數(shù)字核酸擴增檢測技術的研究與應用進展

丁雄 牟穎

摘 要 近年來，微納尺度流體控制技術由于具備實現(xiàn)多相、多步和平行反應的優(yōu)勢，已成為傳統(tǒng)分析手段的首選的補充和替代方法。其與核酸擴增方法的完美結合，有效推動了數(shù)字核酸擴增檢測（Digital nucleic acid detection，dNAD）技術的建立與發(fā)展。作為可實現(xiàn)單分子水平檢測的分析方法，dNAD技術已成為分子診斷領域重要的組成部分。本文回顧了dNAD技術的發(fā)展歷程，闡述了其檢測原理， 以及相比于傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢，對其最新研究與應用進展進行了綜述，并對其未來的發(fā)展進行了展望。

關鍵詞 微納尺度； 微流控； 數(shù)字核酸擴增檢測； 數(shù)字PCR； 流體控制； 綜述

1 引 言

現(xiàn)代生物醫(yī)學研究結果表明，對核酸生物標記物進行分析，能有效監(jiān)控與評估相關疾病的發(fā)生、發(fā)展與愈后[1～3]。核酸分析包括定性與定量分析兩種，尤其是定量分析，對揭示疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制至關重要。作為核酸分析的未來發(fā)展方向，單分子水平的數(shù)字核酸擴增檢測（Digital nucleic acid detection，dNAD）技術在現(xiàn)代生物、醫(yī)學研究及診斷領域中的應用備受關注。

目前，常規(guī)或“金標準”的核酸分析技術是聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）。自1983年， PCR誕生以來，PCR及其衍生技術極大地推動了生命科學各個領域的發(fā)展?？v觀整個發(fā)展歷程，PCR技術可分為3個時代[4]。第一代PCR，使用瓊脂糖凝膠電泳等方式對核酸擴增產(chǎn)物進行分析，但操作繁瑣、易交叉污染， 且只能進行定性分析；第二代PCR則是由美國ABI公司推廣的實時熒光定量PCR（Realtime quantitative PCR，qPCR）。作為新一代的PCR技術，qPCR不僅能進行定性分析，還能進行定量分析。根據(jù)定量策略的不同，又分為相對定量和絕對定量。相對定量是以管家基因的表達量為參照，對待測基因表達量進行定量分析的策略，常用于基因表達水平分析；絕對定量則是利用以已知核酸分子數(shù)的標準品與循環(huán)閾值（CT）之間建立的標準曲線對未知樣本中核酸分子進行定量測定的策略。然而，在qPCR擴增的過程中存在擴增偏好或易受抑制劑影響等因素，其擴增效率在不同樣本間難以保持一致，因此使得CT在核酸定量分析過程中有明顯偏差，從而導致檢測原始樣本的核酸數(shù)量出現(xiàn)明顯誤差。 采用qPCR對核酸定量，仍存在靈敏度、準確度和重現(xiàn)性欠佳的不足，難以滿足對稀有突變基因的表達量、低拷貝核酸量的分析要求。鑒于此，第三代PCR即數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）技術應運而生。與前兩代PCR技術相比，dPCR的測量精確度和靈敏度明顯提高[5]，是真正意義上的絕對核酸定量分析技術[6]。本文對dNAD的研究與應用進展進行了綜述，并對其發(fā)展歷程、原理優(yōu)勢和未來發(fā)展前景進行了闡述和展望。

2 dNAD的發(fā)展歷程

作為一種開創(chuàng)性的定量分析技術，dPCR推動PCR技術邁入了新的高度，使核酸定量分析進入到以“終點信號的有或無”來計算數(shù)量的新階段[7]。雖然其雛形早在qPCR成熟之前就被提及，但dPCR的概念卻是由美國科學家Vogelstein和Kinzler在1999年明確提出[8]。就本質(zhì)而言，dPCR就是通過大規(guī)模的平行熒光PCR擴增，將微弱的擴增信號從背景噪音中精準地提煉出來[7]。因此，如何獲得足夠數(shù)量的平行熒光PCR成為實現(xiàn)dPCR的關鍵，而微納流體控制技術及其芯片裝置的開發(fā)應用，為解決這一問題提供了解決方案。到目前為止，已發(fā)展出了各式各樣的dPCR裝置，如集成流路式芯片[9]、旋流片式[10]、滑動芯片式[11]、液滴式[12]、自吸分液芯片式[13]等。商業(yè)化的dPCR平臺也不斷面世，主要有Fluidigm公司的BioMarkTM高通量基因分析系統(tǒng)、Biorad公司的QX100和QX200微滴式dPCR系統(tǒng)、ThermoFisher公司的QuantStudioTM3D dPCR系統(tǒng)、RainDance Technologies公司的RainDropTM dPCR系統(tǒng)和Formulataix公司的ConstellationTM dPCR系統(tǒng)等（圖1）。

