缺氧誘導(dǎo)因子-1和果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

司瑞麗, 李曉鳳, 張美云, 劉 卓

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市腫瘤醫(yī)院綜合內(nèi)科)

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缺氧誘導(dǎo)因子-1和果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

司瑞麗1, 李曉鳳2, 張美云2, 劉 卓1

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭市腫瘤醫(yī)院綜合內(nèi)科)

目的:研究缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor，HIF-1)和果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白在結(jié)直腸癌組織及正常組織的表達(dá)，并探討與臨床病理因素的關(guān)系及兩者表達(dá)的相關(guān)性。方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分析檢測HIF-1和EZH2蛋白的表達(dá)情況并同時(shí)分析兩者表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:HIF-1和EZH2蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，在正常組織中低表達(dá)或無表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩者的表達(dá)與性別、年齡、是否吸煙、分期及病理類型未見相關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤密切相關(guān)(P<0.05)。兩者間在組織中表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.413，P=0.018)。結(jié)論:HIF-1和EZH2蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，且有可能作為臨床判斷預(yù)后的標(biāo)志物。

缺氧誘導(dǎo)因子-1；果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物；結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟、內(nèi)外因交互作用的結(jié)果，目前從整體層面上研究基因調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)及結(jié)構(gòu)基因組和功能基因組水平研究結(jié)直腸癌演變機(jī)制越來越引起人們的重視，一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的蛋白如缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor，HIF-1)和果蠅zeste基因增強(qiáng)子人類同源物(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)蛋白在腫瘤發(fā)生中過程的作用也受到了高度重視。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)的HIF-1蛋白，可作用于多個(gè)靶基因,使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，并可以介導(dǎo)腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。EZH2蛋白作為表觀遺傳學(xué)研究中一個(gè)重要酶類，通過與組蛋白去乙?；?、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用，沉默抑癌基因表觀遺傳性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，兩者通過微核糖核酸101(micro ribonucleic acid101,miRNA101)取得相關(guān)性，EZH2的表達(dá)和功能受miRNA101的抑制，而miRNA101的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子的調(diào)控[1]。

1 對象與方法

1.1 對象 選取包頭市腫瘤醫(yī)院病理科2013年1月至2014年12月結(jié)、直腸癌患者存檔蠟塊，包括結(jié)、直腸癌蠟塊及同一患者距腫物5cm以上的正常結(jié)、直腸黏膜組織蠟塊，所有標(biāo)本的臨床和病理資料均完整，病理診斷明確。結(jié)、直腸癌蠟塊60例為觀察組，所有入組標(biāo)本來源患者術(shù)前均未做過任何化療、放療或其他藥物等治療，其中男性35例，女性25例，年齡>50歲42人，<50歲18人，吸煙者38人，非吸煙者22人，分期：Ⅰ+Ⅱ期者34人 Ⅲ+Ⅳ期者26人，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38人，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者22人，高分化者21人，低分化39人，病理類型腺癌者27人，黏液腺癌者33人。觀察組患者中隨機(jī)抽取30例，取正常結(jié)、直腸黏膜組織蠟塊為對照組。

1.2 儀器 TP1220型自動(dòng)脫水機(jī)、1150H型病理組織包埋機(jī)RM2245型切片機(jī)、HI1220型攤片烤片機(jī)，GZX-DH數(shù)顯電熱保溫箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器廠，BX41光學(xué)顯微鏡，LOGENE-1圖像采集系統(tǒng)，尚朋堂電壓力鍋。

1.3 試劑 EZH2兔抗人單克隆抗體，HIF-1兔抗人單克隆抗體,SP通用型免疫組化試劑盒DAB顯色試劑盒

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)法 檢測HIF-1和EZH2蛋白在結(jié)直腸癌組織及正常組織中的表達(dá)情況，選取病理科存檔蠟塊,用Evision免疫組化(兩步法)，其具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，并采用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果，并攝片保存。采用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4.2 陽性結(jié)果的判斷 參照文獻(xiàn)[2]選定陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：EZH2表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，HIF-l蛋白定位于細(xì)胞核及部分胞質(zhì)中，棕色或棕褐色為陽性，陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：高倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占視野10 %以上；高倍鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占視野10 %以下計(jì)為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，比較EZH2及HIF-1與不同臨床病理參數(shù)，用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較EZH2與HIF-1兩者表達(dá)相關(guān)性時(shí)應(yīng)用Spearman等級相關(guān)分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 EZH2和HIF-1蛋白在結(jié)腸癌組織及正常組織中的表達(dá)情況 EZH2蛋白在癌組織中主要定位于細(xì)胞核，部分位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)；陽性率為75.0 %，癌旁正常組織中的陽性率為40.0 %。HIF-1蛋白在癌組織中主要定位于細(xì)胞核，部分位于胞質(zhì)，陽性細(xì)胞呈清晰棕色或棕褐色(圖2)；陽性率為63.3 %，在癌旁正常組織中的陽性率為10.0 %。結(jié)直腸癌組織中HIF-1、EZH2蛋白表達(dá)與其對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)見表1。

表1 EZH2和HIF-1蛋白在結(jié)腸癌組織及正常組織中的表達(dá)

2.2 EZH2和HIF-1分別與不同臨床病理參數(shù)之間的表達(dá)相關(guān)性 EZH2和HIF-1蛋白表達(dá)與性別、年齡、是否吸煙、分期及病理類型無相關(guān)(P>0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化密切相關(guān)(P<0.05)。見表2。

