微流控技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞分析的研究進(jìn)展

莊琪琛 寧芮之 麻遠(yuǎn) 林金明 ??

摘 要 微流控技術(shù)由于其固有的優(yōu)勢(shì)已發(fā)展成為細(xì)胞分析中一個(gè)強(qiáng)有力的工具。本文從微流控芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞微環(huán)境的模擬和控制、單細(xì)胞分析、芯片器官以及微流控芯片與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等方面對(duì)微流控技術(shù)在細(xì)胞分析研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了介紹，并對(duì)這一技術(shù)的發(fā)展前景進(jìn)行了總結(jié)和展望，希望能為相關(guān)研究的開展提供啟發(fā)。

關(guān)鍵詞 微流控芯片；細(xì)胞培養(yǎng)；微環(huán)境；單細(xì)胞；芯片器官；微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；細(xì)胞分析； 綜述

1 引 言

微流控是一門研究如何在微米和亞微米尺度下控制微小流體和顆粒的科學(xué)，同時(shí)也是為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)而誕生的多種技術(shù)的總稱。微流控最早起源于20世紀(jì)90年代，當(dāng)時(shí)人們認(rèn)識(shí)到微電子加工技術(shù)可以應(yīng)用于加工制作微型色譜和毛細(xì)管電泳裝置，并且具有顛覆傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分析方法的應(yīng)用前景[1]。與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分析方法相比，微流控技術(shù)具有樣品消耗量小、分析速度快、自動(dòng)化程度高、微型化、易于集成等優(yōu)勢(shì)[2]。尤其是其強(qiáng)大的集成能力，使得包括反應(yīng)、前處理、檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)流程都能夠集成到一個(gè)微流控系統(tǒng)中完成。

在微流控技術(shù)的眾多應(yīng)用中，人們更加關(guān)注其在生命科學(xué)領(lǐng)域尤其是細(xì)胞分析領(lǐng)域所能發(fā)揮的作用，例如細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)和相互作用、體外細(xì)胞微環(huán)境的構(gòu)建和模擬、單細(xì)胞操控和分析以及芯片器官等。除上述優(yōu)勢(shì)滿足了生命科學(xué)對(duì)細(xì)胞等生物樣品進(jìn)行更高效、更靈敏、更快速分離分析的需求外，微流控系統(tǒng)特征長(zhǎng)度的尺度與細(xì)胞和其他微生物實(shí)體的大小相稱，更有利于對(duì)少量細(xì)胞甚至是單個(gè)細(xì)胞的操控和分析。而且，大多數(shù)生物體系中都會(huì)涉及到微米甚至納米尺度下的物質(zhì)或信號(hào)傳遞，特別是在細(xì)胞細(xì)胞間相互作用及通訊中，這使得能夠應(yīng)用微流控技術(shù)在體外有效模擬細(xì)胞微環(huán)境尤其是模擬可溶性因子所構(gòu)成的微環(huán)境[3]。系統(tǒng)比表面積與其特征長(zhǎng)度成反比意味著在微流控系統(tǒng)中，傳熱和傳質(zhì)等過(guò)程被大大加強(qiáng)，一些在宏觀維度下通常不會(huì)遇到的物理化學(xué)界面現(xiàn)象也能夠利用微流控平臺(tái)進(jìn)行研究。而且，在微小尺度下物質(zhì)的分離也能夠更快速更有效的進(jìn)行。

本文將從微流控芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞微環(huán)境的模擬和控制、單細(xì)胞分析、芯片器官以及微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等方面對(duì)微流控技術(shù)在細(xì)胞分析研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行介紹。

2 微流控芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)是在體外開展細(xì)胞研究的基礎(chǔ)。目前，微流控芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)方式有二維（2D）和三維（3D）兩種培養(yǎng)方式。

