• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    光譜法研究頭孢西丁鈉與牛血清白蛋白的相互作用

    2016-11-19 03:50:59劉里
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年4期
    關(guān)鍵詞:相互作用

    劉里

    摘要:在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,運(yùn)用熒光光譜和紫外-可見光譜法研究了頭孢西丁鈉(CS)與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用和共存金屬離子對CS與BSA的相互作用的影響。計(jì)算了不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。結(jié)果表明,CS對BSA的猝滅機(jī)制屬于形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程;兩者之間的作用主要是氫鍵或范德華力。CS在BSA中的結(jié)合位點(diǎn)主要位于ⅢA。Hill系數(shù)nH>1,表明CS有強(qiáng)的協(xié)同作用。根據(jù)同步熒光光譜法研究了CS對BSA構(gòu)象的影響??疾炝薋e3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+金屬離子對兩者相互作用的影響,結(jié)果表明金屬離子對CS與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均有影響,降低了其結(jié)合能力。

    關(guān)鍵詞:頭孢西丁鈉;相互作用;金屬離子

    中圖分類號:R96 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)04-0971-04

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.039

    Study on Interaction between Cefoxitin Sodium and Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Metal Ion on the Reaction by Spectrometry

    LIU Li

    (College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University, Qujing 655011, Yunnan, China)

    Abstract: Under the optimized conditions, the interaction of cefoxitin sodium (CS) with bovine serum albumin(BSA) and the effects of the coexisted metal ion on the reaction were investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet-visible light absorption spectrometry. The evaluation index was the binding constants, number of binding sites and thermodynamic parameters under different temperatures. The results showed that the quenching of BSA by CS was a static quenching procedure involving complex formation. The interaction between BSA and CS was dominated by Van Der Waals forces or hydrogen bond. The primary binding site for TI was located at sub-domain ⅢA of BSA. The values of Hill's coefficients were more than 1, which suggested that there was some strong positive cooperative effect. The effect of CS on the conformation of BSA was analyzed by synchronous fluorescence spectrometry. The metal ion such as Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+ and Mg2+, had effects on the binding constants and binding sites numbers of CS and BSA and declined its abilities of combination.

    Key words:cefoxitin sodium;interaction; metal ions

    頭孢西丁鈉(Cefoxitin sodium,CS),常用于呼吸道感染、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、腎盂腎炎、尿路感染、敗血癥以及關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等感染的治療[1],是一種安全、有效的抗生素。藥物與血清白蛋白作用力的大小直接影響到藥物在體內(nèi)的分布、清除以及藥效等重要生命過程。因此,研究藥物與血清白蛋白的結(jié)合作用對理清藥物的作用機(jī)制意義重大[2-4]。因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性,牛血清白蛋白(BSA)廣泛運(yùn)用于和藥物結(jié)合的研究[2-4]。至今還未見光譜法研究CS和BSA相互作用的報(bào)道,而且以往研究藥物與BSA結(jié)合作用主要集中在猝滅機(jī)理的判斷上。而本試驗(yàn)從不同的方面研究了CS與BSA的結(jié)合反應(yīng),除了常規(guī)的作用機(jī)理及結(jié)合特征的研究,還深入探討了兩者的結(jié)合位置、藥物之間的協(xié)同性以及金屬離子對CS與BSA結(jié)合反應(yīng)的影響。這些研究對于闡明CS在機(jī)體內(nèi)的傳輸、代謝過程及藥理作用具有有益的參考意義。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器與試劑

    熒光光譜儀:F-4600,日本日立公司,狹縫寬度 10.0 nm,負(fù)高壓為 400 V;紫外-可見光譜儀:Cary 50型,美國瓦里安技術(shù)中國有限公司。牛血清白蛋白(上??瑯由锛夹g(shù)有限公司)配成1.0×10-4 mol/L溶液,頭孢西丁鈉(百靈威科技有限公司) 配成1.54×10-4 mol/L溶液,三羥甲基氨基甲烷(Tris,成都化學(xué)試劑廠) 制成0.2 mol/L的溶液,試驗(yàn)用水為超純水。

