嬰幼兒配方粉中?；撬岬那疤幚韮?yōu)化及氨基酸分析儀分析

劉旭輝　劉螢　張姍

[摘 要] 對(duì)奶粉中牛磺酸的前處理方法、流動(dòng)相比例和柱溫箱溫度對(duì)氨基酸分析儀測(cè)定奶粉中牛磺酸的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明，乙醇沉淀蛋白法能夠更好地提取奶粉中牛磺酸；柱溫25℃的條件下，用75%pH4.20檸檬酸鋰緩沖液B和25%pH8.00檸檬酸鋰緩沖液C作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫提取?；撬?，為氨基酸分析儀測(cè)定奶粉中?；撬彷^優(yōu)條件。建立的氨基酸分析儀測(cè)定方法，該方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.62%，回收率為99.6%～101.5%，準(zhǔn)確而靈敏，適合嬰幼兒配方奶粉中牛磺酸的分析。

[關(guān)鍵詞] 牛磺酸；氨基酸分析儀；分離度

中圖分類號(hào)：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2016）05-092-03

DOI：10.11876/mimt201605034

牛磺酸（Taurine）是一種含硫的β-氨基乙磺酸[1]。作為生理營(yíng)養(yǎng)的活性物質(zhì)，對(duì)人體起著十分重要的生理調(diào)節(jié)作用[2]，尤其在促進(jìn)嬰幼兒大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，增強(qiáng)心血管功能以及鈣吸收等方面作用突出[3]，是嬰幼兒食品重要的營(yíng)養(yǎng)添加劑。

目前測(cè)定?；撬岬闹饕椒ㄓ蟹止夤舛确╗4-5]、熒光吸光光度法[6]、高效液相色譜法[7-9]、衍生化高效液相色譜法[10]、自動(dòng)電位滴定法[11]、傅立葉變換紅外線光譜法[12]等，這些方法操作煩瑣，操作要求高，比如液相色譜法儀器投入大，分析時(shí)間長(zhǎng)；柱前衍生法靈敏度高，但操作條件要求高，干擾比較大；分光光度法樣品必須通過(guò)離子交換柱純化后才能測(cè)定?，F(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.26-2010[13]《嬰幼兒食品和乳品中牛磺酸的測(cè)定》采用的是高效液相色譜法，其中OPA柱后衍生和單磺酰氯柱前衍生法都需要復(fù)雜的衍生步驟。

本研究建立了嬰幼兒奶粉中?；撬釡y(cè)定的氨基酸分析儀測(cè)定方法，樣品經(jīng)乙醇沉淀蛋白進(jìn)行提取，前處理簡(jiǎn)單，快速，可用于嬰幼兒奶粉中牛磺酸的快速定性定量檢測(cè)，為保證嬰幼兒乳品安全提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

嬰幼兒配方奶粉：市售，購(gòu)于北京京客隆超市。

S-433D型氨基酸分析儀：德國(guó)Sykam公司，配有帶電子制冷功能的溶液存放單元s7130，帶電子恒溫的自動(dòng)進(jìn)樣器s5200，含雙波長(zhǎng)檢測(cè)器的反應(yīng)單元s4300，內(nèi)置在線真空脫氣機(jī)的四元梯度輸液?jiǎn)卧?；s21003K15型離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；N-EVAP 116型氮吹儀，美國(guó)Organomation 公司；天平：感量為 0.1mg，德國(guó)Sartorius公司。

1.2 試劑和耗材

緩沖液A： pH 2.90檸檬酸鋰緩沖液；緩沖液B： pH4.20檸檬酸鋰緩沖液；緩沖液C： pH8.00檸檬酸鋰緩沖液；再生液D： 檸檬酸鋰緩沖液；樣品稀釋液：pH 2.20檸檬酸鋰緩沖液、茚三酮溶液均購(gòu)于北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司。濃鹽酸、無(wú)水乙醇、磺基水楊酸固體、異丙醇、甲醇均購(gòu)于北京中科三環(huán)有限公司。異丙醇和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。玻璃帶塞水解管購(gòu)于北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司。

1.3 奶粉前處理方法

1.3.1 酸水解法 稱取一定量樣品，精確到0.0001g，（使樣品蛋白質(zhì)含量在10～20mg范圍內(nèi)）放于水解管內(nèi)。水解管加6mol/L鹽酸10mL，使奶粉全部溶解，搖勻。氮吹10～20s后，立即蓋緊瓶蓋。于110℃恒溫干燥箱內(nèi)放置水解22h，取出后漩渦振搖，冷卻后，在6000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min。取上清液0.5mL，氮吹至完全干燥，加2mL樣品稀釋液復(fù)溶，經(jīng)0.45μm微孔膜過(guò)濾，供儀器測(cè)定使用。