微流控芯片上2D培養(yǎng)與將細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中相似，一般都是細(xì)胞貼壁于剛性的2D基底（例如玻璃的表面）上，從細(xì)胞上方流過(guò)培養(yǎng)基等液體來(lái)為細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、沖走代謝廢物或者提供藥物刺激等[4，5]。而在將細(xì)胞2D培養(yǎng)前，一般會(huì)對(duì)芯片通道進(jìn)行表面處理，改善其親水性以利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，常用的修飾試劑有多聚賴氨酸（PolyLlysine，PLL）[6]、膠原蛋白[7]等。PLL為多聚陽(yáng)離子化合物，而細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，使用PLL修飾微通道表面后通過(guò)正負(fù)電荷的吸引作用促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。Gao等[8]利用0.1% PLL溶液對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)室的玻璃表面進(jìn)行修飾后進(jìn)行細(xì)胞的接種、培養(yǎng)和藥物刺激（圖1），A549細(xì)胞在該細(xì)胞培養(yǎng)室中能保持至少5天的活性。在該工作中，Gao等利用聚乙烯管將細(xì)胞培養(yǎng)室與填充有固相萃取材料的功能單元連接起來(lái)，并與電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESIQTOFMS）直接聯(lián)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)A549細(xì)胞對(duì)維生素E代謝的研究。Liu等[9]構(gòu)建了一種微透析紙噴霧離子化質(zhì)譜的一體化平臺(tái)用于細(xì)胞培養(yǎng)的在線化學(xué)監(jiān)控。在該工作中，頻率和大小可控的液滴在微透析后產(chǎn)生并通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)和分析。但是，這種直接在細(xì)胞培養(yǎng)上方流過(guò)培養(yǎng)基的培養(yǎng)方式所產(chǎn)生的流體剪切力會(huì)對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[10～12]。Lecault等[13]開發(fā)了一種等滲灌注微流控細(xì)胞培養(yǎng)陣列實(shí)現(xiàn)了低剪切力條件下的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)。

（A）芯片上2D細(xì)胞培養(yǎng)和固相微萃取單元的示意圖。（B）2D細(xì)胞培養(yǎng)單元的尺寸，接種細(xì)胞前使用0.1% PLL修飾玻璃基底。（C）固相微萃取單元的尺寸。（D）微流控芯片裝置的實(shí)物圖。

（A） Schematics of one unit for cell culture and sample pretreatment prior to ESIQTOFMS detection. （B） Dimensions of cell culture channel， precoated by 0.1% PolyLlysine （PLL） before cells seeded on the glass substrate. （C） Dimensions of microSPE column. （D） An image of microfluidic device.

芯片上2D培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單并易于實(shí)現(xiàn)，但2D培養(yǎng)的細(xì)胞環(huán)境與體內(nèi)細(xì)胞所處的3D環(huán)境相差較大，因而細(xì)胞對(duì)藥物刺激等的反應(yīng)有可能不能反映體內(nèi)的真實(shí)情況。針對(duì)2D培養(yǎng)的上述缺陷，微流控芯片上細(xì)胞的3D培養(yǎng)得到了越來(lái)越多的關(guān)注。微芯片中細(xì)胞的3D培養(yǎng)最常用的策略是將細(xì)胞培養(yǎng)在自然或合成的各種模擬細(xì)胞外基質(zhì)（Extra cellular matrix，ECM）的材料中，例如基質(zhì)膠（Matrigel）[14]、膠原蛋白（Collagen）[15]和水凝膠（Hydrogel）[16～18]等。Wu等[19]利用瓊脂糖凝膠成功開發(fā)出一個(gè)基于模擬血管和組織間擴(kuò)散過(guò)程的三維培養(yǎng)微流控芯片用于量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性分析（圖2A）。Wu等在此3D微流控平臺(tái)上模擬了血管與組織間的擴(kuò)散作用，證明了細(xì)胞自吞噬是導(dǎo)致量子點(diǎn)細(xì)胞毒性的原因之一，為在更精確的微環(huán)境下研究量子點(diǎn)細(xì)胞毒性開拓了新的思路。除此之外，水凝膠以外的材料用于細(xì)胞3D培養(yǎng)的方法也有報(bào)道[20～22]。Toh等[23]通過(guò)在微流控芯片上集成微柱結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了芯片上的3D細(xì)胞培養(yǎng)，并成功保持了肝細(xì)胞正常的解毒功能（圖2B）。

圖2 微流控芯片上的3D細(xì)胞培養(yǎng)。（A）3D培養(yǎng)微流控芯片模擬血管和組織間擴(kuò)散過(guò)程來(lái)分析量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性[19]。（B）用于藥物毒性測(cè)試的3D微流控肝細(xì)胞芯片[23]

Fig.2 3D cell culture on microfluidic chips. （A） Cytotoxicity of quantum dots assay on a microfluidic 3Dculture device based on modeling diffusion process between blood vessels and tissues[19]. （B） A microfluidic 3D hepatocyte chip for drug toxicity testing[23]