在dPCR技術問世后，很快又發(fā)展出了數(shù)字等溫核酸擴增技術（Digital isothermal nucleic acid amplification，dINAA），并已成為dNAD重要的組成部分。與dPCR不同的是，dINAA的實施不依賴熱循環(huán)，只需一個恒定的溫度即可完成數(shù)字化水平擴增。因此，dINAA的誕生使dNAD具備向現(xiàn)場分析或即時診斷（Pointofcare testing，POCT）發(fā)展的可能。但是，從原理上而言，dINAA與dPCR二者無差別，只是將PCR替換成等溫擴增方法?，F(xiàn)有dINAA中，最引人關注的是數(shù)字環(huán)介導等溫擴增技術（Digital loopmediated isothermal amplification，dLAMP），具備簡單、快速、高特異性和高靈敏性的擴增特點[14～17]。除dLAMP外，已報道的dINAA技術還包括數(shù)字多鏈置換擴增技術（Digital multiple strand displacement，dMDA）[18]、數(shù)字等溫超分支滾環(huán)擴增（Digital isothermal hyperbranched rolling circle amplification，dHRCA）[19]、數(shù)字等溫多自配引發(fā)擴增技術（Digital isothermal multipleselfmatchinginitiated amplification，dIMSA）[20]、數(shù)字重組酶擴增技術（Digital recombinant polymerase amplification，dRPA）[21]、數(shù)字等溫滾環(huán)擴增（Digital isothermal rolling circle amplification，dRCA）[22]等。

3 dNAD的原理與優(yōu)勢

從本質(zhì)上說，dNAD與傳統(tǒng)核酸擴增方法的原理相同， 都是對核酸分子進行擴增，達到可被檢測的水平，即反應中熒光信號的產(chǎn)生機理是無差別的，但二者在原理上又存在明顯的不同。首先，dNAD通過將樣本分散到成千上萬個單元中進行大規(guī)模的平行核酸擴增反應，使其具備分析單個核酸分子的能力；其次，dNAD主要在擴增結束后，采集每個反應單元的熒光信號，以“有”或“無”信號的單元個數(shù)來對樣本核酸數(shù)進行定量分析；最后，dNAD無需構建標準曲線，通過直接計數(shù)或泊松分布公式即可對原始樣本的核酸數(shù)進行計算。

利用dNAD進行核酸定量分析，主要包括3個核心步驟（圖2）[5，9，23，24]：（1）原始樣本必須被隨機分配到足夠數(shù)量的反應微單元中，盡可能使得每個單元最多含一個分子；（2）對每個反應微單元的擴增信號進行采集并合理劃分信號閾值，以保證陽性信號與陰性信號單元被精準區(qū)分；（3）檢測熒光并計數(shù)，必要時利用統(tǒng)計學方法對數(shù)據(jù)進行適當?shù)姆治龌蛐拚?。理論上講，如果反應微單元的數(shù)量足夠多（不考慮體積因素）或者被分散的核酸分子足夠少，一個陽性信號的微反應就代表原始樣本中的一個目標核酸分子。但是，在實際工作中， 由于技術障礙，樣本核酸分子很可能并沒有很好地被離散化，使得一個陽性微單元往往含有不止一個分子。因此，dNAD的測量結果需借助統(tǒng)計學方法修正，如泊松分布統(tǒng)計分析。作為一種隨機分布，泊松分布在微單元未達到飽和核酸分子數(shù)前，依然能被利用去逆推原始樣本的核酸分子數(shù)。當然，此時dNAD的測試精度取決于泊松精度，而泊松精度取決于微反應單元的數(shù)量?？傊?，從原理上講，dNAD可以被看成一種具備二進制結果輸出的測量技術，類似于計算機領域的“1”和“0”的區(qū)分。

