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    光譜法研究頭孢西丁鈉與牛血清白蛋白的相互作用

    2016-11-19 03:50:59劉里
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:相互作用

    劉里

    摘要:在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,運(yùn)用熒光光譜和紫外-可見光譜法研究了頭孢西丁鈉(CS)與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用和共存金屬離子對CS與BSA的相互作用的影響。計(jì)算了不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果表明,CS對BSA的猝滅機(jī)制屬于形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程;兩者之間的作用主要是氫鍵或范德華力。CS在BSA中的結(jié)合位點(diǎn)主要位于ⅢA。Hill系數(shù)nH>1,表明CS有強(qiáng)的協(xié)同作用。根據(jù)同步熒光光譜法研究了CS對BSA構(gòu)象的影響??疾炝薋e3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+金屬離子對兩者相互作用的影響,結(jié)果表明金屬離子對CS與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均有影響,降低了其結(jié)合能力。

    關(guān)鍵詞:頭孢西丁鈉;相互作用;金屬離子

    中圖分類號:R96 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)04-0971-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.039

    Study on Interaction between Cefoxitin Sodium and Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Metal Ion on the Reaction by Spectrometry

    LIU Li

    (College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University, Qujing 655011, Yunnan, China)

    Abstract: Under the optimized conditions, the interaction of cefoxitin sodium (CS) with bovine serum albumin(BSA) and the effects of the coexisted metal ion on the reaction were investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet-visible light absorption spectrometry. The evaluation index was the binding constants, number of binding sites and thermodynamic parameters under different temperatures. The results showed that the quenching of BSA by CS was a static quenching procedure involving complex formation. The interaction between BSA and CS was dominated by Van Der Waals forces or hydrogen bond. The primary binding site for TI was located at sub-domain ⅢA of BSA. The values of Hill's coefficients were more than 1, which suggested that there was some strong positive cooperative effect. The effect of CS on the conformation of BSA was analyzed by synchronous fluorescence spectrometry. The metal ion such as Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+ and Mg2+, had effects on the binding constants and binding sites numbers of CS and BSA and declined its abilities of combination.

    Key words:cefoxitin sodium;interaction; metal ions

    頭孢西丁鈉(Cefoxitin sodium,CS),常用于呼吸道感染、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、腎盂腎炎、尿路感染、敗血癥以及關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等感染的治療[1],是一種安全、有效的抗生素。藥物與血清白蛋白作用力的大小直接影響到藥物在體內(nèi)的分布、清除以及藥效等重要生命過程。因此,研究藥物與血清白蛋白的結(jié)合作用對理清藥物的作用機(jī)制意義重大[2-4]。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性,牛血清白蛋白(BSA)廣泛運(yùn)用于和藥物結(jié)合的研究[2-4]。至今還未見光譜法研究CS和BSA相互作用的報(bào)道,而且以往研究藥物與BSA結(jié)合作用主要集中在猝滅機(jī)理的判斷上。而本試驗(yàn)從不同的方面研究了CS與BSA的結(jié)合反應(yīng),除了常規(guī)的作用機(jī)理及結(jié)合特征的研究,還深入探討了兩者的結(jié)合位置、藥物之間的協(xié)同性以及金屬離子對CS與BSA結(jié)合反應(yīng)的影響。這些研究對于闡明CS在機(jī)體內(nèi)的傳輸、代謝過程及藥理作用具有有益的參考意義。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器與試劑

    熒光光譜儀:F-4600,日本日立公司,狹縫寬度 10.0 nm,負(fù)高壓為 400 V;紫外-可見光譜儀:Cary 50型,美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。牛血清白蛋白(上??瑯由锛夹g(shù)有限公司)配成1.0×10-4 mol/L溶液,頭孢西丁鈉(百靈威科技有限公司) 配成1.54×10-4 mol/L溶液,三羥甲基氨基甲烷(Tris,成都化學(xué)試劑廠) 制成0.2 mol/L的溶液,試驗(yàn)用水為超純水。

    1.2 試驗(yàn)方法

    準(zhǔn)確移取0.2 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL于10.0 mL比色管中,加入0.5 mol/L NaCl溶液2.0 mL以保持反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度。再加入1.0×10-6 mol/L的BSA 2.25 mL和0、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0 mL的1.54×10-4 mol/L的CS溶液,用水釋至刻度并搖勻。熒光分光光度計(jì)記錄熒光光譜,其最大激發(fā)/發(fā)射波長(λex/λem)位于280 nm/344 nm 處,掃描熒光猝滅光譜和同步熒光光譜(Δλ分別為15 nm和60 nm)記錄F和F0(F和F0分別指CS存在與不存在時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度)。以相應(yīng)的CS溶液作為參比,記錄CS-BSA體系的吸收光譜。按照上述條件,在CS-BSA體系中加入濃度均為1×10-3 mol/L金屬離子(Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+)0.2 mL,測定其熒光光譜。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對適宜反應(yīng)條件的探究

