高效液相色譜法測定去叔丁基杯[6]芳烴的含量

楊代曉　潘秀頡　朱茂祥

[摘 要] 目的：建立測定去叔丁基杯[6]芳烴含量的高效液相色譜方法。方法：采用 Diamonsil C18色譜柱色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 um）；流動(dòng)相為甲醇（加入0.1%三氟乙酸）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為206 nm；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL。結(jié)果：去叔丁基杯[6]芳烴主峰分離良好，HPLC 測定的線性范圍為10.0 ～60.0 μg/mL（r=0.9998），該方法在儀器精密度、日內(nèi)精密度、日間精密度以及重復(fù)性方面 RSD 均在 2% 以下。結(jié)論：用高效液相色譜法對(duì)去叔丁基杯[6]芳烴進(jìn)行含量測定，方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

[關(guān)鍵詞] 杯芳烴；去叔丁基杯[6]芳烴；含量測定；高效液相色譜法

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：2095-5200（2016）05-075-03

DOI：10.11876/mimt201605028

杯芳烴（calixarene）是一類新型的大環(huán)多聚體，因其結(jié)構(gòu)像酒杯而得名，該化合物在1942年首次由奧地利的金克（Zinke）合成[1]。杯芳烴可以形成主-客復(fù)合物，“空腔”的大小可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)節(jié)，是比冠醚和環(huán)糊精應(yīng)用更加廣泛、適應(yīng)性更好的主體化合物[2-3]。其中以杯[4]芳烴、杯[6]芳烴和杯[8]芳烴最為常見，在堿性條件下對(duì)叔丁基苯酚與甲醛縮合成為大環(huán)的化合物，按照苯酚單元的個(gè)數(shù)命名為杯[n]芳烴。杯芳烴有多方面重要應(yīng)用價(jià)值，比在生物模擬酶、電活性LB膜等方面的應(yīng)用，并且在色譜、催化反應(yīng)等領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛[4]。從杯[6]出發(fā)合成多種杯芳烴衍生物，去叔丁基杯芳烴是合成各種杯芳烴衍生物的中間體，對(duì)這種中間體進(jìn)行含量測定可以為合成產(chǎn)物提供質(zhì)量控制方法[5-6]。本文對(duì)中間體去叔丁基杯[6]芳烴采用高效液相色譜法進(jìn)行含量的測定，并對(duì)測定方法結(jié)果的精密度、重現(xiàn)性等進(jìn)行研究。

1 儀器與試劑

Waters2695/2996 高效液相色譜儀（DAD檢測器），自動(dòng)進(jìn)樣器（EMPOWER數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；BP211D型電子天平（德國SARTORIUS）；溶劑過濾器；甲醇、乙腈（禹王試劑提供的色譜純）；三氟乙酸由江蘇康泰氟化工有限公司提供。對(duì)照品（批號(hào)：20141109）由北京精華耀邦醫(yī)藥科技有限公司提供，供試品（批號(hào)20151026）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所提供。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Diamonsil C18 （250 mm × 4.6 mm，5 um）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇（加入0.1%三氟乙酸）；檢測波長為 206 nm；流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣體積為 20 ?L；柱溫 40 ℃。

2.2 溶液的制備

精密稱定10 mg的供試品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液。精密移取儲(chǔ)備液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為50 ?g/mL的供試品溶液。精密稱定10 mg的對(duì)照品，同法操作，取供試品與對(duì)照品溶液各 20 ?L注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖，空白溶液以及去叔丁基杯[6]芳烴色譜圖見圖 1。

去叔丁基杯[6]芳烴主峰保留時(shí)間為7.3 min，主峰與雜質(zhì)能較好分離（分離度均大于1.5），理論塔板數(shù)不低于6000，該峰的純度角小于純度閾值，表明在該條件下色譜行為良好，峰為單一峰。見圖 2。

3 專屬性考察

3.1 檢測限、定量限

精密稱定對(duì)照品適量，用甲醇：乙腈=70：30溶液逐步稀釋。將檢測限定為信噪比（3：1） 時(shí)的進(jìn)樣量，將信噪比為 10：1 時(shí)的進(jìn)樣量作為定量限。測得檢測限為 10 ng，定量限為30 ng。

3.2 線性范圍

精密稱定10 mg的對(duì)照品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密移取儲(chǔ)備液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為10 ?g/mL、20 ?g/mL、30 ?g/mL、40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL的溶液。濾過（0.22 um微孔濾膜），取20 ?L續(xù)濾液注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。對(duì)結(jié)果進(jìn)行線性回歸，x軸為進(jìn)樣濃度?g/mL，y 軸為峰面積A，通過計(jì)算得到回歸方程是：y=123583.3x-794661.9，r=0.9998（n=6）。供試品實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在10 ?g/mL-60 ?g/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