細(xì)胞細(xì)胞間相互作用的研究在組織工程、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及揭示癌癥等疾病的機(jī)理等方面都有著重要作用。在體內(nèi)，細(xì)胞細(xì)胞間的相互作用通過(guò)細(xì)胞細(xì)胞間的直接接觸或者可溶性因子的交換而頻繁發(fā)生。微流控技術(shù)為研究細(xì)胞細(xì)胞共培養(yǎng)提供了更為靈活可靠的方式，能夠在體外模擬細(xì)胞細(xì)胞間通過(guò)可溶性信號(hào)或者直接接觸的相互作用。目前常采用膠原蛋白軌道[24，25]、半透膜[26]、聚二甲基硅氧烷（PDMS）多孔薄膜[27，28]、聚碳酸酯（PC）多孔薄膜[29]以及表面張力栓等[30，31]將微流控芯片在空間上分為幾個(gè)區(qū)域來(lái)分別培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞以開展芯片上細(xì)胞細(xì)胞間相互作用的研究。Wong等[25]將包含細(xì)胞的基質(zhì)膠流過(guò)一個(gè)多入口的微通道，借助層流作用利用一個(gè)或多個(gè)水凝膠微板將微通道分隔為幾個(gè)子通道從而構(gòu)造了一個(gè)可調(diào)的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)。Wei等[32]使用具有高度差的微通道實(shí)現(xiàn)了PC12細(xì)胞和GH3細(xì)胞的共培養(yǎng)，并與質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)神經(jīng)元調(diào)節(jié)垂體細(xì)胞分泌生長(zhǎng)激素的行為進(jìn)行了定性和定量的研究。Chen等[28]將小鼠胚胎干（mES）細(xì)胞和飼養(yǎng)層細(xì)胞技術(shù)性地分別培養(yǎng)于PDMS多孔膜的兩側(cè)，并保持了飼養(yǎng)層細(xì)胞較好的增殖狀態(tài)和細(xì)胞活性，同時(shí)維持了mES細(xì)胞的自我更新和未分化潛能。該工作與常規(guī)干細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，不需要對(duì)飼養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行滅活以及無(wú)需進(jìn)一步地純化就能夠直接獲取高純度的胚胎干細(xì)胞。Zhuang等[29]通過(guò)集成聚碳酸酯多孔膜的雙層通道微芯片裝置模擬了神經(jīng)細(xì)胞腎細(xì)胞的相互作用（圖3A）。Mao等[30]則首次在微流控芯片上集成了“表面張力栓”控制和模擬了肝臟在腎上腺素的作用下將肝糖原分解為葡萄糖并釋放到血液中的過(guò)程。將該集成表面張力栓的微芯片與ESIQTOFMS聯(lián)用成功檢測(cè)到了信號(hào)分子腎上腺素和細(xì)胞通訊的最終代謝物葡萄糖（圖3B）。

圖3 用于細(xì)胞細(xì)胞間相互作用研究的微流控芯片平臺(tái)。（A）集成聚碳酸酯多孔膜的微流控芯片研究神經(jīng)細(xì)胞腎細(xì)胞相互作用[29]。（B）集成表面張力栓的微流控芯片研究腎細(xì)胞肝細(xì)胞的相互作用[30]

Fig.3 Microfluidic platform for cellcell interaction study. （A）Nephrocyteneurocyte interaction on polycarbonatemembrane integrated microfluidic device[29]. （B）Nephrocytehepatocyte interaction on surface tension plug integrated microfluidic device[30]

3 微流控芯片上細(xì)胞微環(huán)境的模擬和控制

在體內(nèi)，細(xì)胞的微環(huán)境由復(fù)雜的化學(xué)和機(jī)械力因素組成，包括特定的物理化學(xué)性質(zhì)（氧含量、溫度、pH和滲透壓等）、可溶性因子、細(xì)胞間接觸和細(xì)胞基質(zhì)間相互作用等[33]。在體內(nèi)，細(xì)胞所處的微環(huán)境是動(dòng)態(tài)變化的。微流控芯片上細(xì)胞培養(yǎng)的一大優(yōu)勢(shì)就在于能夠在微尺度上控制細(xì)胞所處的微環(huán)境。