    1.2 試驗(yàn)方法

    準(zhǔn)確移取0.2 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL于10.0 mL比色管中,加入0.5 mol/L NaCl溶液2.0 mL以保持反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度。再加入1.0×10-6 mol/L的BSA 2.25 mL和0、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0 mL的1.54×10-4 mol/L的CS溶液,用水釋至刻度并搖勻。熒光分光光度計(jì)記錄熒光光譜,其最大激發(fā)/發(fā)射波長(λex/λem)位于280 nm/344 nm 處,掃描熒光猝滅光譜和同步熒光光譜(Δλ分別為15 nm和60 nm)記錄F和F0(F和F0分別指CS存在與不存在時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度)。以相應(yīng)的CS溶液作為參比,記錄CS-BSA體系的吸收光譜。按照上述條件,在CS-BSA體系中加入濃度均為1×10-3 mol/L金屬離子(Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+)0.2 mL,測定其熒光光譜。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對適宜反應(yīng)條件的探究

    分別考察了緩沖溶液種類、pH、緩沖溶液的用量、BSA的濃度以及試劑加入順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果表明,選用0.02 mol/L、pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液1.0 mL調(diào)節(jié)酸度,2.25×10-6 mol/L BSA作為反應(yīng)濃度,CS→BSA→NaCl→Tris-HCl的加入順序進(jìn)行測量時(shí)效果最佳。

    2.2 猝滅光譜

    在試驗(yàn)條件下,固定BSA的濃度,在激發(fā)波長為280 nm的條件下,掃描復(fù)合物CS-BSA的熒光光譜得圖1。由圖1可知,隨著CS濃度的增大,最大激發(fā)波長紅移,BSA的內(nèi)源熒光有規(guī)律地降低,但是峰形未發(fā)生變化,表明CS可以猝滅蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光。

    2.3 猝滅類型的確定

    熒光猝滅機(jī)理類型分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[5-7]。常用溫度的變化來確定猝滅類型。在動(dòng)態(tài)猝滅中分子擴(kuò)散起主導(dǎo),猝滅常數(shù)會隨著溫度的升高而增大;對于靜態(tài)猝滅,因有新物質(zhì)生成,穩(wěn)定性起主導(dǎo)作用,溫度越高,猝滅常數(shù)反而越小[5-7]。猝滅過程遵循S-V方程:F0/F=1+KSV[C]=1+Kqτ0[C],式中KSV為猝滅常數(shù);Kq為速率常數(shù)[最大值約為2×1010 L/(mol·s)];τ0為熒光體平均壽命,一般為10-8 s數(shù)量級;[C]為CS的濃度。由表1可知,3個(gè)溫度下Kq均大于2×1010 L/(mol·s),所以初步判斷猝滅過程為靜態(tài)猝滅;又由圖2可見,隨著反應(yīng)溫度的升高,直線斜率即Ksv逐漸降低,進(jìn)一步說明CS與BSA的猝滅作用屬于靜態(tài)猝滅。

    若為靜態(tài)猝滅,則應(yīng)符合L-B方程[8-10]:(F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[C])-1,式中KLB為靜態(tài)熒光猝滅解離常數(shù),(F0-F)-1-[C]-1作不同溫度下的L-B曲線,結(jié)果見表2。由表2可見,KLB值都在104數(shù)量級,結(jié)合力很強(qiáng),并且隨著溫度升高,KLB越來越小,表明CS與BSA的結(jié)合是符合靜態(tài)猝滅特征的。

    考察熒光體的吸收光譜是區(qū)分反應(yīng)體系為靜態(tài)猝滅還是動(dòng)態(tài)猝滅的另一種方法,動(dòng)態(tài)猝滅僅僅影響熒光體的激發(fā)態(tài)而不影響熒光體的吸收光譜,而基態(tài)配合物的形成會引起熒光體吸收光譜的變化[5-7]。由圖3可知,CS和BSA的疊加紫外吸收光譜和藥品作用下的BSA紫外吸收光譜不重疊,最大吸收波長由277 nm紅移至280 nm。由此可證明CS對BSA的猝滅作用為靜態(tài)猝滅。

    2.4 CS與BSA結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

    如藥物小分子與BSA大分子存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),它們之間相互作用關(guān)系符合公式lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[C][8-10]。分別在297、312、327 K溫度下,以lg(F0-F)/F對lg[C]作圖,通過線性擬合可得到直線的斜率和截距,由直線的斜率和截距可求出CS與BSA不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n,見表3。由表3可知,3個(gè)溫度下的n均大于1,K至少達(dá)到104,表明CS與BSA的相互作用較強(qiáng)??傮w趨勢來看n和K隨溫度升高而增大,當(dāng)溫度為327 K時(shí),n接近2,溫度的提升有利于血清白蛋白攜帶著CS在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配。