圖2 dNAD技術的原理示意圖[27，36，55]

Fig.2 Schematic diagram of principle of dNAD[27，36，55]

與實時定量NAD（qNAD）相比，dNAD技術具有明顯的優(yōu)勢[5]。（1）dNAD的準確度高 通過樣本的離散化，極微量的變異分子與正常分子被區(qū)分開來，使得稀有突變基因被單獨檢測，再通過陽性信號單元所占的數(shù)量和比例來精準地計算突變率或突變量。（2）dNAD的靈敏度高 尤其是對低拷貝核酸分子數(shù)的區(qū)分如幾個拷貝，這是qPCR難以達到的。（3）dNAD可實現(xiàn)真正意義上的絕對定量 以陽性信號和陰性信號微單元的數(shù)量及比例來確定原始樣本中目標核酸分子數(shù)，不依賴于CT，也不需建立標準曲線即可進行精確定量。相比之下，qPCR中最高只能分辨1.5倍的CT值差異[25]，且很難制作標準曲線對mRNA的表達量進行絕對定量的。（4）dNAD的擴增不易受抑制劑的影響，即耐受性高 在分散目標分子的同時，反應中的抑制劑也同樣被分散。在較低目標分子情形下，許多反應微單元中是不含目的序列的，卻包含了抑制劑，使得目標分子相對被富集到含低濃度抑制劑的微單元中，從而有效降低了抑制劑對擴增的影響。

4 dNAD的分類與特點

根據(jù)樣本分散化策略的不同，dNAD可分為孔板式dNAD（Platebased dNAD，pdNAD）、液滴式dNAD（Dropletbased dNAD，ddNAD）和芯片式dNAD（Chipbased dNAD，cdNAD）三類。

4.1 孔板式dNAD

孔板式dNAD，就是足夠數(shù)量的同尺寸的微孔陣列排布在平面板塊區(qū)域上以離散化樣本核酸分子，繼而實現(xiàn)數(shù)字化擴增。平板材料包括玻璃、聚苯乙稀、金屬等，微孔的形成常采用刻蝕的方法。文獻報道的孔板式dNAD大多是孔板式dPCR，而孔板式dINAA平臺也很容易被構建。

最早的孔板式dNAD或dPCR系統(tǒng)是采用商業(yè)化的、用于qPCR的96孔板和384孔板，通過對每個反應孔所含的樣品量進行極限稀釋，并增加反應孔數(shù)的方式構建的[8]。這種形式的孔板式dNAD最大的優(yōu)勢在于無須開發(fā)新的裝置，直接采用商業(yè)化的微孔板即可進行，但其分析的靈敏度由于微孔數(shù)有限，無法滿足檢測需求。而且其消耗的試劑量多，分析成本高。為解決這個問題，研究者開發(fā)了其它類型的微孔板。Morrison等[26]選用不銹鋼來制備微孔板。如圖3A所示，在25 mm ×75 mm × 0.3 mm的鋼板上刻蝕了3072個直徑約為320 μm的微孔，每個孔容積約為33 nL。與96孔或384孔板相比，所用試劑體積為原來的1/64，而樣本通量增加了24倍?；谶@一裝置的OpenArrayTM dPCR系統(tǒng)在2009年就被商業(yè)化。然而，隨著微孔數(shù)量的提高、體積從微升向納升轉(zhuǎn)變，如何有效地導入試劑成為此類孔板式dNAD的難題。為解決這一問題，陣列點樣儀、機械臂等附屬設備的使用，大大增加了此類dNAD裝置的成本?？紤]到成本問題，ThermoFisher公司于2013年推出了新一代的QuantStudioTM 3D dPCR系統(tǒng)。該系統(tǒng)同樣采用孔板式dPCR。在一塊10 mm ×10 mm特殊材質(zhì)的平板上刻蝕出高達20000個六角形微孔，每個微孔容積約0.8 nL，彼此可被充分隔離而不串聯(lián)，且只需簡單的涂刷操作即可完成進樣。另外，采用傳統(tǒng)的96或384孔（區(qū)域劃分）設計對提高孔板式dNAD的檢測通量仍有可取性。最近，F(xiàn)ormulataix公司推出的ConstellationTM dPCR系統(tǒng)就采用了傳統(tǒng)96孔區(qū)域劃分，每個區(qū)域內(nèi)含有一個可實現(xiàn)384個和496個微單元反應的微流控芯片，具備操作簡單、通量高的特點。

