腎性高血壓大鼠的血管功能變化*

陳珍珍， 胡 海， 王占黎， 文 榮

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

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腎性高血壓大鼠的血管功能變化*

陳珍珍， 胡 海， 王占黎， 文 榮

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

目的：觀察腎性高血壓大鼠血管功能變化，為腎性高血壓的治療提供依據(jù)。方法：將8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為2組對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組5只，手術(shù)制備腎性高血壓模型。術(shù)后，每周同一時(shí)間稱重并檢測大鼠血壓值。手術(shù)干預(yù)4周后，取胸主動脈起始部進(jìn)行血管功能檢測,分別觀察氯化乙酰膽堿(acelylcholie，Ach)、一氧化氮合酶抑制劑(N-nitro-L-argininemethyl-ester，L-NAME)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)、鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑美蘭(guanylate cyclase inhibitor，MB)，左旋精氨酸(L-arginine，L-Arg)對血管功能的影響；取主動脈弓切片，HE染色，觀察形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠血壓值與對照組及造模前相比均升高(P<0.05)；對照組大鼠的血壓值與造模前相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分別比較在造模前、造模后實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠的體重變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在Ach作用下，兩組血管均舒張，實(shí)驗(yàn)組的終舒張百分比為92.41 %，對照組為151.10 %，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在L-NAME的作用下，兩組血管均收縮，終收縮幅度實(shí)驗(yàn)組為0.14 g，對照組為0.15 g，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MB使兩組血管均收縮，終收縮幅度實(shí)驗(yàn)組為0.24 g，對照組為0.22 g，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SNP使兩組血管均舒張，終舒張百分比實(shí)驗(yàn)組為179.28 %，對照組為140.51 %，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。L-Arg使兩組血管均舒張，終舒張百分比實(shí)驗(yàn)組為 8.97 %，對照組為6.00 %，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：4周手術(shù)干預(yù)后，腎性高血壓大鼠血管內(nèi)皮無明顯器質(zhì)性損害，主動脈起始段主要表現(xiàn)為血管反應(yīng)性增強(qiáng)和功能失調(diào)。

腎性高血壓；血管功能

目前，全球約有10億人受高血壓病困擾，而且是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素[1]。腎性高血壓是繼發(fā)性高血壓的一種，主要由腎臟實(shí)質(zhì)性病變和腎動脈病變引起的血壓升高，嚴(yán)重危害人類健康[2]?，F(xiàn)階段對高血壓早期血管張力變化的臨床或動物實(shí)驗(yàn)研究還較少。本實(shí)驗(yàn)采用離體血管灌流技術(shù)，觀察腎血管性高血壓大鼠早期血管內(nèi)皮功能變化，研究早期大血管功能變化特點(diǎn)，并探討其可能發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 去甲腎上腺素(norepinephrine，PHE)、氯化乙酰膽堿(acelylcholie，Ach)、一氧化氮合酶阻斷劑左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-argininemethyl-ester，L-NAME)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)、鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑美蘭(guanylate cyclase inhibitor，MB)(sigma-Aldrich公司)，左旋精氨酸(L-arginine、L-Arg)購自上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；Krebs-Henseleit 緩沖液配制(mmol/L)：KCl 5.4,CaCl22.0 g,MgCl2·6H2O 1.1 g,NaCl 1.37,NaH2PO4·2H2O 0.4,NaHCO311.9 g,葡萄糖1.10975 g。BP-300A全自動無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)、離體器官灌流裝置、BL-420F生物信號采集與分析系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級8周齡SD大鼠10只，雄性，體重150～170 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備和分組 將10只8周齡SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，5只/組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行“兩腎一夾”法結(jié)扎手術(shù)(左腎動脈中段套內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾)，對照組大鼠進(jìn)行假性結(jié)扎手術(shù)(左腎動脈中段未套內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾)。術(shù)后3 d隨飲水給予青霉素V鉀片，0.5萬單位/d，動態(tài)關(guān)注大鼠狀態(tài)36 h，每周定時(shí)測量大鼠體重，測定尾動脈收縮壓(systolic pressure，SBP)。以術(shù)前SBP為基準(zhǔn)值，術(shù)后SBP上升≥30 mmHg為高血壓模型標(biāo)準(zhǔn)，低者剔除。4周后開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 血管功能檢測 (1)血管環(huán)制備：將各組大鼠以3 %戊巴比妥鈉(0.1 mL/100g體重)腹腔注射麻醉后，開胸迅速取主動脈弓及胸主動脈全段，置于4℃預(yù)冷Kreb，s緩沖液，去除血管外脂肪組織后，取胸主動脈起始部血管3～4 mm制成血管環(huán)，用不銹鋼微型掛鉤貫穿血管腔，將血管環(huán)懸掛于張力換能器上，置于盛有20 mL 37 ℃ Krebs-Henseleit 緩沖液的恒溫浴管中，持續(xù)通入混合氣體(95 %O2+5 %CO2)。施加前負(fù)荷1.0 g，以緩沖液平衡30 min，每15 min換1次液，待血管張力穩(wěn)定后，用60 mmol/L KCl進(jìn)行預(yù)刺激2次，使血管環(huán)平滑肌去極化，第2次血管環(huán)收縮達(dá)最大平臺期后洗脫，開始正式實(shí)驗(yàn)。(2)血管環(huán)收縮和舒張功能檢測：用10-4mol/L PHE(終濃度10-6mol/L)收縮血管，待張力上升達(dá)平臺后，再由低到高加入不同累積終濃度(10-9～10-5mol/L)的Ach作用于血管環(huán)，記錄各濃度Ach下血管環(huán)的舒張百分比；用同法檢測終濃度(10-9～10-5mol/L)的SNP對血管張力的變化。將L-NAME(10-4mol/L)加入浴槽，孵育30 min后加入PHE(10-9～10-6mol/L)，記錄血管環(huán)張力變化；用同法檢測鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑美蘭MB(10-6mol/L)對血管環(huán)的張力變化的影響。將L-Arg(10-4mol/L)作用于血管環(huán)，孵育5 min后加PHE(10-6mol/L)，待收縮達(dá)平臺期后，依次從小到大加入不同累積終濃度的Ach(10-9～10-6mol/L)，記錄血管環(huán)張力變化。每次作用完成后，均用Kreb，s液沖洗水槽3次，重新調(diào)節(jié)血管環(huán)張力，平衡30 min，待基線穩(wěn)定后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 主動脈弓組織形態(tài)學(xué)觀察 取實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠主動脈行4 %多聚甲醛固定，制作石蠟切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察血管形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 舒張反應(yīng)的數(shù)據(jù)以10-6moI/L PHE引起的穩(wěn)定收縮為100 %，以其張力減少的百分?jǐn)?shù)表示；收縮幅度以實(shí)際改變的幅度(g)計(jì)算。實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血壓與體重變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠血壓值與對照組及造模前相比均上升(P<0.05)；對照組大鼠的血壓值與造模前相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。分別比較在造模前、造模后實(shí)驗(yàn)組與對照組大鼠的體重變化，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P>0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組前后血壓及體重對比大鼠