    2.5 CS與BSA作用力類型的確定

    靜電引力、疏水作用力、氫鍵和范德華力等是藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子的主要結(jié)合作用力[8-10]。把結(jié)合反應(yīng)的焓變ΔH看作是一個(gè)常數(shù)(溫度變化范圍不大時(shí))[8-10]。根據(jù)熱力學(xué)公式[8-10]計(jì)算CS與BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH,熵變ΔS及吉布斯自由能變ΔG,結(jié)果見表4。根據(jù)Ross等[11]、Sulkowska等[12]、劉保生等[13]總結(jié)出的規(guī)則進(jìn)行判斷,由表4可得,ΔG<0,表明BSA與CS的反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行,ΔH<0,表明反應(yīng)為放熱反應(yīng),ΔS<0,表明反應(yīng)過程為熵減小過程,ΔH<0、ΔS<0,說明氫鍵和范德華力為CS與BSA的主要作用力。

    2.6 CS與BSA相互作用的同步熒光光譜

    血清白蛋白的構(gòu)象變化通常用同步熒光光譜來分析,根據(jù)最大發(fā)射波長Δλ的變化來確定[8-10]其熒光主要來自于何種氨基酸殘基,而且氨基酸殘基的λmax與其所處的疏水性也緊密相關(guān)[8-10]。酪氨酸殘基的特征熒光由Δλ=15 nm時(shí)測得的同步熒光光譜顯示;色氨酸殘基的特征熒光由Δλ=60 nm測得的同步熒光光譜顯示[8-10]。Δλ=15 nm和Δλ=60 nm測BSA的同步熒光光譜(圖4)。由圖4可見,隨CS濃度的增大,Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的λmax均有紅移,Δλ=15 nm酪氨酸從281 nm紅移至285 nm,紅移了4 nm;Δλ=60 nm色氨酸殘基從280 nm紅移至285 nm,紅移了5 nm。表明CS與BSA作用改變了色氨酸、酪氨酸殘基所處的微環(huán)境,氨基酸微環(huán)境的改變使得BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強(qiáng),疏水性減弱,從而導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。

    2.7 結(jié)合位置的確定

    與人血清白蛋白相似,BSA含有3個(gè)ɑ-螺旋域(Ⅰ-Ⅲ),每個(gè)ɑ-螺旋域包含兩個(gè)亞螺旋域A和 B。為確定藥物小分子與BSA結(jié)合的具體位置并反映出在兩者的作用過程中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的實(shí)際參與情況,用文獻(xiàn)[12-14]提出的方法,即比較280 nm和295 nm激發(fā)時(shí)的體系熒光猝滅曲線。由圖5可知,兩種激發(fā)波長下,CS與BSA的猝滅曲線是獨(dú)立的,而且猝滅程度是在280 nm時(shí)比295 nm時(shí)要小,這一現(xiàn)象說明在CS與BSA的猝滅反應(yīng)中,色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中,結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域的ⅢA中。

    2.8 藥物協(xié)同性

    Sulkowska等[12]、劉保生等[13]、梁宏等[14]認(rèn)為藥物協(xié)同性是指藥物與具有多重結(jié)合部位的BSA結(jié)合過程中各結(jié)合部位之間可能存在相互影響作用,可用Hill方程[12-14]進(jìn)行分析:lgH/(1-H)=lgK+nHlg[C],式中,H為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù),K為結(jié)合常數(shù),nH為Hill系數(shù)。在熒光試驗(yàn)中:H/(1-H)=B/(Bm-B),其中,B=(F0-F)/F0;1/Bm是1/B對1/[C]作圖的截距。CS-BSA的nH值的計(jì)算結(jié)果見表5。表5中3個(gè)溫度下的nH都大于1,表現(xiàn)為正協(xié)同作用。隨溫度的升高,nH逐漸增大而且變化較大,表明藥物協(xié)同性對溫度變化很敏感。當(dāng)溫度為327 K時(shí),nH大于2,表現(xiàn)為較強(qiáng)的正協(xié)同作用。即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后,有利于后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合。