在藥物篩選的研究中，微流控技術(shù)能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)產(chǎn)生濃度梯度來(lái)滿足進(jìn)行系列濃度的平行實(shí)驗(yàn)的需求。微芯片上產(chǎn)生濃度梯度最經(jīng)典的設(shè)計(jì)是“圣誕樹形”結(jié)構(gòu)，該設(shè)計(jì)利用兩種液體的層流作用進(jìn)行混合進(jìn)而產(chǎn)生濃度梯度[34，35]。Gao等[36]通過(guò)集成“圣誕樹形”濃度梯度發(fā)生裝置的微流控芯片平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了高通量的細(xì)胞毒性測(cè)試、藥物吸收和代謝物的同時(shí)表征。近年來(lái)，陸續(xù)開發(fā)了一些產(chǎn)生濃度梯度的方法。Chen等[37]開發(fā)出一種用于細(xì)胞培養(yǎng)和藥物篩選中濃度梯度生成的微流網(wǎng)絡(luò)混合通道。該微流網(wǎng)絡(luò)混合通道的混合過(guò)程是上下混合流所產(chǎn)生的，這比直通道對(duì)于藥物的混合效果要更好。針對(duì)質(zhì)譜只能半定量的缺點(diǎn)，Chen等在該工作中使用了同位素內(nèi)標(biāo)法，不僅擴(kuò)大了芯片上質(zhì)譜檢測(cè)的線性范圍而且提高了線性指數(shù)，真正實(shí)現(xiàn)了芯片質(zhì)譜（ChipMS）聯(lián)用對(duì)細(xì)胞代謝物的定性和定量檢測(cè)。Scherber等[38]則在芯片上觀察了內(nèi)皮細(xì)胞根據(jù)內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（EGF）的梯度在微流控芯片迷宮中“感知”路徑。

缺氧環(huán)境能夠促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，因此，模擬和研究體內(nèi)缺氧微環(huán)境對(duì)腫瘤發(fā)展的影響是腫瘤研究的一大熱點(diǎn)[39]。Wang等[40]在微流控芯片上設(shè)計(jì)產(chǎn)生了O2分子的濃度梯度，并研究了動(dòng)態(tài)缺氧環(huán)境下細(xì)胞對(duì)藥物刺激的反應(yīng)。而Lin等[41]則利用一個(gè)集成化的雙層微流控芯片模擬了腫瘤細(xì)胞體內(nèi)氧濃度梯度的微環(huán)境，并通過(guò)在芯片通道的兩層固定核酸適配體，實(shí)現(xiàn)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165（VEGF165）的在線檢測(cè)（圖4）。此外，他們?cè)谠摴ぷ髦羞€研究了不同距離對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤細(xì)胞間相互作用的影響，以及不同的氧濃度梯度微環(huán)境對(duì)細(xì)胞遷移的影響，深入探索了腫瘤血管新生的信號(hào)通路以及細(xì)胞遷移行為，為宮頸癌的發(fā)生發(fā)展研究提供了重要實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

圖4 在氧梯度下進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)的集成化微芯片裝置[41]。（A）氧氣能夠影響細(xì)胞細(xì)胞間通訊并促進(jìn)細(xì)胞遷移。（B）該集成化微芯片裝置的示意圖。（C）芯片上集成的微閥。（D）在低氧條件下共培養(yǎng)細(xì)胞的雙層微通道截面圖。（E）利用核酸適配體檢測(cè)VEGF165的示意圖。（F）微芯片的實(shí)物圖

Fig.4 Integrated microfluidic device for cell coculture under oxygen gradient system[41]. （A） Oxygen effects cellcell communication and promotes cell migration. （B） Schematic diagrams of integrated microfluidic device. （C） Micro valve integrated on the microchip. （D） Twolayer microfluidic channel for cells coculture under low oxygen conditions. （E） Schematic illustration for determination VEGF165 based on nucleic acid aptamer. （F） Actual microfluidic device

細(xì)胞密度的差異會(huì)引起細(xì)胞間基質(zhì)、自分泌或旁分泌的細(xì)胞因子局部濃度的不同，從而會(huì)導(dǎo)致不同的細(xì)胞反應(yīng)。因此，細(xì)胞密度在一定程度上影響著細(xì)胞細(xì)胞間相互作用，進(jìn)而影響生物體內(nèi)相關(guān)組織的功能[42]。Wu等[43]設(shè)計(jì)了一種精確性好、重復(fù)性高的微流控方法用于細(xì)胞密度梯度的產(chǎn)生。在該工作中，通過(guò)控制通道中微坑的個(gè)數(shù)就能夠調(diào)控細(xì)胞密度，細(xì)胞密度隨著微坑個(gè)數(shù)的增加而增加，而且所產(chǎn)生的細(xì)胞密度梯度與理論計(jì)算值一致。他們利用此微芯片裝置考察了不同細(xì)胞密度下量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)在高細(xì)胞密度條件下比低細(xì)胞密度條件下表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。

