為評(píng)估肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

PCNA是細(xì)胞增殖合成DNA所必需的核蛋白，與DNA的復(fù)制以及細(xì)胞增殖密切相關(guān)[11]，檢測(cè)它在細(xì)胞中的表達(dá)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組PCNA的表達(dá)高于對(duì)照組，且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移者（P < 0.05），提示高表達(dá)PCNA與肺癌發(fā)生及生物學(xué)行為有關(guān)，同時(shí)可作為判斷肺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因調(diào)控和多步驟發(fā)展的過程。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織中，Glut1、VEGF和PCNA均為高表達(dá)，且Glut1與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，可能是因?yàn)閻盒阅[瘤的快速增殖導(dǎo)致其血液供應(yīng)不能滿足能量需求，促使腫瘤釋放出特異性血管形成因子（如VEGF），因而促進(jìn)了GLUT1的高表達(dá)。VEGF、Glut1的表達(dá)均與PCNA呈正相關(guān)，推測(cè)Glut1及VEGF高表達(dá)可能跟NSCLC增殖活動(dòng)有關(guān)，但是對(duì)于它們促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究。

Glut1、VEGF及PCNA在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，三者聯(lián)合檢測(cè)可作為評(píng)價(jià)NSCLC生物學(xué)行為及其預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)，為其早期診斷及預(yù)防提供重要參考依據(jù)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Funakoshi T，Lee CH，Hsieh JJ. A systematic review of predictive and prognostic biomarkers for VEGF-targeted therapy in renal cell carcinoma [J]. Cancer Treat Rev，2014，40（4）：533-547.

[2] Bravo R，F(xiàn)rank R，Blundell PA，et al. Cylin /PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta [J]. Nature，1987，326（6112）：515-517.

[3] Sobin LH，Wittekind C. UICC TNM classification of malignant tumours [M]. 5th. New York：Wiley Liss，1997：93-97.

[4] Cooper R，Sarioglu S，Sokmen S，et al. Glucose transporter-1（GLUT-1）：a potential marker of prognosis in rectal carcinoma [J]. Br Cancer，2003，89（5）：870-876.

[5] Ye X，Lu D. HER-2 and VEGF expression in breast cancer and their correlations [J]. Chinese-German J Clin Oncol，2010，9（4）：208-212.

[6] Noguchi Y，Saito A，Miyagi Y，et al. Suppression of facilitative glucose transporter 1 mRNA can suppress tumor growth [J]. Cancer Lett，2000，154（2）：175-182.

[7] Lidgren A，Bergh A，Grankvist K，et al. Glucose transporter-1 expression in renal cell carcinoma and its correlation with hypoxia inducible factor-1 alpha [J]. BJU Int，2008，1（4）：480-484.

[8] Meijer TW，Schuurbiers OC，Kaanders JH，et al. Differences in metabolism between adeno-and squamous cell non-small cell lung carcinomas：spatial distribution and prognostic value of GLUT1 and MCT4 [J]. Lung Cancer，2012， 76（3）：316-323.

[9] Shang L，Zhao J，Wang W，et al. Inhibitory effect of endostar on lymphangiogenesis in non-small cell lung cancer and its effect on circulating tumor cells [J]. Chinese Journal of Lung Cancer，2014，20（10）：722-729.

[10] 錢玥，鄒萍.血管內(nèi)皮生長因子在非小細(xì)胞肺癌患者診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2014，20（12）：8-9.

[11] Dieckman LM，F(xiàn)reudenthal BD，Washington MT. PCNA structure and function：insights from structures of PCNA complexes and post-translationally modified PCNA [J]. Subcell Biochem，2012，62（3）：281-299.

（收稿日期：2015-10-22 本文編輯：張瑜杰）