表2 EZH2和HIF-1分別與不同臨床病理參數(shù)之間的表達(dá)相關(guān)性

2.3 EZH2和HIF-1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)相關(guān)性 EZH2與HIF-1蛋白表達(dá)密切相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 EZH2和HIF-1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)相關(guān)性

3 討論

HIF-1作為一種氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，具有相當(dāng)廣泛的靶基因譜。HIF-1可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白的表達(dá)及抑制細(xì)胞間E-鈣黏蛋白表達(dá)來促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。其作用靶點(diǎn)有血管內(nèi)皮生長因子激活體內(nèi)一系列的缺血轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)生成血管，提高毛細(xì)血管通透性，從而緩解腫瘤組織、細(xì)胞的缺氧缺血，調(diào)節(jié)腫瘤組織的新陳代謝、腫瘤細(xì)胞的增殖及血管生成。

EZH2來源于多梳((polycomb group，PcG)基因家族，其表達(dá)依賴完整的SET結(jié)構(gòu)域，EZH2能減少轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)，作用于pRb2/p130蛋白C-碳末端與組蛋白去乙稀化酶相聯(lián)的區(qū)域，恢復(fù)pRb2/p130-組蛋白去乙稀化酶復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞周期素A啟動(dòng)子的活性，最終促進(jìn)細(xì)胞周期演進(jìn)和惡性轉(zhuǎn)變。

EZH2和HIF-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。這兩種蛋白通過miRNA這一紐帶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中取得聯(lián)系。miRNA101表達(dá)和直腸癌等多種癌前病變相關(guān)，如炎癥，Wnt/β鈣黏蛋白-通路的激活，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。而HIF-1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境主要是通過激活WNT/β-鈣黏蛋白通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad等通路來實(shí)現(xiàn)的。并有研究表明，miRNA101的表達(dá)受雄激素受體及缺氧誘導(dǎo)因子的抑制[1]。miRNA101可以抑制EZH2的表達(dá)和功能，在進(jìn)展期腫瘤中miRNA101表達(dá)下調(diào)出現(xiàn)EZH2的表達(dá)增加及表觀路徑的失活，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。在前列腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以通過抑制miRNA101表達(dá)促進(jìn)EZH2蛋白表達(dá)。上調(diào)miRNA101可以抑制結(jié)直腸癌,通過靶向作用限制結(jié)直腸癌在體內(nèi)的活性。在缺氧環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞內(nèi)HIF轉(zhuǎn)錄表達(dá)顯著性增加，誘導(dǎo)EZH2表達(dá)促進(jìn)腫瘤。

Chang等[3]在研究乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，缺氧調(diào)控EZH2表達(dá)，控制脫氧核糖核酸損傷修復(fù)，激活P-ERK-β蛋白通路激活，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞增殖，大多數(shù)因缺氧導(dǎo)致氯乙基三氮烯咪唑酰胺HIF-1a介導(dǎo)反式激活，促使EZH2的表達(dá)顯著增強(qiáng)，反過來又促進(jìn)氯乙基三氮烯咪唑酰胺的擴(kuò)張和癌癥進(jìn)展。張磊等[4]研究，胃癌細(xì)胞中HIF-1α蛋白和EZH2蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明EZH2蛋白與HIF-1α蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示胃癌細(xì)胞中可能存在HIF-1α/EZH2信號途徑。

MicroRNA家族與CRC的相關(guān)基因和通路有著廣泛的聯(lián)系，認(rèn)識miRNA及EZH2和HIF-1蛋白之間的相互調(diào)控關(guān)系，可以更清楚地了解CRC產(chǎn)生過程中的不同的癌變機(jī)理，EZH2和HIF-1有望成為臨床判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。

[1] Smits M,Mir SE,Nilsson RJA,et al.Down-regulation of miR-101 in endothelial cells promotes blood vessel formation through reduced repression of EZH2[J].PLoS One，2011,6(1)：e16282.

[2] 許良中，楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn).中國癌癥雜志，1996,6(4)：229-231.

[3] Chang CJ，Yang JY，Xia W，et al.EZH2promotes expansion of breast tumor initiating cells through activation of RAF1-beta-cate-nin signaling[J].Cancer Cell，2011，19(1)：86-100.

[4] 張磊，孫雪竹，孫景洲，等.胃癌中HIF-1α、EZH2的表達(dá)及意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2013,29(12):1364-1365.

Expressions of HIF-1 and EZH2 protein in colorectal carcinoma and their clinical significance

SI Ruili1, LI Xiaofeng2, ZHANG Meiyun2, LIU Zhuo1

(1.BaotouMedicalCollege, 014040Baotou,China;2.GeneralMedicalDepartmentofBaotouTumorHospital, 014040Baotou,China)

Objective:To study the expressions of HIF-1 and EZH2 protein in colorectal carcinoma and normal issues and to explore their relationship with clinical pathological features and their expression correlation. Methods: The immunohistochemistry method was applied to determine the expression of HIF-1 and EZH2 protein，and their correlation was statistically analyzed.Results: There was significant difference with high expression of HIF-1 and EZH2 protein in human colorectal carcinoma tissues and low or no expression in normal tissues (P<0.05). Their expressions had no relationship with gender, age, smoking, clinical stage and pathologic type (P>0.05)，but were closely associated with lymphatic vessel invasion and metastasis (P<0.05). Their expressions in the tissues were positively correlated(r=0.413，P=0.018). Conclusion:The expressions of HIF-1 and EZH2 protein may be closely related to the occurrence and development of colorectal carcinoma and can be used as potential prognostic marker.

HIF-1; EZH2; Human colorectal carcinoma

李曉鳳

2015-09-04)