取上述線性范圍項(xiàng)下50 ?g/mL溶液20 ?L，連續(xù)進(jìn)樣6次，注入高效液相色譜儀，峰面積RSD低于2.0%，儀器有良好的精密度。

3.4 方法精密度實(shí)驗(yàn)

取上述線性范圍項(xiàng)下40 ?g/mL、50 ?g/mL、60 ?g/mL溶液，相當(dāng)于含量測定供試品溶液濃度的80%、100%、120%，分別于配制0h、5h、10h后進(jìn)樣，考察日內(nèi)精密度；分別于配制24h、48h、72h后進(jìn)樣，考察日間精密度，均注入高效液相色譜儀20 ?L。供試品實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：日內(nèi)精密度的RSD低于2.0%、日間精密度的RSD低于2.0%，樣品溶液在三天內(nèi)比較穩(wěn)定。

3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別精密稱定供試品4 mg、5 mg、6 mg，各三份，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，相當(dāng)于含量測定供試品溶液濃度的80%、100%、120%，均注入高效液相色譜儀20 ?L，記錄色譜圖。高、中、低濃度的樣品所測含量RSD結(jié)果均小低于2.0%，方法有良好的重復(fù)性。

3.6 樣品含量測定

精密稱定10 mg供試品，置100 mL量瓶中，加甲醇：乙腈=70：30溶液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作儲(chǔ)備溶液。精密移取5.0 mL儲(chǔ)備溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為50 ?g/mL的供試品溶液。精密稱定10 mg對(duì)照品，同法操作，注入高效液相色譜儀各20 ?L 的供試品與對(duì)照品溶液，記錄色譜圖，按峰面積計(jì)算去叔丁基杯[6]芳烴含量。結(jié)果樣品含量為94.9%。

4 討論

4.1 波長的選擇

供試品溶解加甲醇：乙腈=70：30溶解，在紫外區(qū) 200nm～380nm間進(jìn)行掃描，測得最大吸收波長為206 nm；溶劑干擾峰在該波長處出現(xiàn)的較靠前，對(duì)樣品主峰的測定沒有影響，所以最終選擇206 nm作為檢測波長。見圖3。

4.2 流動(dòng)相溶劑的優(yōu)化

在色譜條件中流動(dòng)相作為重要的參數(shù)，直接影響到樣品的分離，去叔丁基杯[6]芳烴有“空穴”結(jié)構(gòu)，且其分子結(jié)構(gòu)式中沒有帶電荷以及極性強(qiáng)的基團(tuán)性質(zhì)，決定了其不溶于水溶液，而溶于有機(jī)溶劑中[7]。所以實(shí)驗(yàn)通過對(duì)甲醇、乙腈、甲醇：乙腈以及加入不同比例的三氟乙酸、乙酸等多種流動(dòng)相對(duì)樣品的測定進(jìn)行考察分離效果，表明不加酸時(shí)主峰對(duì)稱性差且保留時(shí)間，峰型不好，最后選擇了甲醇（加入0.1%三氟乙酸）為流動(dòng)相，容易洗脫，不僅出峰時(shí)間適宜，分離度以及對(duì)稱性均較好，理論塔板數(shù)高，可以改善峰型。

4.3 柱溫的考察

取“3.6”項(xiàng)下濃度為 50 ?g/mL 的對(duì)照品溶液 20 ?L 注入液相色譜儀，考察 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的柱溫，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同的溫度中各物質(zhì)均能較好的分離，柱效、分離度、對(duì)稱性差別不大?？紤]到柱壓對(duì)柱子的影響，選用40 ℃作為色譜柱的柱溫。

5 結(jié)論

杯芳烴結(jié)構(gòu)獨(dú)特，含有疏水性基團(tuán)，可以與苯環(huán)連在一起構(gòu)成一個(gè)疏水性的杯狀空腔，與中性有機(jī)分子形成主-客體化合物，環(huán)上還有親水性的酚羥基整齊排列在一起，可以鰲合、輸送離子型化合物，改變苯酚單元的數(shù)目、改變橋聯(lián)基等都可以改變化合物的性質(zhì)，得到不同功能的杯芳烴[8]。去叔丁基杯[6]芳烴在去掉了疏水性的叔丁基后，極性變強(qiáng)，在反相色譜柱上更易于洗脫，研究去叔丁基杯[6]芳烴，有利于其在色譜領(lǐng)域的應(yīng)用[9]。本實(shí)驗(yàn)通過用HPLC對(duì)其定量研究，且經(jīng)方法學(xué)研究結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可為去叔丁基杯[6]芳烴的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供可靠的依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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