RP-HPLC法測(cè)定迷迭香藥材中鼠尾草酸

?李　海，李鵬輝，黃惠華，李佳銀?

（1.華南理工大學(xué)，廣東　廣州　510641；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南　長(zhǎng)沙　410128；3.湖南三福生物科技有限公司，湖南　長(zhǎng)沙　410100）

RP-HPLC法測(cè)定迷迭香藥材中鼠尾草酸

李海1，李鵬輝2，黃惠華1，李佳銀3

（1.華南理工大學(xué)，廣東廣州510641；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410128；3.湖南三福生物科技有限公司，湖南長(zhǎng)沙410100）

為建立高效液相色譜法測(cè)定迷迭香中鼠尾草酸含量的方法，以乙腈-0.1%磷酸水（60∶40）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫30℃，等度洗脫，流速為1.0 mL/min。結(jié)果顯示，鼠尾草酸在0.277 2～1.016 4 mg/mL范圍具有良好的線性關(guān)系（R2=0.999 92），回收率為97.56%。該方法快速、靈敏、準(zhǔn)確，目標(biāo)峰分離度良好，可為迷迭香藥材以及提取物的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

高效液相色譜；迷迭香；鼠尾草酸

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.），別名艾菊，系唇形科迷迭香（Rosmarinus）屬植物[1]，味辛、性溫，原產(chǎn)于歐洲、北非以及地中海等地區(qū)，在中國(guó)云南、貴州和新疆等地有廣泛種植[2-3]。現(xiàn)代研究表明，鼠尾草酸（Carnosic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)CA）是迷迭香中抗氧化能力最強(qiáng)的活性成分[4-5]，含量一般在2.2%～3.1%[4-5]，作為一種安全無(wú)毒副作用的高效純天然抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于化妝品、各種植物油脂、肉制品、調(diào)味品、油炸食品、烘培食品等領(lǐng)域[6-7]，具有極大的市場(chǎng)需求和潛力，預(yù)計(jì)到2020年，迷迭香提取物市場(chǎng)需求將突破1萬(wàn)t。因此，建立高效、穩(wěn)定、可靠的迷迭香鼠尾草酸檢測(cè)方法，從資源、產(chǎn)品等方面進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，對(duì)保障迷迭香深度開(kāi)發(fā)具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)迷迭香中鼠尾草酸的含量測(cè)定，主要有高效液相色譜、紫外分光光度法、氣相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[8-11]，其中高效液相色譜法主要采用梯度洗脫法，但由于鼠尾草酸的最大紫外吸收波長(zhǎng)位于230 nm左右，接近常規(guī)流動(dòng)相的紫外截止波長(zhǎng)，而常規(guī)液相色譜儀在梯度洗脫中又無(wú)法扣除流動(dòng)相的本底吸收，容易造成基線漂移，并導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性受到一定的影響，對(duì)高效液相色譜儀的選擇要求也較高，一定程度上制約了這些方法的廣普應(yīng)用。試驗(yàn)以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，建立迷迭香中鼠尾草酸的HPLC等度洗脫方法，有效地解決了上述問(wèn)題，且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定、可靠、高效，具有較好的廣普性，為迷迭香中鼠尾草酸的開(kāi)發(fā)利用提供了有力的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器），日本島津；色譜柱C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司（KQ3200B）；電子天平（METTLER AE240）。

1.2藥材與試劑

迷迭香藥材由湖南三福生物科技有限公司提供，鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。乙腈為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Spectrum公司；其余試劑均為分析純，廣州國(guó)藥集團(tuán)。

1.3色譜條件

流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水（60∶40，v/v）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.4供試品溶液的制備

迷迭香葉片除沙石等機(jī)械雜質(zhì)后進(jìn)行切斷處理（約1 cm），自然陰干后粉碎，并過(guò)20目藥篩。精密稱(chēng)取迷迭香粉末21.8 mg，置50 mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇40 mL，超聲處理20 min，待冷卻加無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，備用。

1.5對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定鼠尾草酸對(duì)照品10.05 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，加少量的無(wú)水乙醇超聲溶解，待冷卻后定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）過(guò)濾，備用。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液流動(dòng)相溶解后，在190～500 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)紫外掃描。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液的鼠尾草酸在230、280和331 nm各有1個(gè)吸收峰（圖1）。其中230 nm是其最大吸收波長(zhǎng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好；同時(shí)在230 nm處樣品譜圖中雜質(zhì)干擾較少，因此選用230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。鼠尾草酸在17 min左右出峰，峰形良好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，樣品中鼠尾草酸的峰形及與其他雜峰的分離度最為理想（圖1）。

圖1　鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)品與迷迭香藥材的HPLC對(duì)比圖譜

2.2線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)

精密吸取對(duì)照品溶液0.3、0.5、0.7、0.9和1.1 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋定容，配成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A（mm2）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸計(jì)算得線性回歸方程為：y=8×107X+5 000 000，R2=0.999 92。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

