遺傳性凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯(lián)合缺陷癥的基因診斷

汪安友，劉 欣，吳競(jìng)生，孫自敏

遺傳性凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯(lián)合缺陷癥的基因診斷

汪安友，劉 欣，吳競(jìng)生，孫自敏

目的 對(duì)2例遺傳性凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯(lián)合缺陷癥（F5F8D）患者家系進(jìn)行基因診斷分析。方法 常規(guī)凝血功能檢測(cè)活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶原時(shí)間（PT）、凝血因子Ⅴ活性（FV：C）及凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法測(cè)序分析LMAN1及MCFD2基因全外顯子序列。結(jié)果 患者1的APTT及PT分別為78.7 s、21.1 s，F(xiàn)Ⅷ：C降至23.8%，F(xiàn)V：C為6%；其MCFD2基因3號(hào)外顯子存在純合突變，第242堿基位點(diǎn)腺嘌呤突變?yōu)榘奏ぃˋ＞C），導(dǎo)致氨基酸序列第81位天冬氨酸突變成丙氨酸（Asp81Ala）?；颊?的APTT及PT分別為78.5 s、19.6 s，F(xiàn)Ⅷ：C及FV：C分別為24.8%、9.6%；其LMAN1基因12號(hào)外顯子第1456堿基位點(diǎn)存在鳥(niǎo)嘌呤-胸腺嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤純合缺失（1456delGTG），導(dǎo)致氨基酸序列第486位纈氨酸（Val）缺失。結(jié)論 國(guó)內(nèi)首次報(bào)道兩種新型的MCFD2及LMAN1基因突變，導(dǎo)致兩種不同臨床表型的遺傳性F5F8D。

凝血因子V；凝血因子VIII；LMAN1；MCFD2；突變

遺傳性凝血因子V及Ⅷ聯(lián)合缺乏癥（inherited coagulation factor V andⅧdisease，F(xiàn)5F8D）是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，發(fā)病率約為百萬(wàn)分之一，男女均可發(fā)病。目前國(guó)際上報(bào)道的病例主要集中于中東地區(qū)。患者臨床主要表現(xiàn)為有輕至中度的出血傾向，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)通常為凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）及凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）延長(zhǎng)，同時(shí)伴有凝血因子V及Ⅷ的活性下降，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)多在5%～30%［1-2］。研究［3-4］證實(shí)遺傳性F5F8D與凝血因子Ⅴ及Ⅷ自身基因無(wú)關(guān)，主要由細(xì)胞內(nèi)自?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LMAN1及MCFD2基因突變引起。目前國(guó)際上已報(bào)道的LMAN1及MCFD2基因不同類(lèi)型突變導(dǎo)致遺傳性F5F8D的共計(jì)49種［1-2］，國(guó)內(nèi)總共報(bào)道過(guò)4個(gè)完整F5F8D家系研究［5-6］，均未發(fā)現(xiàn)新型LMAN1及MCFD2基因突變。該研究首次發(fā)現(xiàn)2例來(lái)自不同家系的疑似遺傳性F5F8D患者，對(duì)這兩個(gè)家系做了基因診斷分析，最終確診了該2例遺傳性F5F8D，其基因突變類(lèi)型均為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 家系1資料：先證者，男，30歲，因外傷導(dǎo)致顱內(nèi)出血就診于我院急診，常規(guī)凝血功能檢測(cè)提示APTT、PT均延長(zhǎng)，經(jīng)凝血因子活性檢測(cè)，臨床診斷為凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯(lián)合缺陷，后經(jīng)基因診斷分析，明確診斷為遺傳性F5F8D。先證者父母系近親結(jié)婚，其父親及大姐為雜合子攜帶者，其母親因已病逝，推測(cè)為雜合子攜帶者。家系遺傳學(xué)圖譜見(jiàn)圖1。家系2資料：先證者，女，35歲，因不孕癥就診我院門(mén)診，無(wú)明顯出血傾向，常規(guī)凝血功能檢測(cè)提示APTT、PT均延長(zhǎng)，經(jīng)凝血因子活性檢測(cè)，臨床診斷為凝血因子Ⅴ及Ⅷ聯(lián)合缺陷，同樣經(jīng)基因診斷分析，明確診斷為遺傳性F5F8D。先證者父母系近親結(jié)婚，母親及姐為雜合子攜帶者，其父親因已去逝，推測(cè)為雜合子攜帶者。家系遺傳學(xué)圖譜見(jiàn)圖2。