4.2 液滴式dNAD

液滴式dNAD是通過產(chǎn)生數(shù)以萬計的單分散性微小液滴來分割樣本，即所謂的“液滴化”。目前，微流控領域產(chǎn)生液滴的途徑主要是水動力法，包括T型通道法（Tjunctions）、流動聚焦法（Flow focusing）和共流聚焦法（Coflowing）三類[29]。最常用的材料是聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）。通過對PDMS基底材料的微尺度通道進行等離子體處理來改變通道的親疏水性，再引入互不溶的分散相和連續(xù)相來獲得油包水或水包油液滴。Tanaka等[30]利用PDMS的透氣性和溶氣性的特點成功構建了一種自動產(chǎn)生單分散液滴的新型液滴發(fā)生裝置。為了使液滴更加穩(wěn)定且易收集，Leng等[31]引入了瓊脂，利用其熔點溫度來固化液滴。Schuler等[21]則采用離心力階梯乳化方式來產(chǎn)生單分散液滴，這種方法更為簡單、快速。

目前，對液滴式dPCR和dINAA平臺均有文獻報道。早在2008年，Beer等[32]就利用T型通道法生成皮升級別的油包水液滴，每個液滴中包含了單分子目標核酸、PCR引物、聚合酶和反應緩沖液，實現(xiàn)了單分子水平的數(shù)字擴增。之后，Zhong等[33]采用皮升級液滴和單一熒光建立了多重dPCR平臺，打破了qPCR中一個靶位一種熒光的壁壘。Mazutis等[19]則在可產(chǎn)生約2 pL液滴的微流控裝置上成功構建了液滴式dHRCA。Schuler等[21]開發(fā)了液滴式dRPA平臺，可在30 min內(nèi)對食源性細菌李斯特菌的DNA進行絕對定量分析。

液滴式dNAD最大的優(yōu)勢在于反應微單元數(shù)量的增加相對簡單，在數(shù)據(jù)評估時， 泊松精度相對較高。因此，液滴式dNAD是比較理想的數(shù)字檢測平臺，其商品化程度和市場占有率比其它形式的平臺高，包括QX100、QX200微滴式dPCR系統(tǒng)（BioRad公司）（圖3B）和RainDropTM dPCR系統(tǒng)（RainDance Technologies公司）。

4.3 芯片式dNAD

芯片式dNAD的建立與發(fā)展很大程度上得益于近年來微流控芯片技術的迅猛發(fā)展。微流控芯片成本低、試劑耗量少、分析通量高且具備可實現(xiàn)大規(guī)模平行擴增的能力，利用其來實現(xiàn)數(shù)字化檢測已有十多年的研究歷史。尤其是Unger等[34]在2000年提出的針對PDMS芯片的多層軟蝕刻技術（Multilayer soft lithography， MSL），使高密度的微孔、微泵和微閥結構更容易被構筑，大大加速了芯片式dNAD的研發(fā)。與以上兩類dNAD不同，芯片式dNAD是利用微納尺度的空間結構形成一個個微小反應單元的，其主要裝置材料是PDMS。常見的芯片式dNAD類型主要有集成流路（Integrated fluidic circuit，IFC）芯片型[28，35]、滑動芯片（SlipChip）型[11]、自吸分液（Selfpriming compartmentalization，SPC）芯片型[13]、自我數(shù)字化（Selfdigitization，SD）芯片型[15]等。