圖2　鼠尾草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液（鼠尾草酸濃度為0.635 mg/mL）重復(fù)進(jìn)樣6次，按色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD為1.15%，表明該方法具有良好的精密度。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性分析對(duì)放置不同時(shí)間（0、4、8、12、16和20 h）的供試品溶液分別進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定、記錄峰面積，考察鼠尾草酸的含量變化，計(jì)算其RSD為2.45%。表明供試品溶液在室溫條件下放置20 h比較穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的迷迭香藥材6份，按供試品溶液制備方法制備，并按色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算。測(cè)得迷迭香中鼠尾草酸的平均含量為2.42%，其RSD為2.05%，該方法重復(fù)性較好。

2.6回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取已測(cè)定含量的迷迭香粉末約40 mg（精確至0.01 mg）作為空白，分別置于50 mL容量瓶中，加入對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法制備，并按色譜條件測(cè)定樣品的加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)論與討論

由于受常規(guī)有機(jī)流動(dòng)相紫外截止波長(zhǎng)的影響，在HPLC梯度洗脫法中，常規(guī)液相色譜儀無(wú)法扣除流動(dòng)相比例變動(dòng)多帶來(lái)的本底吸收效應(yīng)，容易造成基線漂移，進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)的可靠性和穩(wěn)定性受到一定的影響。試驗(yàn)以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相，建立了迷迭香中鼠尾草酸的HPLC等度洗脫方法，有效地解決了上述問(wèn)題。鼠尾草酸是迷迭香藥材中的主要活性成分，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道容易轉(zhuǎn)化成鼠尾草酚，試驗(yàn)全部采用無(wú)水乙醇作為溶劑，有效地避免了鼠尾草酸的降解。結(jié)果表明，鼠尾草酸在277.2～1 016.4 μg/mL范圍具有良好的線性關(guān)系，R2=0.999 66，回收率為97.56%，結(jié)果穩(wěn)定、可靠、高效，具有較好的廣普性，為迷迭香中鼠尾草酸的開(kāi)發(fā)利用提供了有力的理論依據(jù)。

[1] 劉興寬，郁建平，連 賓，等.貴州引種的迷迭香（Rosmarinas officinalis L.）中揮發(fā)油化學(xué)成分分析[J]. 貴州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生物科學(xué)版），2002，21（3）：186 -190.

[2] 常 靜，肖緒玲. 我國(guó)引種的迷迭香抗氧化成分的分離和抗氧化性能研究[J]. 化學(xué)通報(bào)，1992，（3）：30-33.

[3] 呂順端，梅家東，袁良濟(jì). 迷迭香扦插育苗試驗(yàn)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010，（5）：179，182.

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[5] Richheimer S L，Matthew W，Bernart，et al. Antioxidant activity of lipid-soluble phenolic diterpenes from rosemary[J]. J AOCS，1996，73（4）：507-514.

[6] Moran L，Andres S，Bodas R，et al. Meat texture and anti-oxidant status are improved when carnosic acid is included in the diet of fattening lambs[J]. Meat Science，2012，91（4）：430-434.

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[9] 楊海麟，魯時(shí)瑛，楊勝利，等. 迷迭香抗氧化劑的提取方法研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2002，l4（4）：20-23.

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[11] 劉先章，趙振東. 迷迭香提取物檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2011，24（增刊1）：l32-138.

（責(zé)任編輯：夏亞男）

Determination?of?Carnosic?Acid?in?Rosemary?by?RP-HPLC

LI Hai1，LI Peng-hui2，HUANG Hui-hua1，LI Jia-yin2
（1. South China University of Technology,Guangzhou 510641, PRC; 2. Hunan Agriculture University, Changsha 410100, PRC; 3. Hunan Sunfull Bio-tech Co., Ltd, Changsha 410100, PRC）

To establish a HPLC method for the determination of carnosic acid in Rosemarinus officimalis L.， the anaiysis was carried out on Pheromenex Ecosil C18 column (200 mm ×4.6 mm，5 μm)， the mobile phase was composed of actonitrile and 0.1% phosphoric acid aqucous (60∶40， v/v).The detection wavelength was 210 nm， with flow rate 1.0 mL/min at column temperature of 30 ℃.The standard curve of linear relationship was of 0.277 2-1.016 4 mg/mL and R2=0.999 92， average recovery was 97.56%. The method was accurate，sensitive， simple and reliable for the determination of carnosic acid in Rosemarinus oficinalis L.， suitable for the quality evaluation of Rosemarinus officinalis L.

HPLC; Rosemarinus officinalis L.; carnosic acid

R284

A

1006-060X（2016）10-0087-02

2016-08-26

李 海（1992-），男，湖南岳陽(yáng)市人，碩士研究生，研究方向：食品工程。

黃惠華