圖1 家系1遺傳學(xué)圖譜（箭頭代表先證者）

1.2 方法

1.2.1 凝血功能及凝血因子活性檢測(cè) 0.129 mol/L枸櫞酸鈉作為抗凝劑，靜脈采集血液標(biāo)本，3 000 r/m離心10 min，分離血漿。采用STAGO公司半自動(dòng)血凝儀常規(guī)檢測(cè)患者及家系成員外周凝血功能PT、APTT指標(biāo)。STAGO公司凝血因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)分析患者具體凝血因子活性指標(biāo)。

圖2 家系2遺傳學(xué)圖譜（箭頭代表先證者）

1.2.2 基因測(cè)序分析 0.129 mol/L枸櫞酸鈉作為抗凝劑，靜脈采集患者及其家系成員、健康對(duì)照外周血標(biāo)本，外周血基因 DNA提取試劑盒提取基因DNA。PCR法擴(kuò)增LMAN1及MCFD2基因所有外顯子序列：藥物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［7］，PCR法擴(kuò)增反應(yīng)體系：50 μl，Taq buffer 5 μl，25 mmol/L MgCl25 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10 ng DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，Taq DNA聚合酶5 U/μl 0.5 μl及滅菌蒸餾水35.5 μl。PCR法擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，60℃退火35 s，72℃延伸40 s，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降0.5℃，94℃變性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸3 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、割膠純化后送上海生工測(cè)序分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室凝血功能檢測(cè)及臨床出血表現(xiàn) 通過(guò)檢測(cè)先證者1凝血功能及凝血因子活性發(fā)現(xiàn)，其APTT 78.7 s及PT 21.1 s均顯著延長(zhǎng)，F(xiàn)VIII：C減低為23.8%，F(xiàn)V：C減低為6%，其余凝血因子活性均未見(jiàn)異常；各家系成員的凝血功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果及臨床出血傾向見(jiàn)表1。

通過(guò)檢測(cè)先證者2凝血功能及凝血因子活性發(fā)現(xiàn)，其APTT及PT分別為78.5 s、19.6 s，F(xiàn)Ⅷ：C降至24.8%，F(xiàn)V：C為9.6%，其余凝血因子活性均未見(jiàn)異常；各家系成員的凝血功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果及臨床出血傾向見(jiàn)表2。

2.2 基因檢測(cè)分析 家系1：通過(guò)測(cè)序檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)先證者1的MCFD2基因所有外顯子，分析先證者1在該基因的第3號(hào)外顯子處檢測(cè)到1個(gè)純合突變：g.242 A＞C，該位點(diǎn)突變直接導(dǎo)致第81位天冬氨酸突變成丙氨酸（Asp81Ala），先證者1的父親和大姐該位點(diǎn)為雜合突變，50例健康對(duì)照均未檢測(cè)到該突變位點(diǎn)。先證者1及其家系成員的LMAN1基因均未發(fā)現(xiàn)異常突變。見(jiàn)圖3。

家系2：通過(guò)測(cè)序檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)先證者2的LMAN1基因所有外顯子，分析先證者2在該基因的第12號(hào)外顯子處檢測(cè)到1個(gè)純合突變：1456delGTG，該位點(diǎn)純合缺失突變直接導(dǎo)致第486位纈氨酸丟失；先證者2的母親和姐姐該位點(diǎn)為雜合缺失突變，50例健康對(duì)照均未檢測(cè)到該突變位點(diǎn)。先證者2及其家系成員的MCFD2基因均未發(fā)現(xiàn)異常突變。見(jiàn)圖4。

表1 先證者1及其家系成員凝血功能檢測(cè)及臨床出血表現(xiàn)

表2 先證者2及其家系成員凝血功能檢測(cè)及臨床出血表現(xiàn)

圖3 家系1成員中MCFD2基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)

圖4 家系2成員中LMAN1基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)

3 討論

遺傳性F5F8D首次報(bào)道于1954年［8］，該病在中東地區(qū)發(fā)病率較高，與這些地區(qū)的近親結(jié)婚率高有關(guān)?；颊咄ǔＷ杂子休p至中度的出血傾向，包括發(fā)生瘀斑、鼻衄、牙齦出血、女性月經(jīng)過(guò)多，以及外傷或拔牙、外科術(shù)后過(guò)量出血等。實(shí)驗(yàn)室檢查患者凝血功能指標(biāo)APTT、PT指標(biāo)均延長(zhǎng)，F(xiàn)V、FⅧ活性水平均降低，多維持在正常人的5%～30%。