    分別考察了緩沖溶液種類、pH、緩沖溶液的用量、BSA的濃度以及試劑加入順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果表明,選用0.02 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL調(diào)節(jié)酸度,2.25×10-6 mol/L BSA作為反應(yīng)濃度,CS→BSA→NaCl→Tris-HCl的加入順序進(jìn)行測量時(shí)效果最佳。

    2.2 猝滅光譜

    在試驗(yàn)條件下,固定BSA的濃度,在激發(fā)波長為280 nm的條件下,掃描復(fù)合物CS-BSA的熒光光譜得圖1。由圖1可知,隨著CS濃度的增大,最大激發(fā)波長紅移,BSA的內(nèi)源熒光有規(guī)律地降低,但是峰形未發(fā)生變化,表明CS可以猝滅蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光。

    2.3 猝滅類型的確定

    熒光猝滅機(jī)理類型分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[5-7]。常用溫度的變化來確定猝滅類型。在動(dòng)態(tài)猝滅中分子擴(kuò)散起主導(dǎo),猝滅常數(shù)會隨著溫度的升高而增大;對于靜態(tài)猝滅,因有新物質(zhì)生成,穩(wěn)定性起主導(dǎo)作用,溫度越高,猝滅常數(shù)反而越小[5-7]。猝滅過程遵循S-V方程:F0/F=1+KSV[C]=1+Kqτ0[C],式中KSV為猝滅常數(shù);Kq為速率常數(shù)[最大值約為2×1010 L/(mol·s)];τ0為熒光體平均壽命,一般為10-8 s數(shù)量級;[C]為CS的濃度。由表1可知,3個(gè)溫度下Kq均大于2×1010 L/(mol·s),所以初步判斷猝滅過程為靜態(tài)猝滅;又由圖2可見,隨著反應(yīng)溫度的升高,直線斜率即Ksv逐漸降低,進(jìn)一步說明CS與BSA的猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅。

    若為靜態(tài)猝滅,則應(yīng)符合L-B方程[8-10]:(F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[C])-1,式中KLB為靜態(tài)熒光猝滅解離常數(shù),(F0-F)-1-[C]-1作不同溫度下的L-B曲線,結(jié)果見表2。由表2可見,KLB值都在104數(shù)量級,結(jié)合力很強(qiáng),并且隨著溫度升高,KLB越來越小,表明CS與BSA的結(jié)合是符合靜態(tài)猝滅特征的。

    考察熒光體的吸收光譜是區(qū)分反應(yīng)體系為靜態(tài)猝滅還是動(dòng)態(tài)猝滅的另一種方法,動(dòng)態(tài)猝滅僅僅影響熒光體的激發(fā)態(tài)而不影響熒光體的吸收光譜,而基態(tài)配合物的形成會引起熒光體吸收光譜的變化[5-7]。由圖3可知,CS和BSA的疊加紫外吸收光譜和藥品作用下的BSA紫外吸收光譜不重疊,最大吸收波長由277 nm紅移至280 nm。由此可證明CS對BSA的猝滅作用為靜態(tài)猝滅。

    2.4 CS與BSA結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

    如藥物小分子與BSA大分子存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),它們之間相互作用關(guān)系符合公式lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[C][8-10]。分別在297、312、327 K溫度下,以lg(F0-F)/F對lg[C]作圖,通過線性擬合可得到直線的斜率和截距,由直線的斜率和截距可求出CS與BSA不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,見表3。由表3可知,3個(gè)溫度下的n均大于1,K至少達(dá)到104,表明CS與BSA的相互作用較強(qiáng)??傮w趨勢來看n和K隨溫度升高而增大,當(dāng)溫度為327 K時(shí),n接近2,溫度的提升有利于血清白蛋白攜帶著CS在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配。

    2.5 CS與BSA作用力類型的確定

    靜電引力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等是藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子的主要結(jié)合作用力[8-10]。把結(jié)合反應(yīng)的焓變ΔH看作是一個(gè)常數(shù)(溫度變化范圍不大時(shí))[8-10]。根據(jù)熱力學(xué)公式[8-10]計(jì)算CS與BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH,熵變ΔS及吉布斯自由能變ΔG,結(jié)果見表4。根據(jù)Ross等[11]、Sulkowska等[12]、劉保生等[13]總結(jié)出的規(guī)則進(jìn)行判斷,由表4可得,ΔG<0,表明BSA與CS的反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行,ΔH<0,表明反應(yīng)為放熱反應(yīng),ΔS<0,表明反應(yīng)過程為熵減小過程,ΔH<0、ΔS<0,說明氫鍵和范德華力為CS與BSA的主要作用力。