    2.9 金屬離子對體系的影響

    金屬離子與蛋白質(zhì)有一定的結(jié)合力[2],金屬離子的存在會直接影響藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合[8,9]。為此,測定了幾種常見金屬離子Mn2+、Ni2+、Cr3+、Fe3+、Mg2+對CS-BSA體系相互作用的影響,結(jié)果見表6。從表6中可明顯看出,金屬離子不同,K′和n也不同,其原因可能是由于金屬元素本身的原子結(jié)構(gòu)不同,才導(dǎo)致與BSA的結(jié)合力和結(jié)合位點(diǎn)的差異。這五種常見金屬離子的K′都比原體系的K小,其中Cr3+對體系的影響最大,可能是金屬離子與BSA先結(jié)合,占據(jù)了BSA的結(jié)合位點(diǎn),從而使CS與BSA結(jié)合作用減弱。但CS與血清白蛋白結(jié)合力減弱,可能會縮短藥物的存儲時(shí)間,增大藥物的最大作用強(qiáng)度[8-10]。

    3 結(jié)論

    用熒光和紫外光譜法推斷出CS對BSA熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅,兩者靠氫鍵和范德華力作用力結(jié)合;通過計(jì)算求得了K和n值的大小,表明CS可以被BSA運(yùn)輸;兩者結(jié)合位置位于BSA的亞螺旋域ⅢA中;在CS與BSA結(jié)合過程中,藥物分子之間有較強(qiáng)的正協(xié)同性;CS對BSA的構(gòu)象產(chǎn)生一定的影響;詳細(xì)研究了Fe3+、Mn2+、Cr2+、Ni2+、Mg2+對CS與BSA相互作用的影響。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 中華人民共和國藥典(2005年版二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.921.

    [2] 汪世龍.蛋白質(zhì)化學(xué)[M].第一版.上海:同濟(jì)大學(xué)出版社,2012.139.

    [3] 薛春霞,董社英.藥物分子與血清白蛋白相互作用的研究進(jìn)展[J].廣東化工,2013(20):148-149.

    [4] 王 芳,裴明硯,唐 乾,等.藥物與血清白蛋白相互作用中熒光光譜學(xué)的研究進(jìn)展[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào),2009(3):39-43.

    [5] LAKOWICZ J R. Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd ed[M].New York:Springer Press,2006.280.

    [6] 許金鉤,王尊本.熒光分析法[M].第三版.北京:科學(xué)出版社,2006.

    [7] 陳國珍,黃賢智,鄭朱梓,等.熒光分析法[M].第二版.北京:科學(xué)出版社,1990.

    [8] SAD LER P J,TUCKER A,VILES J H. Involement of lysine residue in the N-teminal Ni2+ and Cu2+ binding site of serum albumins comparison with Co2+,Cd2+,Al3+[J]. Eur J Biochem,1994,220(1):193-200.

    [9] 董黎明,鄒淑君,許樹軍,等.熒光法研究金屬離子對橙皮素與牛血清白蛋白相互作用的影響[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2014,33(4):483-488.

    [10] 付彩霞,高宗華.金屬離子對葉酸與牛血清白蛋白相互作用的影響[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊,2014,50(2):177.

    [11] ROSS P D, SUBRAMANIAN S. Thermodynamic of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry,1981,20(11):3096-3102.

    [12] SULKOWSKA A,MACIAZEK-JURCZYK M,BOJKO B,et al.Competitive binding of phenylbutazone and colchicine to serum albumin in multidrug therapy[J]. J Mol Struct,2008, 881(1-3):97-106.

    [13] 劉保生,楊 超,王 晶,等.硫酸頭孢匹羅與牛血清白蛋白結(jié)合反應(yīng)的發(fā)光機(jī)理[J].發(fā)光學(xué)報(bào),2011,32(3):295-296.

    [14] 梁 宏,邊賀東,涂楚橋,等.La(Ⅳ)與HAS或BSA的結(jié)合平衡研究[J].高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報(bào),2001,22(1):21-25.