此外，微流控技術(shù)對(duì)細(xì)胞微環(huán)境的控制已被用來(lái)闡明一些關(guān)鍵蛋白在諸如成纖維細(xì)胞的趨化性[44]和趨電性[45]等細(xì)胞行為中的作用。微流控芯片還被用來(lái)闡釋一些蛋白的功能，如在炎癥反應(yīng)里中性粒細(xì)胞粘附過(guò)程中選擇素的作用[46]。微流控芯片平臺(tái)也被報(bào)道通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境來(lái)研究旁分泌和自分泌信號(hào)。例如，使用微流控流體減少小鼠胚胎干（mES）細(xì)胞分泌因子的濃度為深入研究信號(hào)分子的動(dòng)態(tài)變化和干細(xì)胞分化提供了有價(jià)值的手段[47，48]。

4 微流控芯片上的單細(xì)胞分析

目前的研究表明，單個(gè)細(xì)胞之間存在著顯著的差異性。開發(fā)單細(xì)胞的操縱、篩選以及分析方法，研究細(xì)胞的異質(zhì)性，對(duì)于疾病診斷、藥物篩選等方面都具有十分重要的意義。微流控技術(shù)具有能夠精確操控小體積樣品的優(yōu)勢(shì)，因此在操縱單個(gè)細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染、染色、分選、測(cè)序等研究中有著廣泛的應(yīng)用前景[49]。

細(xì)胞分選和捕獲技術(shù)已被應(yīng)用來(lái)研究完整的單細(xì)胞或分析裂解的單細(xì)胞中的內(nèi)容物。微流控技術(shù)起源于集成電路芯片的制作，由此通過(guò)設(shè)計(jì)各種微結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞分選和捕獲 [52，53]。Chen等[50]則開發(fā)了一種新型的基于核酸適配體的微坑陣列來(lái)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的特異性捕獲（圖5A）。該工作中具有三維形貌的微坑結(jié)構(gòu)加強(qiáng)了細(xì)胞與微坑表面的核酸適配體之間的相互作用，使得單細(xì)胞占有率高達(dá)88.2%。利用這種對(duì)單細(xì)胞具有特異性的捕獲技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從復(fù)雜細(xì)胞樣品中獲得靶向單細(xì)胞陣列，并進(jìn)一步進(jìn)行了單細(xì)胞水平上的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析，揭示了單細(xì)胞水平上細(xì)胞代謝的差異性。Chen等所使用的微坑陣列是由濕法刻蝕法獲得的，而Liu等[51]則在玻璃基底表面利用聚苯乙烯微球的自組裝制作出了PDMS微坑陣列（圖5B）。這種制作微坑的方法與濕法刻蝕法相比，操作更加簡(jiǎn)捷，而且所使用的試劑對(duì)環(huán)境的危害也更小，更符合綠色化學(xué)的原則。Mach等[54]開發(fā)了一種芯片離心機(jī)（Centrifugeonachip），利用流體的渦流進(jìn)行細(xì)胞分選，并與后續(xù)的樣品濃縮、染色和清洗等處理操作集成在一起。而Wang等[55]將微流控技術(shù)與化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合，建立了一種將單細(xì)胞分散在油相包圍的水相液滴中并進(jìn)行培養(yǎng)和分析的高通量方法。利用該方法可以實(shí)現(xiàn)從104個(gè)細(xì)胞中篩選出唯一一個(gè)過(guò)量消耗木糖的釀酒酵母細(xì)胞，并分析確定導(dǎo)致木糖高消耗的基因組變化。

圖5 微流控芯片上的單細(xì)胞分析：（A）微流控芯片上核酸適配體修飾的微坑陣列用于單細(xì)胞特異性捕獲及酶動(dòng)力學(xué)分析[50]；（B）利用聚苯乙烯微球自組裝制作微坑陣列進(jìn)行高通量的單細(xì)胞分析[51]

Fig.5 Single cell analysis on microfluidic chips： （A） Target isolation and analysis of single tumor cells with aptamerencoded microwell array on microfluidic device[50]；（B） Fabrication of microwell arrays based on twodimensional ordered polystyrene microspheres for highthroughput single cell analysis[51]

隨著微流控技術(shù)的不斷發(fā)展，單細(xì)胞分析也將得到更好的發(fā)展和應(yīng)用，也將更清晰的揭示被細(xì)胞群體性研究所掩蓋的細(xì)胞異質(zhì)性。

