超濾法結(jié)合HPLC法測(cè)定白藜蘆醇的血漿蛋白結(jié)合率

鮑慧瑋 侯曉琳 劉芳馨 劉 佳 李麗靜

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130000

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超濾法結(jié)合HPLC法測(cè)定白藜蘆醇的血漿蛋白結(jié)合率

鮑慧瑋 侯曉琳 劉芳馨 劉 佳 李麗靜*

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130000

目的：建立測(cè)定白藜蘆醇與大鼠、小鼠、家兔血漿蛋白結(jié)合率的方法，并測(cè)定其結(jié)果，為白藜蘆醇的藥代動(dòng)力學(xué)及臨床用藥提供參考。方法：采用超濾法結(jié)合HPLC法對(duì)白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿的蛋白結(jié)合率進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：白藜蘆醇在0.521～22.97μg的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=11.434X-0.0409(r=0.9995)。白藜蘆醇與大鼠血漿、小鼠血漿和家兔在0.504μg/mL、5.04μg/mL、20.16μg/mL的含藥血漿中的蛋白結(jié)合率為(90.32±0.09)%、(89.32±0.04)%、(91.52±0.12)%。結(jié)論：該方法重復(fù)性和專屬性好，操作簡(jiǎn)單、快捷，能夠滿足樣品定量分析測(cè)定要求;測(cè)定結(jié)果表明，白藜蘆醇與血漿蛋白有很強(qiáng)的結(jié)合，且在考察范圍內(nèi)蛋白結(jié)合率對(duì)血藥濃度無(wú)明顯的依賴性。

白藜蘆醇；超濾法；HPLC；血漿蛋白結(jié)合率

白藜蘆醇(trans-3,5,4-o-trihydroxystilbene)是存在于虎杖、花生、桑椹、葡萄等植物中的一種生物活性極強(qiáng)的多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤[1]、抗氧化[2]和抗炎[3]等多方面作用，且在抑制血小板聚集、預(yù)防腹部、心臟病、關(guān)節(jié)等外科手術(shù)后纖維組織粘連和舒張血管方面也具有良好的藥理活性[4-6]。近年來(lái)其頗受關(guān)注和研究，是一種潛在開發(fā)的藥物。但其在藥代動(dòng)力學(xué)方面研究較少，尤其在血漿蛋白結(jié)合率方面并無(wú)研究。而藥物的血漿蛋白結(jié)合率是藥代動(dòng)力學(xué)中重要參數(shù)，與藥物在體內(nèi)的吸收、代謝、分布和排泄等密切相關(guān)[7-8]，對(duì)今后其新藥的研發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要的意義[9-11]。實(shí)驗(yàn)采用超濾法和HPLC結(jié)合的方法[12-15]對(duì)白藜蘆醇和大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行研究，為對(duì)白藜蘆醇藥代動(dòng)力學(xué)的研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相(含DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent有限公司)；WP-UP-III-10沃特浦實(shí)驗(yàn)室用超純水器(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)；超濾管(醋酸纖維素膜，相對(duì)分子質(zhì)量截留值10kD，Millopore公司)；TG1650-WS 型高速離心機(jī)(上海盧湘儀)；SK-1快速混勻器(江蘇金壇市江南儀器制造廠)；AVW20D型電子天平(日本島津制作所)。

1.2 試藥 白藜蘆醇(批號(hào)：111535-200502，中國(guó)藥品生物制品鑒定所)；甲醇(色譜純，美國(guó)FISHER公司)；超純水(自制)；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、磷酸氫二鉀等均為分析純。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，體重(200±20)g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供(合格證號(hào)：SCXK(吉)2011-0004)，毛細(xì)管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。SD小鼠，雄性，體重(200±20)g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供(合格證號(hào)：SCXK(吉)2011-0004)，毛細(xì)管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。實(shí)驗(yàn)兔，雄性，體重1.8～2.2kg，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供(合格證號(hào)：SCXK(吉)2012-0002)，毛細(xì)管眼眥取血，置肝素鈉抗凝離心管中，3000r/min離心10min，分離血漿，置于4℃冰箱中冷凍備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Venusil MP-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-水(V∶V=45∶55)，流速1mL/min，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm，進(jìn)樣量為10μL，理論塔板數(shù)按照白藜蘆醇計(jì)算不低于2000，且與其他物質(zhì)分離度良好，符合藥典規(guī)定。