    猜你喜歡
    相互作用
    隧道工程與水環(huán)境的相互作用
    卷宗(2016年10期)2017-01-21 16:32:59
    黃酮與溶菌酶相互作用的強(qiáng)度衰減—基質(zhì)輔助激光解吸離子化—質(zhì)譜研究
    用問題打開學(xué)生智慧之門
    考試周刊(2016年85期)2016-11-11 01:09:08
    金融體系與實(shí)體經(jīng)濟(jì)關(guān)系的反思
    碳交易與節(jié)能減排政策間的相互作用研究
    古典文學(xué)修養(yǎng)與新聞?wù)Z言的探索
    基于“相互作用”模式的初中英語閱讀教學(xué)探索
    今日教育(2016年6期)2016-07-18 15:58:18
    人口城鎮(zhèn)化與農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的相互關(guān)系研究
    論大學(xué)生活給學(xué)生和教師的教育啟示
    我院臨床常用藥物代謝規(guī)律、相互作用及不良反應(yīng)簡表的建立
    国产成人精品无人区| 久久香蕉精品热| 国产精品影院久久| 国产av不卡久久| 日本 欧美在线| 免费看日本二区| 黄色毛片三级朝国网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| www日本黄色视频网| 88av欧美| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久久国产精品麻豆| 久久午夜亚洲精品久久| 观看免费一级毛片| 动漫黄色视频在线观看| www.999成人在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 两个人免费观看高清视频| 成人午夜高清在线视频 | 国产免费av片在线观看野外av| 日本a在线网址| 欧美丝袜亚洲另类 | 中文在线观看免费www的网站 | 免费av毛片视频| cao死你这个sao货| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲黑人精品在线| 欧美大码av| 亚洲一区中文字幕在线| av在线播放免费不卡| 51午夜福利影视在线观看| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲最大成人中文| 两个人免费观看高清视频| 夜夜爽天天搞| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 不卡一级毛片| 亚洲av成人av| 免费在线观看亚洲国产| 美国免费a级毛片| 99国产极品粉嫩在线观看| 成人免费观看视频高清| 成年免费大片在线观看| 欧美性长视频在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人国语在线视频| 婷婷精品国产亚洲av| avwww免费| 久久久久久久精品吃奶| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 欧美日韩黄片免| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美乱妇无乱码| 国产精品一区二区免费欧美| 精品国产亚洲在线| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 9191精品国产免费久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 在线观看午夜福利视频| 中文字幕久久专区| 久久久久久九九精品二区国产 | 女警被强在线播放| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 男女视频在线观看网站免费 | 国产黄片美女视频| 一进一出好大好爽视频| 俺也久久电影网| 观看免费一级毛片| 999久久久国产精品视频| 19禁男女啪啪无遮挡网站| av福利片在线| 很黄的视频免费| 黑人操中国人逼视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 人妻久久中文字幕网| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 1024手机看黄色片| 久久精品国产综合久久久| 午夜福利在线在线| 免费搜索国产男女视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产av在哪里看| 黄频高清免费视频| 欧美久久黑人一区二区| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲黑人精品在线| 成人欧美大片| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 在线观看舔阴道视频| 精品人妻1区二区| 性色av乱码一区二区三区2| 免费看日本二区| 午夜激情av网站| 久久精品国产清高在天天线| bbb黄色大片| 91在线观看av| 成人三级黄色视频| 中国美女看黄片| 人人澡人人妻人| 免费在线观看影片大全网站| 日本免费a在线| 成人三级做爰电影| 国产一区二区三区视频了| 在线天堂中文资源库| 美女 人体艺术 gogo| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 午夜精品在线福利| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产不卡一卡二| 久久精品91无色码中文字幕| 丁香六月欧美| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 视频在线观看一区二区三区| 成人精品一区二区免费| www日本黄色视频网| 视频在线观看一区二区三区| netflix在线观看网站| 美女午夜性视频免费| 夜夜爽天天搞| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品在线观看二区| av超薄肉色丝袜交足视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜福利免费观看在线| www.熟女人妻精品国产| 午夜视频精品福利| 两个人视频免费观看高清| 高清在线国产一区| 国产精品影院久久| 久久久久国内视频| 亚洲午夜理论影院| 黄色女人牲交| 午夜老司机福利片| 国产精品99久久99久久久不卡| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品福利观看| 国产一区二区激情短视频| 国产区一区二久久| 精品福利观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产久久久一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲 欧美一区二区三区| av中文乱码字幕在线| 亚洲国产精品成人综合色| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品影院久久| 亚洲五月婷婷丁香| 香蕉久久夜色| 国产精品二区激情视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品日韩av在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 日韩欧美 国产精品| av在线天堂中文字幕| 99热这里只有精品一区 | 国产99久久九九免费精品| 亚洲自拍偷在线| a级毛片在线看网站| 一级毛片女人18水好多| 久热这里只有精品99| 麻豆国产av国片精品| 国产熟女xx| 国产欧美日韩一区二区三| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本熟妇午夜| 国产一区二区在线av高清观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产乱人伦免费视频| 十八禁网站免费在线| 十分钟在线观看高清视频www| 麻豆成人av在线观看| 国产精品九九99| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜福利高清视频| 亚洲五月天丁香| 男男h啪啪无遮挡| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 狂野欧美激情性xxxx| 久久香蕉精品热| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜久久久在线观看| 丝袜在线中文字幕| 国产精品久久视频播放| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 最好的美女福利视频网| 国产熟女午夜一区二区三区| 麻豆成人av在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 人妻久久中文字幕网| 午夜视频精品福利| 男人的好看免费观看在线视频 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 人人妻人人澡人人看| 一级a爱视频在线免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 在线播放国产精品三级| www.