2.2 主動脈組織形態(tài)學(xué)結(jié)果 光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組的大鼠主動脈組織切片，均可見主動脈外膜彈力纖維粗細(xì)不等，雜亂地糾纏在一起，放大后見這些纖維是由直徑0.1～0.2 μm的微纖維組成的束狀結(jié)構(gòu)，一些微纖維從這一束又連到另外的束，形成不同粗細(xì)的纖維，實(shí)驗(yàn)組和對照組之間無明顯差別。見圖1。

2.3 Ach、L-NAME、MB對血管功能的影響 (1)Ach對血管功能的影響：在Ach作用下，兩組血管均舒張，實(shí)驗(yàn)組的終舒張百分比為92.41 %，對照組為151.10 %，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2；(2)L-NAME對血管功能的影響：兩組血管均收縮，終收縮幅度實(shí)驗(yàn)組為0.14 g，對照組為0.15 g，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3；(3)MB：兩組血管均收縮，終收縮幅度實(shí)驗(yàn)組為0.24 g，對照組為0.22 g，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.4 SNP、L-Arg對血管功能的影響 (1)SNP：兩組血管均舒張，終舒張百分比實(shí)驗(yàn)組為179.28 %，對照組為140.51 %，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。(2)L-Arg：兩組血管均舒張，終舒張百分比實(shí)驗(yàn)組為 8.97 %，對照組為6.00 %，組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

3 討論

高血壓的發(fā)生發(fā)展易引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[3]，使血管內(nèi)皮功能發(fā)生改變。Ach具有較強(qiáng)的內(nèi)皮依賴性舒張作用，本次實(shí)驗(yàn)證明，高血壓大鼠大動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能呈降低趨勢，這與Wang Y[4]的研究結(jié)果一致。左旋精氨酸(L-Arg)做為NO合成的底物，使血管內(nèi)皮中NO的含量上升，值得注意的是，實(shí)驗(yàn)組在L-Arg孵育后表現(xiàn)出內(nèi)皮依賴性舒張功能升高的趨勢，表明此時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞尚未發(fā)生嚴(yán)重功能損害，高血壓使血管內(nèi)皮依賴性舒張功能降低的主要原因?yàn)镹O量減少或其活性被抑制，與已有研究結(jié)果一致[5]。