IFC芯片利用PDMS材料的高彈性特點，通過采用MSL技術加工形成的大規(guī)模交織的液體和氣體通道，借助高密度微泵微閥來控制流路與氣路，可以快速準確地將含有目標分子的反應混合液分割成數(shù)以千計的獨立微單元[24，36]。這項技術由Ottesen等[35]在2006年首次實施，無需借助陣列點樣儀或者機械臂即可完成1176個微單元陣列的構建。基于IFC芯片的dPCR系統(tǒng)是最早被商業(yè)化的數(shù)字檢測平臺，如由Fluidigm公司推出的BioMark HD 和EP1 檢測系統(tǒng)。為了提高微單元的集成數(shù)量，Heyries等[28]開發(fā)了一種百萬像素級別IFC型芯片（圖3C）。該芯片可一次性形成106個微小單元，使每個單元的體積降至pL級，且單元密度達到44000個/mm2，是真正具備高密度、高通量的IFC芯片。Men等[9]則基于IFC芯片原理于2012年利用PDMS材料構建了fL級別數(shù)字PCR檢測芯片，微單元的密度超過2000個/mm2，只需不足4 μL的試劑即可填充整個芯片，大大降低了試劑的消耗。在以IFC芯片構建dINAA平臺方面，Blainey等[18]建立了IFC芯片型dMDA平臺。雖然IFC芯片型dNAD具備實現(xiàn)高通量檢測的能力，但其對附屬設備如微泵微閥的控制裝置的依賴性強，使用不便。

Shen等[11]在2010年首次報道了lipChip芯片式dNAD（圖3D）。該芯片的基底材料是玻璃， 上下兩塊玻璃均刻有反應微單元，在油相密封環(huán)境下緊密貼合。未滑動前，反應微單元彼此部分重疊， 形成微通道，供液體進樣。待進樣完全，滑動玻璃片打破微通道而形成微單元陣列，繼而實現(xiàn)數(shù)字化檢測，整個過程簡單、快速。而基于SlipChip的dPCR、dLAMP和dRPA裝置平臺也相繼被開發(fā)出來[11，18，37]。

SPC芯片實現(xiàn)dNAD則是利用了PDMS材料的溶氣性（Gas solubility）特點 [13，16，20]，其結構如圖3E所示。真空脫氣時，SPC芯片中整個微型結構區(qū)域內(nèi)由于PDMS的溶氣性變成負壓，其可充當引導液體進入微腔室的動力源。當依次導入水相（擴增液）和油相（密封液），并根據(jù)微腔室數(shù)量控制好水相體積時，無需任何附屬設備或微泵微閥結構即可實現(xiàn)擴增液體的離散化。

Gansen等[15]制備了SD芯片并應用于dLAMP（圖3F）。該芯片利用了流體壓力與表面張力之間的相互作用實現(xiàn)液體的自我分散。芯片在導入水相前預先充盈油相，當注入水相時， 液體會在微腔室內(nèi)繼分散， 形成個乳化液滴。由于整個過程是基于液體固有性質(zhì)實現(xiàn)的，故進樣無需任何外界控制裝置。但是，隨著水相液體不斷分散，其液滴體積逐漸變小，以至于不能充盈整個微腔。當然，這種情況可以通過耗損部分試劑使每個微腔充盈來彌補。

5 dNAD的應用

相對于傳統(tǒng)核酸檢測技術而言，dNAD可實現(xiàn)對核酸分子的高靈敏度、高精準度、高耐受性的絕對定量分析。目前， dNAD已被應用到生命科學及相關領域中，如病原微生物的檢測、食品安全、臨床診斷（癌癥超早期診斷和產(chǎn)前診斷）和基因組學研究等。