5 芯片器官

近年來(lái)，細(xì)胞生物學(xué)、精密加工和微流控技術(shù)的發(fā)展使得模擬和開發(fā)芯片器官的研究得到迅速的發(fā)展，芯片器官能夠?yàn)榕R床化驗(yàn)提供更強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力。Huh等[56]實(shí)現(xiàn)了在芯片上模擬器官水平的肺功能（圖6A）。該仿生微系統(tǒng)的核心部分是一個(gè)PDMS多孔薄膜，人肺泡上皮細(xì)胞和人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞被分別培養(yǎng)在PDMS多孔薄膜的兩側(cè)成功構(gòu)建了功能化的人肺肺泡毛細(xì)血管界面。由于PDMS多孔薄膜具有彈性，將該微芯片裝置與編程控制的真空聯(lián)用能夠成功模擬肺的呼吸運(yùn)動(dòng)，并研究了該條件下兩種細(xì)胞對(duì)納米顆粒的吸入量。近年來(lái)，在微流控芯片上模擬血管生成和心血管系統(tǒng)得到了極大地關(guān)注。Yeon等[57]通過(guò)在纖維蛋白凝膠的任意一側(cè)培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）實(shí)現(xiàn)了芯片上誘導(dǎo)毛細(xì)血管的生成。而Miller等[58]則報(bào)道在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)中加入可降解的玻璃纖維能夠更好地模擬血管網(wǎng)絡(luò)。Song等[59]研究了間隙滲流、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子梯度和剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞在膠原蛋白基質(zhì)中出芽生長(zhǎng)的影響。其它一些心血管芯片器官系統(tǒng)則研究了心肌細(xì)胞對(duì)電的和機(jī)械力刺激的反應(yīng)。例如，Ma等[60]在一個(gè)多電極陣列生物芯片平臺(tái)上構(gòu)造了心肌并成功監(jiān)測(cè)了干細(xì)胞橋接心肌細(xì)胞過(guò)程中的導(dǎo)電性，該因素是成功移植干細(xì)胞治療局部缺血或梗塞的關(guān)鍵因素（圖6B）。而Grosberg等[61]則將心肌細(xì)胞培養(yǎng)在彈性膜上，成功監(jiān)測(cè)了心肌細(xì)胞收縮過(guò)程中的應(yīng)力變化。

圖6 芯片器官。（A）在芯片上重構(gòu)器官水平的肺功能[56]。（B）在多電極陣列生物芯片平臺(tái)上構(gòu)造了心肌并成功監(jiān)測(cè)了干細(xì)胞橋接心肌細(xì)胞過(guò)程中的導(dǎo)電性[60]

Fig.6 Organonachip. （A） Reconstituting organlevel lung functions on a chip[56]. （B） Constructing cardiac muscle on a multielectrode arraybased biochip and successfully measuring the electrical conductivity of stem cells bridging cardiomyocytes[60]

6 微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

在眾多分離檢測(cè)方法中，微流控芯片、電泳化學(xué)發(fā)光、激光誘導(dǎo)熒光和電化學(xué)檢測(cè)等作為最早被使用的技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展，但主要被用于分離或者檢測(cè)已知或者種類較少的目標(biāo)分子[62，63]。Lin等[64]通過(guò)將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和微芯片毛細(xì)管電泳技術(shù)（MCE）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了多元迷你短串聯(lián)重復(fù)序列（miniSTR）位點(diǎn)的快速靈敏檢測(cè)。在最優(yōu)條件下，僅0.001 ng DNA模板便足夠產(chǎn)生miniSTR，且15種miniSTR尺寸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.49 %～4.41%，濃溶液為0.94%～4.95%。同時(shí)，由于這種miniSTR檢測(cè)技術(shù)在對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)下證實(shí)具有可靠性，在刑事鑒定和親子鑒定方面具有巨大潛力。Yi等[65]也使用類似的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)11種人乳頭瘤病毒（HPV）的高靈敏和精確的分型檢測(cè)，檢出限為200 copies，且對(duì)臨床樣品也具有檢出可靠性，可用于宮頸癌的篩選和預(yù)后。

由于質(zhì)譜檢測(cè)能夠一次性快速、高靈敏度地檢測(cè)多組分化合物，檢測(cè)范圍覆蓋了小分子、多肽、氨基酸、蛋白質(zhì)等多尺寸生物產(chǎn)物，且根據(jù)質(zhì)荷比的不同能夠分析和判斷未知產(chǎn)物，在細(xì)胞分析中具有日趨重要的地位。雖然質(zhì)譜檢測(cè)具有以上優(yōu)勢(shì)，但由于細(xì)胞產(chǎn)物復(fù)雜，干擾基質(zhì)強(qiáng)，難以直接用于細(xì)胞產(chǎn)物分析檢測(cè)。因此，將質(zhì)譜與有效的分離模塊聯(lián)用是細(xì)胞分析中的常用手段。從20世紀(jì)50年代至今，開發(fā)出的與質(zhì)譜檢測(cè)器聯(lián)用的分離模塊依次經(jīng)歷了氣相色譜、液相色譜、毛細(xì)管電泳以及近些年的微流控芯片。但與其它基于柱分離的分離技術(shù)不同的是，微流控芯片平臺(tái)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離，同時(shí)還具有高度集成性、在線處理且試劑消耗量更低等，在細(xì)胞研究方面具有無(wú)可比量的優(yōu)勢(shì)[66]。