2.2 溶液配制

2.2.1 等滲PBS溶液的配制 分別稱取磷酸二氫鉀2.59g，磷酸氫二鉀14.11g，氯化鈉1.99g，磷酸氫二鉀14.11g，置于1000mL容量瓶中，加入適量超純水，超聲溶解，超純水定容至刻度，搖勻，即為等滲PBS溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品約5mg，置1L容量瓶中，加入適量等滲PBS，均勻混合，定容至刻度，搖勻，即得濃度約為5μg/mL的白藜蘆醇儲(chǔ)備液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品25.2mg，置于50mL容量瓶中，加入等滲PBS溶液適量，充分溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取0.25、2.5、10.0mL加入25mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得濃度為5.04、50.4、201.6μg/mL的PBS溶液。分別精密吸取50μL，置于450μL空白大鼠、小鼠、家兔血樣中，均勻混合，得到濃度為0.504、5.04、20.16μg/mL的高、中、低濃度的血漿樣品。分別置于37℃水浴鍋中溫預(yù)3h后，將溫預(yù)后的大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿移至超濾管中，6000r/min離心15min，得到各血漿超濾液，即得高、中、低濃度的供試品，在4℃下保存。2.3 專屬性考察 取空白大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿各400μL，分別置于37℃水浴鍋中溫預(yù)3h后，將溫預(yù)后的大鼠血漿、小鼠血漿和家兔血漿移至超濾管中，6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。分別將白藜蘆醇對(duì)照品、空白血漿超濾液和供試品溶液按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相，白藜蘆醇對(duì)照品峰形良好，且與其它峰分離度良好，具有良好的專屬性，見圖2、3、4。2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品25.2mg，置于50mL容量瓶中，加入等滲PBS溶液適量，充分溶解，定容至刻度，搖勻。分別吸取0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、5.0mL加入100mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得濃度為0.504、1.008、5.04、10.08、20.16、25.2μg/mL的PBS溶液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件方法進(jìn)入高效液相色譜中，記錄峰面積，以白藜蘆醇的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程為Y=11.434X-0.0409(r=0.9995)，線性范圍為0.504～25.2μg。

2.5 精密度考察

2.5.1 PBS液精密度考察 取“2.4 線性關(guān)系考察”中濃度為0.504、5.04、20.16μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日間精密度RSD，結(jié)果見表1。2.5.2 超濾液精密度考察 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算日內(nèi)精密度的RSD值，連續(xù)進(jìn)樣6d，計(jì)算日間精密度RSD，結(jié)果見表1。

2.6 穩(wěn)定性考察2.6.1 PBS溶液穩(wěn)定性考察 取“2.4 線性關(guān)系考察”中濃度為0.504、5.04、20.16μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果見表1。

2.6.2 超濾液穩(wěn)定性考察 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24h進(jìn)入高效液相色譜儀中，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果見表1。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.7 超濾液回收率的考察 取“2.4 線性關(guān)系考察”中濃度為0.504、5.04、20.16μg/mL的低、中、高濃度的白藜蘆醇對(duì)照品溶液，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，吸取超濾液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相色譜儀，與相應(yīng)對(duì)照品溶液峰面積對(duì)比計(jì)算回收率。結(jié)果超濾膜回收率均≥95%，證明超濾膜對(duì)白藜蘆醇無(wú)特異性吸附。結(jié)果見表2。

表2 回收率考察結(jié)果

2.8 血漿蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn) 取“2.5.2”項(xiàng)下中0.504、5.04、20.16μg/mL的低、中、高3個(gè)濃度的大鼠、小鼠、家兔樣品，分別吸取400μL，置于超濾管中，以6000r/min離心15min，得到空白血漿超濾液。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)入高效液相，計(jì)算其血漿蛋白結(jié)合率。

式中：ρ超濾前為超濾前溶液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，μg/L；ρ超濾后為超濾液中白藜蘆醇的質(zhì)量濃度，μg/L。

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明低、中、高3種濃度的供試品溶液與大鼠、小鼠和家兔的血漿蛋白結(jié)合率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。

表3 白藜蘆醇血漿蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)結(jié)果±s，n=6)

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇 通過DAD檢測(cè)器，在各波長(zhǎng)下，對(duì)不同色譜條件超濾液和對(duì)照品進(jìn)行分析。最終確定在波長(zhǎng)為290nm時(shí)，樣品分離效果最好，與其它雜質(zhì)的分離度均符合藥典藥典規(guī)定。