1.3.2 蛋白沉淀法 稱取樣品約1.0000g，用0.2%鹽酸溶解樣品，并定容到10mL，使奶粉全部溶解。取2mL溶解后的試樣于10mL容量瓶中，加入無(wú)水乙醇（或磺基水楊酸）定容至刻度，靜置30min，取樣液約2mL放在2mL離心管中，在10000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min。取上清液1mL，氮吹至完全干燥，加1mL樣品稀釋液復(fù)溶，經(jīng)0.45μm微孔膜過(guò)濾，供儀器測(cè)定使用。

1.4 氨基酸儀測(cè)定條件

色譜柱：Sykam LCA K 07/Li，150×4.6mm，LCA K

05/Li，100×4.6mm。流動(dòng)相：75%緩沖液B和25%緩沖液C。流速：0.4mL/min。柱溫：25℃。進(jìn)樣量：50μL。衍生試劑：茚三酮試劑，流速0.25mL/min。沖洗柱子試劑：再生液D，流速0.4mL/min。?；撬嶙畲笪詹ㄩL(zhǎng)在570nm處。

通過(guò)改變洗脫條件和柱溫箱溫度測(cè)試?；撬岬姆蛛x度。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

用鹽酸水解法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試，有雜質(zhì)峰干擾，分離度較??；已有采用鹽酸水解法提取食品中?；撬岬膱?bào)道[14]，但在本文的研究中，此方法不適用于奶粉樣品的提取。溶解后的樣品加入磺基水楊酸沉淀蛋白，蛋白質(zhì)并不能被完全沉淀，呈絮狀；溶解后的樣品加入乙醇沉淀蛋白后，取出再加入磺基水楊酸進(jìn)一步沉淀蛋白（乙醇和磺基水楊酸沉淀蛋白法），?；撬岱迮c雜質(zhì)峰不能很好分離；溶解后的樣品加入磺基水楊酸沉淀蛋白后，取出再加入乙醇進(jìn)一步沉淀蛋白（磺基水楊酸和乙醇沉淀蛋白法），使得?；撬岱迮c雜質(zhì)峰分離度有所提高；而用乙醇沉淀蛋白法提取?；撬?，分離度可達(dá)1.24，能夠完全滿足定量分析的需要。對(duì)樣品進(jìn)行回收測(cè)試，各前處理方法的回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)。表1為不同前處理方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，圖1為不同前處理方法測(cè)定?；撬嵘V圖。

不同的前處理方法對(duì)回收率沒(méi)有太大影響。蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，在酸性環(huán)境中帶正電荷，而磺基水楊酸根帶負(fù)電，可與蛋白質(zhì)結(jié)合沉淀，磺基水楊酸正好使液體呈酸性，促使二者結(jié)合，但磺基水楊酸沉淀效果不理想，多用于沉淀微量蛋白；而乙醇沉淀蛋白法，則是利用乙醇有機(jī)相能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，導(dǎo)致蛋白變性而沉淀，效果比較理想。

2.2 流動(dòng)相比例的選擇

通過(guò)改變洗脫條件進(jìn)行比較，選用100%緩沖液A進(jìn)行洗脫，雜質(zhì)峰與?；撬岱宸蛛x度小于1；選用100%緩沖液B進(jìn)行洗脫，雜質(zhì)峰與?；撬岱宸蛛x度最高達(dá)到1.07；選用80%緩沖液B和20%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，雜質(zhì)峰與?；撬岱宸蛛x度最高達(dá)到1.17，分離均不理想；選用75%緩沖液B和25%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，雜質(zhì)峰與牛磺酸峰分離度最高可達(dá)到1.24，分離度達(dá)到理想值。對(duì)樣品進(jìn)行回收測(cè)試，回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)，不同流動(dòng)相洗脫比例對(duì)回收率沒(méi)有影響。

緩沖液A液pH為2.90，緩沖液B液pH為4.20，緩沖液C液pH為8.00，由此可得出，用pH比A液偏中性的75%緩沖液B和偏堿性25%緩沖液C一起洗脫，?；撬岱迮c雜質(zhì)峰分離度達(dá)到最好。前處理過(guò)程中，氮吹至干后，復(fù)溶液選用中性的水比選用酸性的樣品稀釋液作為復(fù)溶液更好。表2為不同流動(dòng)相對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，圖2為不同流動(dòng)相洗脫后色譜圖。

2.3 柱溫箱溫度的選擇

柱溫箱溫度調(diào)節(jié)為37℃時(shí)，用100%緩沖液A進(jìn)行洗脫，有雜質(zhì)峰干擾，分離度較??；溫度調(diào)節(jié)為60℃時(shí)，用100%緩沖液A進(jìn)行洗脫，?；撬崤c雜質(zhì)峰不分離；溫度為37℃時(shí)，用75%緩沖液B和25%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，有雜質(zhì)峰干擾，分離度不理想；而柱溫箱溫度為25℃時(shí)，用75%緩沖液B和25%緩沖液C進(jìn)行梯度洗脫，分離度可達(dá)1.24；對(duì)樣品進(jìn)行回收測(cè)試，回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)，不同柱溫對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定對(duì)回收率沒(méi)有影響。