在微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用中，目前主要使用的是電噴霧質(zhì)譜（ESIMS）。微流控芯片平臺(tái)上的樣品前處理和與質(zhì)譜連接的接口設(shè)計(jì)是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分析的關(guān)鍵。微流控芯片上的樣品前處理通常是通過(guò)在芯片中集成整體柱或者萃取材料[8，36，37]，對(duì)含有血清等復(fù)雜成分的溶液進(jìn)行脫鹽富集處理，提高目標(biāo)檢測(cè)物的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度。Gao等[36]在微流控平臺(tái)上結(jié)合了固相萃取微柱，在質(zhì)譜檢測(cè)前對(duì)流體進(jìn)行了洗凈和濃縮處理，選用甲氨蝶呤（葉酸代謝酶體系的一種抑制劑）為藥物模型，HepG2和Caco2為目標(biāo)細(xì)胞，證實(shí)了其微流控芯片平臺(tái)對(duì)藥物吸收的有效性，有望用于對(duì)活細(xì)胞的實(shí)時(shí)藥物動(dòng)力學(xué)研究（圖7A）。此外，為了簡(jiǎn)化芯片上樣品前處理單元的復(fù)雜設(shè)計(jì)和操作，本研究組還提出了液滴紙噴霧離子源接口和inkjet牙簽噴霧針離子源技術(shù)[67]。通過(guò)液滴紙噴霧，實(shí)現(xiàn)在紙纖維上對(duì)復(fù)雜成分溶液的同步分離和純化過(guò)程，將不易離子化的物質(zhì)保留在紙纖維上。Liu等[68]建立了一種多通道可移動(dòng)微流控芯片檢測(cè)平臺(tái)，使用紙基電噴霧質(zhì)譜，對(duì)非共價(jià)鍵結(jié)合的蛋白蛋白復(fù)合物的締合常數(shù)進(jìn)行了測(cè)定（圖7B）。結(jié)果證明了該平臺(tái)對(duì)蛋白分析的有效性。同樣，Inkjet牙簽噴霧針離子源技術(shù)對(duì)樣品的直接分析也是利用了牙簽的木質(zhì)纖維對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的分離純化作用，且inkjet芯片能可控產(chǎn)生皮升級(jí)微液滴，精確定位滴于牙簽尖端處形成噴霧用于質(zhì)譜分析。Luo等[67]建立了這種裝置（圖7C），并用可可堿作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)咖啡因進(jìn)行了定量檢測(cè)。結(jié)果證明在1～200 mg/L范圍內(nèi)都具有良好的線性，且由于電噴霧持續(xù)時(shí)間短，峰強(qiáng)比近似為峰面積比，可用于定量研究。

圖7 微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用接口設(shè)計(jì)：（A）微流控芯片中的萃取富集腔[36]；（B）紙基電噴霧接口[68]；（C）牙簽尖端電噴霧離子源[67]

Fig.7 Microfluidic chipmass spectrometry （chipMS） interface design： （A） Extraction enrichment cavity in microfluidic chips[36]， （B） Paperbased electrospray interface[68] and （C） Toothpick electrospray ion source[67]

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDIMS）由于對(duì)鹽度具有較好的耐受度，常用于對(duì)生物大分子，如蛋白質(zhì)、多肽等進(jìn)行檢測(cè)，但由于MALDI需要將激光直接照射于樣品和基質(zhì)的共晶層以實(shí)現(xiàn)樣品的離子化，因此需要檢測(cè)樣品區(qū)域?yàn)殚_放式，從而導(dǎo)致其與微流控芯片的聯(lián)用受到了限制。盡管如此，由于MALDI的點(diǎn)陣化檢測(cè)特點(diǎn)，其在單細(xì)胞和點(diǎn)陣化分析方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Zhang等[69]將哺乳動(dòng)物細(xì)胞直接培養(yǎng)在氧化銦錫導(dǎo)電玻璃表面，然后通過(guò)電噴霧的方式將基質(zhì)噴涂在其表面形成一個(gè)均勻的結(jié)晶層，利用MALDI質(zhì)譜對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)進(jìn)行了原位表征，獲得了豐富的膜脂信息，這種較為粗略的分子圖譜可以對(duì)細(xì)胞類型的識(shí)別提供佐證。