目前研究［1］已經(jīng)證實(shí)，該病的分子發(fā)病機(jī)制與LMAN1或MCFD2基因的突變相關(guān)。LMAN1基因位于18q2l，包括13個(gè)外顯子，編碼成熟蛋白由510個(gè)氨基酸組成；MCFD2基因位于2p21，較LMAN1基因小，包括4個(gè)外顯子，其編碼成熟蛋白由146個(gè)氨基酸組成。LMAN1或MCFD2基因編碼的蛋白，可以在細(xì)胞內(nèi)相互結(jié)合形成一種穩(wěn)定的Ca2+依賴(lài)轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，主要參與細(xì)胞內(nèi)凝血因子V及Ⅷ從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。因此，這2個(gè)基因的缺陷可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)凝血因子V及VIII自?xún)?nèi)質(zhì)網(wǎng)至高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，從而使血漿中凝血因子V及Ⅷ水平下降，臨床表現(xiàn)為凝血指標(biāo)的延長(zhǎng)，以及不同程度的出血傾向。

本研究中家系1的先證者為30歲男性，因外傷導(dǎo)致顱內(nèi)出血急診轉(zhuǎn)入我院，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凝血功能檢測(cè)顯示其APTT、PT指標(biāo)均有不同程度的延長(zhǎng)，進(jìn)一步臨床檢測(cè)了患者相關(guān)凝血因子活性，其凝血因子V：C、Ⅷ：C分別降至6%、23.8%。其余凝血因子活性水平均為正常，排除繼發(fā)性相關(guān)因素后，考慮患者父母系近親結(jié)婚，臨床診斷考慮為遺傳性F5F8D。其父母系表兄妹結(jié)婚，該病為常染色體隱性遺傳性疾病，對(duì)先證者進(jìn)行LMAN1及MCFD2基因檢測(cè)，該患者是由MCFD2基因的第3號(hào)外顯子存在g.242 A＞C純合突變，該位點(diǎn)突變直接導(dǎo)致第81位天冬氨酸突變成丙氨酸（Asp81Ala），先證者的父親和大姐該位點(diǎn)為雜合突變，先證者母親因腦出血已病逝，推測(cè)其母親該位點(diǎn)亦為雜合突變。目前國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)18種MCFD2基因突變，其中錯(cuò)義突變僅8種［1，9-11］，本課題組最早于2014年在國(guó)際上首次報(bào)道Asp81Ala位點(diǎn)錯(cuò)義突變，該突變?yōu)镸CFD2基因上迄今為止發(fā)現(xiàn)的第9種類(lèi)型錯(cuò)義突變［2］。

本研究家系2中的患者為女性，因不孕癥就診，常規(guī)檢測(cè)意外發(fā)現(xiàn)凝血功能指標(biāo)異常，PT、APTT均延長(zhǎng)，同樣伴有凝血因子V及Ⅷ活性下降。但其自幼無(wú)出血傾向，且曾經(jīng)歷婦科手術(shù)治療，追問(wèn)病史未有術(shù)中及術(shù)后過(guò)量出血表現(xiàn)。經(jīng)基因檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)：先證者2在LMAN1的第12號(hào)外顯子處存在1456delGTG純合突變，直接導(dǎo)致第486位纈氨酸丟失；先證者2的母親和姐姐該位點(diǎn)為雜合缺失突變，其父親因去世，無(wú)法采集標(biāo)本檢測(cè)，結(jié)合疾病隱性遺傳性規(guī)律，推測(cè)其父親該位點(diǎn)同樣為雜合缺失突變。目前LMAN1基因的13個(gè)外顯子已發(fā)現(xiàn)36種不同類(lèi)型突變，這些突變以無(wú)義突變或移碼突變?yōu)橹?，均可?dǎo)致LMAN1基因編碼蛋白的功能缺失［1，11］。

本研究系在我省首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)2例F5F8D患者，在臨床診療過(guò)程中進(jìn)行了及時(shí)的診斷、分析及治療，并進(jìn)一步對(duì)患者家系進(jìn)行基因診斷分析。在國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)2種新型的LMAN1、MCFD2基因突變，這兩種類(lèi)型的基因突變導(dǎo)致2種截然不同的臨床表型。盡管先證者1和先證者2檢測(cè)結(jié)果均提示APTT、PT延長(zhǎng)；凝血因子Ⅴ、Ⅷ均存在不同程度減少，但是先證者1臨床出血傾向較明顯，而先證者2并無(wú)明顯臨床出血癥狀，更有趣的是先證者2甚至在未進(jìn)行凝血因子替代治療的情況下，曾經(jīng)成功經(jīng)歷了婦科手術(shù)，術(shù)后未見(jiàn)明顯出血傾向。不同類(lèi)型的LMAN1、MCFD2基因突變可以導(dǎo)致不同類(lèi)型的臨床出血表型，這與國(guó)外研究［1］報(bào)道相一致。至于其機(jī)制，很可能是由于LMAN1、MCFD2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的不同功能區(qū)域，在參與細(xì)胞內(nèi)凝血因子Ⅴ、Ⅷ轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮作用大小相關(guān)，因此進(jìn)一步的研究LMAN1、MCFD2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)功能很有必要，從而為更好的理解認(rèn)識(shí)遺傳性F5F8D提供依據(jù)。

［1］ Zheng C，Zhang B.Combined deficiency of coagulation factorsⅤandⅧ：an update［J］.Semin Thromb Hemost，2013，39（6）：613 -20.