3.2 測(cè)定方法的選擇 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]，有多種血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定的方法，常用的有超濾法、平衡透析法、凝膠過濾法、白蛋白微球測(cè)定法、超速離心法等。實(shí)驗(yàn)采用超濾法，其是一種經(jīng)典的測(cè)定方法，具有樣品測(cè)定準(zhǔn)確、速率高、成本低等顯著優(yōu)勢(shì)，適用于大量樣品的測(cè)定。超濾法減少了非特異性的表面吸附，縮短了平衡時(shí)間，加快了待測(cè)樣品的測(cè)定時(shí)間，且不受稀釋效應(yīng)和體積遷移的影響。

3.3 超濾管的選擇 實(shí)驗(yàn)選用截留向相對(duì)分子質(zhì)量為10K的超濾管，可以將超濾管內(nèi)的血漿蛋白、內(nèi)源性物質(zhì)及其他成分在透析的過程中穩(wěn)定的保存于超濾管濾膜內(nèi)，不對(duì)樣品進(jìn)行干擾，可以很好的測(cè)定白藜蘆醇與大鼠、小鼠和家兔血漿蛋白的結(jié)合率。3.4 樣品的選擇和意義 白藜蘆醇在抗腫瘤、抗氧化和抗炎等多方面性質(zhì)等方面都有良好的藥理作用，是一種很有潛力的藥品[10-11]，但對(duì)于其血漿蛋白結(jié)合率并沒有研究。白藜蘆醇藥物被吸收后部分呈游離的分子狀態(tài)，這部分游離的藥物分子能從血液中進(jìn)入作用部位，并發(fā)揮藥理作用，與血漿蛋白結(jié)合的藥物卻沒有藥理活性。當(dāng)游離的白藜蘆醇被代謝或者進(jìn)入組織后，部分與血漿蛋白結(jié)合的白藜蘆醇又可以分開并彌補(bǔ)游離的藥物。藥物的這種可逆性結(jié)合可以影響白藜蘆醇的藥代動(dòng)力學(xué)、作用時(shí)間、作用強(qiáng)度都密切相關(guān)，且與其作用機(jī)制、藥物相互作用等密切相關(guān)，故本試驗(yàn)對(duì)白藜蘆醇的血漿蛋白結(jié)合率的研究具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇具有高蛋白結(jié)合率，可使其在體內(nèi)的表觀分布容積相對(duì)較大，半衰期增長(zhǎng)，腎清除速率減慢；通過對(duì)大鼠、小鼠和家兔的超濾液色譜圖對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們色譜圖基本相同，可能因?yàn)檠獫{蛋白其成分相似。此方法適用于大鼠、小鼠、家兔的血漿蛋白蛋白結(jié)合率的測(cè)定，其對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)和臨床應(yīng)用也有極大的意義。

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(編輯：程鵬飛)

Determination of Plasma Protein Binding Rate Of Resveratrol by Ultrafiltration and HPLC

BAO Huiwei HOU Xiaolin LIU Fangxin LIU Jia LI Lijing*

Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130000, China

Objective To establish a method for the determination of resveratrol of the plasma protein binding rate in rats, mice and rabbits. To provide

for the pharmacokinetics and clinical use of resveratrol. Methods The ultrafiltration was employed to determine the plasma protein binding rate of resveratrol in in rats, mice and rabbits.Results The calibration curve of resveratrol was linear within the ranges of 0.521～22.97μg, the calibration curve wasY=11.434X-0.0409(r=0.999). The average plasma protein binding rates of resveratrol with rats, mice and rabbits were (90.32±0.09)%、(89.32±0.04)%、(91.52±0.12)% in the plasma concentrations of 50.504μg/mL,5.04μg/mL,20.16μg/mL respectively. Conclusion The method has high sensitivity, good specificity and reproduction，with simple management thus fulfilling the requirement. Resveratrol shows a high binding power to plasma protein, and this was independent of the investigated concentrations and the different species．

Resveratrol;Ultrafiltration;HPLC;Plasma Protein Binding Rate

2016-07-18

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20120932)。

鮑慧瑋(1989-)，女，滿族，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥有效成分質(zhì)量控制及藥效研究。E-mail:baohuiwei@163.com

李麗靜(1970-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制研究。E-mail:lilijing66@163.com

R284.1

A

1007-8517(2016)20-0023-04