7 總結(jié)與展望

經(jīng)過(guò)二十多年的發(fā)展，微流控技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)及細(xì)胞分析的研究中發(fā)揮出了不可替代的作用。與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，微流控芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)有許多優(yōu)勢(shì)，比如能夠在時(shí)間和空間上使細(xì)胞所處的微環(huán)境與體內(nèi)相似，從而使得基于細(xì)胞的分析能夠獲得更為真實(shí)可靠的結(jié)果。研究者們已經(jīng)開發(fā)出許多種方法來(lái)提高微流控系統(tǒng)的能力，例如在同一芯片平臺(tái)上集成不同的功能單元或者設(shè)計(jì)更為有效的結(jié)構(gòu)來(lái)對(duì)流體或者細(xì)胞進(jìn)行操控等。我們有理由相信，用于細(xì)胞分析的芯片設(shè)計(jì)將會(huì)更加靈活有效，更重要的是用于細(xì)胞分析的標(biāo)準(zhǔn)化微流控系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和制備，尤其是微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)（ChipMS），也將逐步成熟，發(fā)展成繼氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）、液相色譜質(zhì)譜（LCMS）、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（CEMS）聯(lián)用3個(gè)不同階段的一項(xiàng)新技術(shù)，分別應(yīng)用于小分子、中等大小的分子、大分子等無(wú)生命的化合物的分離分析，

圖8 微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用細(xì)胞分析方法研究與應(yīng)用發(fā)展趨勢(shì)，圖中GC、LC、CE分別代表氣相色譜、液相色譜、毛細(xì)管電泳等三項(xiàng)重要的分離分析技術(shù)

Fig.8 Development of chipmass spectrometry following with gas chromatography （GC）， liquid chromatography （LC） and capillary electrophoresis （CE）到目前能夠初步應(yīng)用于具有生命最小單元的細(xì)胞的微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用分析，其發(fā)展趨勢(shì)將有可能如圖8所示。所以，我們有理由推測(cè)并且相信，微流控芯片的出現(xiàn)，不單單是為了實(shí)現(xiàn)分析儀器的小型化，其主要是為了適應(yīng)具有微小尺寸的細(xì)胞、細(xì)菌等的研究與分析[66，70，71]。雖然微流控技術(shù)在細(xì)胞分析領(lǐng)域仍然面臨許多挑戰(zhàn)，但由于其所具備的低試劑消耗、高通量、易于集成、設(shè)計(jì)靈活、能夠模擬復(fù)雜微環(huán)境等明顯優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞生物學(xué)方法的優(yōu)勢(shì)使得微芯片技術(shù)依然在生物醫(yī)學(xué)、藥物篩選和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)診斷等許多基于細(xì)胞的分析研究中不可替代。隨著微流控芯片制作材料和微加工技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，我們有望在未來(lái)實(shí)現(xiàn)將便宜且便攜的手持設(shè)備用于大規(guī)模集成化的高通量藥物研發(fā)或者現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)診斷的個(gè)性化醫(yī)療。而更重要的是，我們希望通過(guò)完善各種技術(shù)、加大技術(shù)推廣和宣傳，使多通道微流控芯片質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠在細(xì)胞的研究領(lǐng)域得到廣泛的使用，為生命科學(xué)研究提供一種新的工具。

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Recent Development in Microfluidic Chips for

in vitro Cellbased Research

ZHUANG QiChen1， NING RuiZhi1，2， MA Yuan1， LIN JinMing*1

1（Department of Chemistry， Beijing Key Laboratory of Microanalytical Methods and Instrumentation，

The Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry and Chemical Biology， Tsinghua University， Beijing 100084， China）

2（Department of Biomaterial Sciences， The University of Tokyo， Tokyo 1138657， Japan）

Abstract Microfluidic technology has become a powerful tool in cellbased research due to its inherent advantages. The research progress of cell culture on chips， simulation and manipulation of cell microenvironment on chips， single cell analysis on chips， organonachip， and chipmass spectrometry technology was introduced in this review. Morover， the summary and prospect on the microfluidic technology were introduced to give some insights for researchers who were interested in developing microfluidic platforms for cellbased research.

Keywords Microfluidic chip； Cell culture； Microenvironment； Single cell； Organonachip； Chipmass spectrometry； Cell analysis； Review

（Received 3 January 2016； accepted 16 January 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos.81373373， 21227006， 21435002） and the China Equipment and Education Resources System （No. CERS175）