自偷自拍.com| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 香蕉久久夜色| av有码第一页| 正在播放国产对白刺激| 亚洲第一av免费看| 国产亚洲精品久久久久5区| 制服人妻中文乱码| avwww免费| 人人妻人人澡人人看| 国产精品1区2区在线观看.| 露出奶头的视频| 国产人伦9x9x在线观看| 成人三级黄色视频| 在线看三级毛片| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲av第一区精品v没综合| 高潮久久久久久久久久久不卡| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产av又大| 亚洲最大成人中文| 叶爱在线成人免费视频播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清| www日本黄色视频网| 精品熟女少妇八av免费久了| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 麻豆一二三区av精品| www日本黄色视频网| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美成人午夜精品| 嫩草影院精品99| 日韩欧美国产在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本免费a在线| 国产激情欧美一区二区| 亚洲男人天堂网一区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久久久九九精品影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久久久大精品| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 在线看三级毛片| 色老头精品视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| xxx96com| 色综合亚洲欧美另类图片| 性欧美人与动物交配| 少妇 在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲精品在线美女| 国产爱豆传媒在线观看 | 好男人电影高清在线观看| 91成年电影在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 岛国在线观看网站| 国产av一区二区精品久久| 俺也久久电影网| 国产99久久九九免费精品| 午夜免费成人在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| √禁漫天堂资源中文www| 国产亚洲av高清不卡| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品一区二区精品视频观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美黑人巨大hd| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 黄色视频,在线免费观看| 黄片播放在线免费| 久久精品国产清高在天天线| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩精品青青久久久久久| 青草久久国产| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲av片天天在线观看| 色综合站精品国产| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美黑人欧美精品刺激| 两个人看的免费小视频| 在线永久观看黄色视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久香蕉国产精品| 国产1区2区3区精品| avwww免费| 亚洲五月婷婷丁香| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲av第一区精品v没综合| 级片在线观看| 午夜福利欧美成人| 国产亚洲欧美精品永久| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 97碰自拍视频| 一进一出抽搐动态| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 好男人在线观看高清免费视频 | 美女 人体艺术 gogo| 悠悠久久av| 精品欧美国产一区二区三| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 夜夜爽天天搞| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 白带黄色成豆腐渣| 免费人成视频x8x8入口观看| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲精华国产精华精| 成人国产综合亚洲| a级毛片在线看网站| 白带黄色成豆腐渣| 麻豆av在线久日| 国产精品免费视频内射| 一边摸一边抽搐一进一小说| 少妇 在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费看美女性在线毛片视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 18禁美女被吸乳视频| 国产伦在线观看视频一区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 中文资源天堂在线| 日韩欧美免费精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 9191精品国产免费久久| 欧美激情高清一区二区三区| 超碰成人久久| 成人午夜高清在线视频 | 午夜精品在线福利| 久久久久久人人人人人| 久久这里只有精品19| 波多野结衣高清无吗| 国产国语露脸激情在线看| 男人舔女人的私密视频| av片东京热男人的天堂| 在线视频色国产色| 精品日产1卡2卡| av在线播放免费不卡| 亚洲avbb在线观看| 午夜a级毛片| 国产精品久久电影中文字幕| 久久99热这里只有精品18| www.