5.1 病原微生物的檢測

dNAD技術已成為目前病原微生物檢測手段中最靈敏的技術之一，可提供準確的疫情和產(chǎn)品評估數(shù)據(jù)。董蓮華等[38]針對大腸桿菌O157：H7建立了液滴式dPCR檢測方法。該方法的定量動態(tài)范圍廣（每20 μL反應液中4～1.25×105拷貝），且精密度高、特異性強，對實際樣本的檢測結果與qPCR一致。Kelley等[39]采用TaqMan探針建立了針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的多重液滴式dPCR檢測方法，對397份臨床樣本的檢測結果表明，dPCR方法與傳統(tǒng)qPCR測試結果一致。Strain等[40]的研究結果表明，液滴式dPCR可以作為HIV病毒DNA的精確的檢測方法，且靈敏度高、重復性好。由于dNAD利用的是樣本離散化策略，因此建立無核酸提取的病原檢測方法也是其應用方向之一。Pavi等[41]分別采用QX100液滴式dPCR系統(tǒng)和Biomark HD IFC芯片式dPCR系統(tǒng)建立針對人巨細胞病毒的無核酸提取檢測方法，其檢測結果與提取后的方法完全一致。此外，dNAD的高靈敏度同樣也可被應用到與病原微生物相關的研究中，如抗HIV病毒治療評估[42]、HIV和HCV病毒耐藥突變檢測[43]以及環(huán)境微生物基因水平的連鎖分析[44]等。

5.2 食品安全監(jiān)測

食品安全檢測主要涉及兩方面： 一是食源性微生物的檢測；二是轉(zhuǎn)基因成分的鑒定。現(xiàn)有的食品安全監(jiān)測中，最常用的技術手段是qPCR，需構建標準曲線來定量。而dNAD方法無需標準物質(zhì)以及標準曲線，大大降低了工作強度。Fu等[45]采用BioMark HD IFC芯片式dPCR系統(tǒng)成功建立了針對CaMV35s啟動子和NOS終止子轉(zhuǎn)基因成分的鑒定，結果表明， 該dPCR能鑒別含量低至0.1%的轉(zhuǎn)基因成分，低于歐盟的限定標準。Dalmira等[46]則采用液滴式dPCR系統(tǒng)來鑒別玉米的轉(zhuǎn)基因成分，檢測限低至0.08%。Cao等[47]和CoudrayMeunier等[48]則分別采用液滴式dPCR和芯片式dPCR系統(tǒng)，對水源微生物腸球菌和諾如病毒（NoV）進行檢測和監(jiān)控，結果精準、可靠。Floren等[49]和Tian等[50]則針對食物摻假問題， 采用dNAD平臺進行食品檢測。

5.3 臨床診斷

臨床診斷是dNAD技術的主要應用領域， 它涉及范圍廣，如個體化醫(yī)療應用（無創(chuàng)或微創(chuàng)癌癥超早期分子診斷）、產(chǎn)檢診斷等。眾所周知，臨床樣本如血液、尿液、糞便等包含著很多無關核酸序列和反應抑制劑。常規(guī)的qPCR在進行分子診斷時， 很容易出現(xiàn)偏好擴增或擴增受抑制的現(xiàn)象，而dNAD技術具備強的耐受性，能有效降低無關核酸序列對擴增的干擾，實現(xiàn)對標記物的精確檢測。

開展無創(chuàng)或微創(chuàng)癌癥超早期分子診斷是人性化醫(yī)療未來發(fā)展的趨勢，也使得基于dNAD平臺的第三方醫(yī)學診斷技術日趨成熟。目前的研究熱點包括針對肺癌相關的EGFR、BRAF和KARS基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）突變檢測[51～54]、慢性骨髓白血病ABL酪氨酸激酶結構域位點突變檢測[55]、乳腺癌的HER2基因表達水平檢測[56，57]以及原癌基因調(diào)控區(qū)甲基化水平的檢測等[58～60]。Zhu等[13]采用SPC芯片式dPCR對3種與肺癌相關基因（PLAU，ENO2和PLAT）的mRNA表達水平進行檢測，其結果與qPCR檢測結果相當。Weisenberger等[58]基于IFC芯片式dPCR系統(tǒng)對乳腺癌相關的CpG基因島甲基化水平進行了系統(tǒng)的研究，其結果表明dNAD平臺可實現(xiàn)單分子水平的甲基化診斷。

與傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法相比，dNAD無需活檢穿刺，只需對游離胎兒DNA（Cellfree fetal DNA，cffDNA）進行相關分子檢測即可預知孕情或胎兒狀況。Gu等[61]采用QX100液滴式dPCR系統(tǒng)對cffDNA進行分析，以評估遺傳性甲基丙二酸血癥的風險。Barrett等[62]則采用Biomark HD IFC芯片式dPCR裝置來評估胎兒鐮狀細胞性貧血癥分型。