L-NAME和MB分別抑制NO合酶的活性和NO靶部位的結(jié)合能力，使血管內(nèi)皮中NO的表達(dá)降低，實(shí)驗(yàn)組大鼠L-NAME和MB孵育后PHE對血管收縮作用的影響表現(xiàn)不一致，提示高血壓大鼠主動脈收縮功能的改變可能存在其他原因，其與NO的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

SNP為非內(nèi)皮依賴性舒張藥物，實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)出舒張功能具有上升趨勢，提示高血壓可能引起血管非內(nèi)皮依賴性舒張功能升高。

本實(shí)驗(yàn)大鼠高血壓處于早期階段，暫無明顯器質(zhì)性損害，主動脈起始段主要表現(xiàn)為血管反應(yīng)性增強(qiáng)和功能失調(diào)，可能與高血壓初期自身代償有關(guān)。腎血管性高血壓引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷主要受腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的調(diào)節(jié)[6]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高血壓對血管內(nèi)皮功能的改變，主要表現(xiàn)為NO活性被抑制或其含量下降。有研究表明：當(dāng)高血壓引起的血管內(nèi)皮NO表達(dá)量降低且血管緊張素受體2(AT2受體)未被抑制時(shí)，血管緊張素Ⅱ濃度升高，會刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞生成NO，對其進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，可能引起高血壓血管內(nèi)皮功能紊亂。在高血壓治療初期，應(yīng)對大血管內(nèi)皮功能紊亂進(jìn)行預(yù)防性藥物治療；血管內(nèi)皮細(xì)胞損害是發(fā)生動脈粥樣硬化的前兆，故預(yù)防動脈粥樣硬化時(shí)，應(yīng)著重對內(nèi)皮細(xì)胞功能性損傷進(jìn)行糾正。

高血壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明血管反應(yīng)性增強(qiáng)往往先于高血壓的發(fā)生，提示血管反應(yīng)性增強(qiáng)可能是高血壓形成的原始因素之一。血管功能變化和血管重塑，由阻力血管逐漸向大血管發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)觀察了主動脈起始段在高血壓早期的改變，而高血壓不同時(shí)期、不同部位血管的結(jié)構(gòu)和功能變化尚需進(jìn)一步研究。

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Changes of vascular function in rats with renovascular hypertension

CHEN Zhenzhen, HU Hai, WANG Zhanli, WEN Rong

(BaotouMedicalCollege,Baotou014060，China)

Objective:To observe the changes of vascular function in rats with renovascular hypertension, providing basis for the treatment of Renovascular hypertension. Methods:8-week- old male SD rats were randomly divided into two groups (five rats in each group) and renovascular hypertension models were made by operation. The weight and blood pressure were measured at the same time every week. 4 weeks after the operation, the initial part of the thoracic aorta was taken to examine the vascular function, the influence of acelylcholie (Ach), N-nitro-L-argininemethyl-ester (L-NAME)， Sodium Nitroprusside (SNP), guanylate cyclase inhibitor (MB) and L-Arginine (L-Arg )on vascular function observed; the aortic arch was stained with hematoxylin-eosin staining, morphological changes observed. Results:When the experiment was finished, the blood pressure increased for the rats in the the experimental group, compared with that of the control group and before modeling. (P<0.05); the blood pressure for the rats in the control grop did not change ,compared with that before modeling(P>0.05); there was no difference in terms of the body weight before and after modeling in the two groups(P>0.05). Under the effect of Ach, the blood vessels of the two groups were diastolic, the percentage of the experimental group being 92.41% and that of the control group being 151.10%, the difference between which was not significant(P>0.05). Under the effect of L-NAME, the blood vessels of the two groups contracted, the final contraction in the experimental group being 0.14g and that of the control group being 0.15g, the difference between which was not significant(P>0.05); MB made the blood vessels in the two groups contract, the final contraction in the experimental group being 0.24g and that in the control group being 0.22 g, the difference between which was not significant (P>0.05). SNP made the blood vessels in the two groups diastolic, the end diastolic percentage of the experimental group being 179.28 % and that of the control group being 140.51 % , the difference between which was not significant(P>0.05).L-Arg made the blood vessels of the two groups diastolic, the end diastolic percentage of the experimental group being 8.97 % and that of the control group being 6.00% , the difference between which was not significant (P>0.05).Conclusion:4 weeks after surgery, there is no organic injury in the vascular endothelial function of rats with renovascular hypertension; there is increase in vascular reactivity and dysfunction in the initial part of the aorta.

Renovascular hypertension; Vascular function

國家自然科學(xué)基金(81460049)

胡海

2016-01-15)