［2］ Wang A，Liu X，Wu J，et al.Combined FV and FⅧ deficiency （F5F8D）in a Chinese family with a novel missense mutation in MCFD2 gene［J］.Haemophilia，2014，20（6）：e436-8.

［3］ Zheng C，Liu H H，Yuan S，et al.Molecular basis of LMAN1 in coordinating LMAN1-MCFD2 cargo receptor formation and ER-to-Golgi transport of FV/FⅧ［J］.Blood，2010，116（25）：5698-706.

［4］ Zhang B，Cunningham M A，Nichols W C，et al.Bleeding due to disruption of a cargo-specific ER-to-Golgi transport complex［J］. Nat Genet，2003，34（2）：220-5.

［5］ 陸曄玲，王學(xué)鋒，丁秋蘭，等.凝血因子Ⅴ及凝血因子Ⅷ聯(lián)合缺陷患者四例的基因診斷［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，33（7）：618-24.

［6］ 葛 菁，薛 峰，顧東生，等.Lman1基因復(fù)合雜合突變導(dǎo)致的凝血因子Ⅴ、Ⅷ聯(lián)合缺乏癥［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2010，18 （1）：185-90.

［7］ Ivaskevicius V，Windyga J，Baran B，et al.The first case of combined coagulation factorⅤand coagulation factorⅧdeficiency in Po land due to a novel p.Tyr135Asn missense mutation in the MCFD2 gene［J］.Blood Coagul Fibrin，2008，19（6）：531-4.

［8］ Oeri J，Matter M，Isenschmid H，et al.Congenital factor V deficiency（parahemophilia）with true hemophilia in two brothers［J］. Bibl Paediatr，1954，58：575-88.

［9］ Elmahmoudi H，Wigren E，Laatiri A，et al.Analysis of newly detected mutations in the MCFD2 gene giving rise to combined deficiency of coagulation factors V and VIII［J］.Haemophilia，2011，17（5）：e923-7.

［10］Hejer E，Adnen L M，Asma J，et al.Identification of a novel mutation in the MCFD2 gene in a Tunisian family with combined factorⅤandⅧdeficiency［J］.Tunis Med，2012，90（4）：343-4.

［11］Zheng C，Liu H H，Zhou J，et al.EF-hand domains of MCFD2 mediate interactions with both LMAN1 and coagulation factor V or VIII［J］.Blood，2010，115（5）：1081-7.

Gene diagnosis of hereditary coagulation factor V andⅧ deficiency

Wang Anyou，Liu Xin，Wu Jingsheng，et al
（Dept of Hematology，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To analyze gene diagnosis of the 2 cases with inherited coagulation factor V andⅧdefects （F5F8D）.Methods Routine coagulation function test was used by APTT，PT，F(xiàn)V and FⅧ：C methods；Sequencing analysis all exons of LMANl and MCFD2 genes were detected by PCR method.Results In patient 1，APTT and PT were 78.7s，21.1s；FⅧ：C and FV dropped to 23.8%，6%respectively；the existence of a homozygous mutation of 242 A＞C was detected in exon 3 of MCFD2 gene，which led Asp81 mutation to Ala.In patient 2，APTT and PT were 78.5s，19.6s，F(xiàn)V and FⅧ：C were 24.8%，9.6%respectively；the exon 12 of LMAN1 gene had homozygous deletion in 1456GTG，which caused 486Val deletion.Conclusion Two new MCFD2 and LMAN1 mutations are first reported in the world，resulting in two different clinical phenotypes of hereditary coagulation factor V andⅧdeficiency.

coagulation factor V；coagulation factor VIII；LMAN1；MCFD2；mutation

R 554+.9；R 446.9

A

1000-1492（2016）09-1308-04

時(shí)間：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.032.html

2016-05-04接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1308085QH129）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2013Z133）；安徽醫(yī)科大學(xué)?？茖W(xué)研究基金項(xiàng)目（編號(hào)：2012xkj048）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥 230001

汪安友，男，博士，主治醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：way0623@ 163.com