精华液| 两个人免费观看高清视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 99热只有精品国产| 久久青草综合色| 中文字幕av电影在线播放| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 天堂√8在线中文| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲av电影在线进入| 亚洲国产欧美网| 成人亚洲精品一区在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品久久视频播放| 999久久久精品免费观看国产| 真人一进一出gif抽搐免费| 12—13女人毛片做爰片一| 中国美女看黄片| 欧美性长视频在线观看| videosex国产| 亚洲第一电影网av| 美女午夜性视频免费| 国产成人av教育| 动漫黄色视频在线观看| 大型av网站在线播放| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久天堂一区二区三区四区| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 999久久久精品免费观看国产| 国产成人精品无人区| 精品国产国语对白av| 香蕉av资源在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲精华国产精华精| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久久久国产a免费观看| 欧美久久黑人一区二区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国内精品久久久久久久电影| 身体一侧抽搐| 1024视频免费在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 母亲3免费完整高清在线观看| netflix在线观看网站| 国产一区二区在线av高清观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩免费av在线播放| tocl精华| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品卡一卡二卡四卡免费| 99在线人妻在线中文字幕| 淫妇啪啪啪对白视频| 两个人免费观看高清视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产成人欧美| 男人的好看免费观看在线视频 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产一区二区在线av高清观看| 国产成人av激情在线播放| 在线观看一区二区三区| 在线av久久热| 日本免费一区二区三区高清不卡| 中亚洲国语对白在线视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 99国产综合亚洲精品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久久久久免费视频了| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲av美国av| 黄色丝袜av网址大全| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 好男人电影高清在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲中文字幕日韩| 中国美女看黄片| 国产精品一区二区精品视频观看| av视频在线观看入口| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费看美女性在线毛片视频| 久久精品国产综合久久久| 露出奶头的视频| 麻豆一二三区av精品| 国产午夜精品久久久久久| 午夜免费鲁丝| 国产91精品成人一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 精品福利观看| а√天堂www在线а√下载| 男男h啪啪无遮挡| 国产主播在线观看一区二区| 十分钟在线观看高清视频www| av天堂在线播放| 在线av久久热| 一区福利在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久人妻av系列| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲av五月六月丁香网| 99精品久久久久人妻精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄色丝袜av网址大全| 久久久久久久午夜电影| 精品福利观看| 女警被强在线播放| 国产主播在线观看一区二区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 看免费av毛片| 亚洲av熟女| 丝袜在线中文字幕| 色综合欧美亚洲国产小说| 99精品欧美一区二区三区四区| 91在线观看av| 久久久久九九精品影院| 免费看a级黄色片| 级片在线观看| 极品教师在线免费播放| 熟女电影av网| 在线看三级毛片| 国产欧美日韩一区二区三| 热re99久久国产66热| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 一个人免费在线观看的高清视频| 黄色成人免费大全| 免费在线观看亚洲国产| 91麻豆精品激情在线观看国产| 午夜日韩欧美国产| 丝袜人妻中文字幕| 男女午夜视频在线观看| 中文在线观看免费www的网站 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费电影在线观看免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产三级在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 手机成人av网站| 国产真实乱freesex| 在线观看一区二区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费搜索国产男女视频| 久久精品人妻少妇| 成人18禁在线播放| 成在线人永久免费视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 女人被狂操c到高潮| 国产精品二区激情视频| www日本在线高清视频| 一本一本综合久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久亚洲真实| www.自偷自拍.com| 欧美大码av| 欧美激情高清一区二区三区| 999精品在线视频| 人妻久久中文字幕网| 国产一区二区在线av高清观看| 国产黄片美女视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 宅男免费午夜| 超碰成人久久| 亚洲人成电影免费在线| 国产免费av片在线观看野外av| 成人精品一区二区免费| 日韩高清综合在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 黄色a级毛片大全视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一区二区三区高清视频在线| 久久伊人香网站| av在线天堂中文字幕| 亚洲 国产 在线| 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产精品久久电影中文字幕| 黑丝袜美女国产一区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产单亲对白刺激| АⅤ资源中文在线天堂| av免费在线观看网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 人人妻人人澡人人看| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲最大成人中文| 三级毛片av免费| 免费电影在线观看免费观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一进一出抽搐动态| 免费电影在线观看免费观看| 欧美性长视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 久久中文看片网| 女性被躁到高潮视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 日韩欧美在线二视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 女同久久另类99精品国产91| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲中文av在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 午夜福利在线观看吧| 日韩成人在线观看一区二区三区| 免费观看精品视频网站| 国产精品久久视频播放| 国产成人系列免费观看| 精品高清国产在线一区| 久久九九热精品免费| 亚洲国产精品sss在线观看| 一级毛片高清免费大全| 两性夫妻黄色片| 亚洲片人在线观看|