通過(guò)改變柱溫箱溫度，得出溫度變化對(duì)?；撬岢龇鍟r(shí)間影響不大，而對(duì)于雜質(zhì)峰，溫度低出峰時(shí)間前移，可與?；撬岱宸蛛x，實(shí)驗(yàn)得出溫度在25℃時(shí)分離效果最好。表3為柱溫箱柱溫改變對(duì)分離度的影響，圖3為柱溫改變后的色譜圖。

2.4 線性范圍與檢出線

精確吸取?；撬針?biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.5mL分別加入到10mL容量瓶中，用水定容，進(jìn)行分析。以響應(yīng)（峰面積）為Y，濃度為X，繪制線形圖。線形方程： Y=287572.52339×X+104.14317。相關(guān)系數(shù)R2=0.9999910。

2.5 精密度

儀器精密度：配置牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10mg/L，重復(fù)測(cè)定，計(jì)算峰面積的RSD（n=6）為0.39%。

實(shí)驗(yàn)方法精密度：取一定量奶粉樣品，按乙醇沉淀蛋白法測(cè)試?；撬岷浚貜?fù)測(cè)定，其測(cè)定結(jié)果的RSD（n=6）為0.50%。

2.6 加標(biāo)回收率

取奶粉樣品按照乙醇沉淀蛋白法進(jìn)行?；撬岷康臏y(cè)試，再在樣品中加入?；撬針?biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試其回收率，回收率為99.6%～101.5%。

3 結(jié)論與討論

牛磺酸可與茚三酮試劑反應(yīng)，利用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)出其含量。通過(guò)改變前處理過(guò)程、改變儀器洗脫條件和柱溫箱的溫度，得出儀器洗脫梯度用比緩沖液A液偏中性的75%緩沖液B+25%緩沖液C作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，溫度在25℃時(shí)，?；撬岬姆蛛x提取最好。

本文建立的乙醇沉淀蛋白用氨基酸分析儀檢測(cè)方法，適用于嬰幼兒配方粉中牛磺酸的定性定量檢測(cè)。結(jié)果表明本方法前處理簡(jiǎn)單、分析速度快、準(zhǔn)確度和靈敏度較高，可作為嬰幼兒配方粉監(jiān)測(cè)手段，為保證我國(guó)嬰幼兒乳制品的安全提供技術(shù)保障。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 徐潔，錢(qián)愛(ài)萍，潘薇，等.動(dòng)植物產(chǎn)品中?；撬岷繙y(cè)定的前處理方法[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22（9）：431-433.

[2] 劉輝，徐金蘭.?；撬嵫芯窟M(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)婦幼保健分冊(cè)，2002，12（3）：40-41.

[3] 何麗華，申曉輝.食品中?；撬釋?duì)人體的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003，30（1）： 68-70.

[4] 楊涓，魏智清，龐偉.分光光度法測(cè)定寧夏枸杞中?；撬岬暮縖J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2005，26（2）：28-30.

[5] 李珊，劉玉蘭，林伯群，等.吸光光度法測(cè)定牡蠣中?；撬醄J].青島醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998（4）：44-45.

[6] 李珊，劉玉蘭.熒光法測(cè)定食物中?；撬醄J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2001，37（2）：80-81.

[7] 金鳳明，李桂貞，施超歐.復(fù)合氨基酸中?；撬岬母咝б合嗌V分析[J].石油化工高等學(xué)校學(xué)報(bào)，2000，13（3）：46-49.

[8] 張晾，耿越，張靜靜，等.高效液相色譜法快速測(cè)定海產(chǎn)品中?；撬醄J].食品與藥品，2006，8（4）：56-58.

[9] 陳申如，胡陽(yáng)，倪輝，等.高效液相色譜法測(cè)定牡蠣中牛磺酸含量[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13（2）：193-198.

[10] 任一平，黃百芬.應(yīng)用OPA柱前衍生法測(cè)定食品中的?；撬醄J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1995，21（1）：43-48.

[11] 張彤，山廣志，陳思.自動(dòng)電位滴定法測(cè)定?；撬岷縖J].首都醫(yī)藥，2009，16（10）：63-64.

[12] TRIEBEL S，SPROLL C，REUSCH H，et al.Rapid analysis of taurine in energy drinks using amino acid analyzer and Fourier transform infrared （FTIR） spectroscopy as basis for toxicological evaluation[J].Amino Acids，2007，33（3）：451-457.

[13] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 5413.26-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中?；撬岬臏y(cè)定[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[14] 王洪健，周興起，馮志強(qiáng)，等.氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定食品中?；撬岬姆椒ńJ].現(xiàn)代食品科技，2012，28（3）：348-350.