5.4 基因組學研究

在基因組學研究中，dNAD技術的作用就是對通過NGS、微陣列雜交或全基因組關聯(lián)分析研究等手段獲取的海量基因組信息的“情報”確認，充當著“放大鏡”的角色。此外，dNAD技術還可用于NGS的文庫構建和結果校正[63，64]。

拷貝數(shù)變異（CNV）是基因組學研究的主要內(nèi)容，而dNAD技術在CNV檢測上有著獨特的優(yōu)勢。dNAD可直接獲取目標基因的絕對拷貝數(shù)，提供準確的數(shù)據(jù)，這是其它技術（如NGS）所難達到的，且成本低、通量高。對于低豐度的CNV，dNAD的檢測限（低至0.001%）大大低于qPCR（一般為10%）和NGS（一般為1%）。Boettger等[65]應用液滴式dPCR系統(tǒng)來分析和評估人類基因組1區(qū)17q21.31基因座內(nèi)的復雜CNV和SNP現(xiàn)象，以研究父母系與后代之間基因組的關聯(lián)性。Fu等[66]構建了液滴式數(shù)字全基因組擴增技術（dWGA）， 實現(xiàn)單細胞水平的基因組測序，該方法在分析CNV和SNP時擴增均一性和結果精準度明顯提高。

6 總結與展望

dNAD技術是一種高靈敏度、高準確度、高辨識力、高耐受性、可實現(xiàn)絕對定量分析的核酸分子診斷技術，是現(xiàn)有核酸診斷技術的補充與飛躍，其所具備的應用優(yōu)勢必將大大推動生物學研究、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測等領域的發(fā)展。同時，它也預示著一個擁有巨大潛能的新興產(chǎn)業(yè)和技術。然而，目前的dNAD技術仍處于待完善階段，還存在許多不足之處。首先，現(xiàn)有dNAD裝置的集成度不高，如Biorad的QX100液滴式dPCR系統(tǒng)由液滴發(fā)生器、PCR擴增儀和液滴信號讀取器3種設備配套組成，儀器成本高，一般的實驗室難以承受。已有研究團隊[50，67]嘗試將細胞核酸提取、純化功能與dNAD結合集成到微流控芯片上， 構建多功能數(shù)字化檢測平臺，但是目前尚無成型商品。其次，當dNAD的通量增高或者微單元體積縮小時，現(xiàn)有信號采集的方法難以做到簡便、快捷、準確，常需要后期繁瑣的信號處理與分析過程。此外，dNAD仍受到常規(guī)核酸擴增法所面臨的擴增效率問題的影響，即表現(xiàn)為如何保證微單元的反應效率或優(yōu)化微反應體系。最后，現(xiàn)有dNAD技術難以真正實現(xiàn)現(xiàn)場檢測或POCT。隨著dNAD的不斷發(fā)展，這些問題必定會得到有效解決?？傊?，基于微納尺度流體控制的dNAD技術為實現(xiàn)高靈敏、高精度的核酸單分子水平分析提供了全新的思路和手段，未來有望成為新的“金標準”技術。

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Research and Application Progress of Digital Nucleic Acid

Amplification Detection Techniques

DING Xiong1，2， MU Ying*1

1（Research Center for Analytical Instrumentation， State Key Laboratory of Industrial Control Technology，

Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

2（College of Life Sciences， Hangzhou， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

Abstract Recently， micro/nanoscaled fluidic control technologies have been developed to be the alternative to traditional analysis approaches over several decades due to the capability of realizing miniaturized multiphase and multistep reactions. The perfect combination of these techniques and nucleic acid amplification methods effectively promoted the establishment and development of digital nucleic acid detection （dNAD） techniques. As a singlemolecule analysis approach， dNAD played an essential role in molecular diagnosis. In this paper， the research and application progress of dNAD techniques were reviewed， including the development history， principle， superiority， and the future prospects of dNAD.

Keywords Micro/nanoscal； Microfluidics； Digital nucleic acid amplification detection； Digital polymerase chain reaction； Fluidic control； Review

（Received 23 February 2016； accepted 18 March 2016）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 31270907，31070772）