    2.6 CS與BSA相互作用的同步熒光光譜

    血清白蛋白的構(gòu)象變化通常用同步熒光光譜來分析,根據(jù)最大發(fā)射波長Δλ的變化來確定[8-10]其熒光主要來自于何種氨基酸殘基,而且氨基酸殘基的λmax與其所處的疏水性也緊密相關(guān)[8-10]。酪氨酸殘基的特征熒光由Δλ=15 nm時(shí)測得的同步熒光光譜顯示;色氨酸殘基的特征熒光由Δλ=60 nm測得的同步熒光光譜顯示[8-10]。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm測BSA的同步熒光光譜(圖4)。由圖4可見,隨CS濃度的增大,Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的λmax均有紅移,Δλ=15 nm酪氨酸從281 nm紅移至285 nm,紅移了4 nm;Δλ=60 nm色氨酸殘基從280 nm紅移至285 nm,紅移了5 nm。表明CS與BSA作用改變了色氨酸、酪氨酸殘基所處的微環(huán)境,氨基酸微環(huán)境的改變使得BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強(qiáng),疏水性減弱,從而導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

    2.7 結(jié)合位置的確定

    與人血清白蛋白相似,BSA含有3個(gè)ɑ-螺旋域(Ⅰ-Ⅲ),每個(gè)ɑ-螺旋域包含兩個(gè)亞螺旋域A和 B。為確定藥物小分子與BSA結(jié)合的具體位置并反映出在兩者的作用過程中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的實(shí)際參與情況,用文獻(xiàn)[12-14]提出的方法,即比較280 nm和295 nm激發(fā)時(shí)的體系熒光猝滅曲線。由圖5可知,兩種激發(fā)波長下,CS與BSA的猝滅曲線是獨(dú)立的,而且猝滅程度是在280 nm時(shí)比295 nm時(shí)要小,這一現(xiàn)象說明在CS與BSA的猝滅反應(yīng)中,色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中,結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域的ⅢA中。

    2.8 藥物協(xié)同性

    Sulkowska等[12]、劉保生等[13]、梁宏等[14]認(rèn)為藥物協(xié)同性是指藥物與具有多重結(jié)合部位的BSA結(jié)合過程中各結(jié)合部位之間可能存在相互影響作用,可用Hill方程[12-14]進(jìn)行分析:lgH/(1-H)=lgK+nHlg[C],式中,H為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù),K為結(jié)合常數(shù),nH為Hill系數(shù)。在熒光試驗(yàn)中:H/(1-H)=B/(Bm-B),其中,B=(F0-F)/F0;1/Bm是1/B對1/[C]作圖的截距。CS-BSA的nH值的計(jì)算結(jié)果見表5。表5中3個(gè)溫度下的nH都大于1,表現(xiàn)為正協(xié)同作用。隨溫度的升高,nH逐漸增大而且變化較大,表明藥物協(xié)同性對溫度變化很敏感。當(dāng)溫度為327 K時(shí),nH大于2,表現(xiàn)為較強(qiáng)的正協(xié)同作用。即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后,有利于后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合。

    2.9 金屬離子對體系的影響

    金屬離子與蛋白質(zhì)有一定的結(jié)合力[2],金屬離子的存在會直接影響藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合[8,9]。為此,測定了幾種常見金屬離子Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+對CS-BSA體系相互作用的影響,結(jié)果見表6。從表6中可明顯看出,金屬離子不同,K′和n也不同,其原因可能是由于金屬元素本身的原子結(jié)構(gòu)不同,才導(dǎo)致與BSA的結(jié)合力和結(jié)合位點(diǎn)的差異。這五種常見金屬離子的K′都比原體系的K小,其中Cr3+對體系的影響最大,可能是金屬離子與BSA先結(jié)合,占據(jù)了BSA的結(jié)合位點(diǎn),從而使CS與BSA結(jié)合作用減弱。但CS與血清白蛋白結(jié)合力減弱,可能會縮短藥物的存儲時(shí)間,增大藥物的最大作用強(qiáng)度[8-10]。

    3 結(jié)論

    用熒光和紫外光譜法推斷出CS對BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅,兩者靠氫鍵和范德華力作用力結(jié)合;通過計(jì)算求得了K和n值的大小,表明CS可以被BSA運(yùn)輸;兩者結(jié)合位置位于BSA的亞螺旋域ⅢA中;在CS與BSA結(jié)合過程中,藥物分子之間有較強(qiáng)的正協(xié)同性;CS對BSA的構(gòu)象產(chǎn)生一定的影響;詳細(xì)研究了Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+對CS與BSA相互作用的影響。

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