煙草葉面細(xì)菌區(qū)系檢測探針的設(shè)計及優(yōu)化

趙敏，徐宸，賈凌，程廷才，汪長國，戴亞，夏慶友

1 重慶煙草科學(xué)研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715;

2 家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715;

3 重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，重慶市南岸區(qū)南坪東路2號 400060

煙草葉面細(xì)菌區(qū)系檢測探針的設(shè)計及優(yōu)化

趙敏1，徐宸1，賈凌2，程廷才2，汪長國3，戴亞3，夏慶友2

1 重慶煙草科學(xué)研究所，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715;

2 家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715;

3 重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，重慶市南岸區(qū)南坪東路2號 400060

為快速準(zhǔn)確地檢測煙草葉面的細(xì)菌種群，本研究利用基因芯片技術(shù)，采集我國主要煙區(qū)主栽品種旺長期葉面微生物進(jìn)行宏基因組測序，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，篩選用以檢測其中細(xì)菌種屬特異性的探針。宏基因組數(shù)據(jù)分析表明，煙草葉面的宏基因組整體質(zhì)量值較高，Q20、Q30分別占總堿基數(shù)99.2%、81.4%，測序長度為100 bp，堿基分布均勻，所獲得測序數(shù)據(jù)可用于后續(xù)探針設(shè)計。Blast比對結(jié)果表明共篩選出候選探針200條，屬于9種細(xì)菌屬，其中屬于假單胞菌屬的探針有165條。該結(jié)果為基因芯片技術(shù)應(yīng)用于煙草葉面的細(xì)菌種群的檢測提供了堅實(shí)的基礎(chǔ)。

煙草；葉面；探針；細(xì)菌種屬

植物葉面作為一個獨(dú)立的微環(huán)境域，通常棲息著細(xì)菌、酵母菌、真菌等微生物，形成了微生物種群之間、正常的微生物與宿主之間的微生態(tài)體系。微生物的活動是影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。其中，細(xì)菌是葉面環(huán)境中最主要的微生物類群[1]。已有文獻(xiàn)報道，植物葉面細(xì)菌的充分利用有助于促進(jìn)植物生長、減少化肥和農(nóng)藥投入，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-4]。例如：冬小麥葉際分離的菌株D5/23T能產(chǎn)生植物生長激素，固定大氣中的氮?dú)?，促進(jìn)植物生長，增加作物的產(chǎn)量[5-6]；從擬南芥、大麥、玉米、大豆葉面分離的粉色色素兼性甲基營養(yǎng)菌、小黑麥葉際的假單胞菌和豌豆葉際分離的分枝桿菌等也能促進(jìn)植物的生長[7-9]；解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌這2種常見葉際細(xì)菌，能分別被用來防治油菜菌核病和保護(hù)植物免受昆蟲的侵食[10]。

煙草作為經(jīng)濟(jì)作物，葉面細(xì)菌對煙葉品質(zhì)、抗性等有著重要的作用[11-12]。早在19世紀(jì)50年代中葉，人們就開始探索微生物在煙草品質(zhì)形成中的作用。陳福星等從烤煙煙葉上分離鑒定的 4 個優(yōu)勢菌種，用其處理的煙葉優(yōu)于人工或自然發(fā)酵，其不僅有效縮短發(fā)酵時間，且煙葉品質(zhì)及色香味均有一定程度的提高[11]。韓錦峰等比較了未發(fā)酵、自然陳化及人工發(fā)酵期間烤煙葉面微生物的變化，并篩選優(yōu)勢菌種混合配制成生物制劑用于煙葉發(fā)酵，結(jié)果表明，混合菌制劑可加速烤煙發(fā)酵，提高煙葉品質(zhì)，并具有抑制煙葉霉變的作用[12]。到目前為止，絕大多數(shù)研究都是關(guān)于煙草陳化過程中煙草葉面微生物，而關(guān)于其在大田期的研究較少。對大田期煙草葉面微生物的快速檢測有助于有益細(xì)菌的更好利用，從而增強(qiáng)煙草葉片的品質(zhì)、拓展煙草葉面細(xì)菌在煙草生長、抗蟲以及抗病方面的應(yīng)用。然而，前人鑒定微生物均通過菌培養(yǎng)法，費(fèi)時費(fèi)力。

基因芯片是一種高通量的核酸檢測技術(shù)，在科研、臨床方面有大量應(yīng)用[13-16]。本研究采用基因芯片技術(shù)構(gòu)建煙葉表面菌種快速鑒定系統(tǒng)，通過宏基因組測序?qū)ふ覂?yōu)勢菌及其特異性核酸序列，并將各種待檢微生物基因的特異性片斷作為核酸探針固定于生物芯片的表面，制備成微生物檢測基因芯片。這種芯片可以通過檢測確定待檢樣品中病原微生物的種、屬、亞型，并進(jìn)一步分析其毒性、致病性和抗藥性[17-19]。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有檢測范圍廣、檢測速度快、樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)[20]。本實(shí)驗(yàn)利用葉面微生物宏基因組數(shù)據(jù)設(shè)計、優(yōu)化探針，旨在構(gòu)建微生物芯片以快速準(zhǔn)確檢測煙草葉面的各種有益有害細(xì)菌的種類。

1 材料與方法

1.1 試劑與軟件

1.1.1 試劑

OMEGA E.Z.N.A DNA試 劑 盒，TruSeq DNA Sample Preparation Kits v2 Box A、TruSeq DNA Sample Preparation Kits v2 Box B、Mate Pair Library Prep Kit v2、TruSeq Dual Index Sequencing Primer Kit、Truseq PE Cluster Kit V3-cBot-HS、TruSeq SBS Kit v3-HS 購自美國Illumina公司，F(xiàn)ailSafe? PCR Enzyme Mix購 自 美 國Epicentre公 司，NEBNext End Repair Module、NEBNext dA-Tailing Module、NEBNext Quick Ligation Module購自美國NEB公司，2100 chip 1000 kit for DNA購自美國Agilent公司，AMPure XP beads購自美國Beckmam coulter有限公司，PicoGreen dsDNA Assay Kit購自美國Invitrogen公 司，QIAGEN MinElute PCR Purification Kit、QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit購自美國Qiagen公司，Certified Low Range Ultra Agarose購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 軟件

FASTQC 軟件 v0.11.4（http∶//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）、SeqPrep軟件（https∶//github.com/jstjohn/SeqPrep）、Sickle軟 件（https∶//github.com/najoshi/sickle）、自編 perl 程序、bowtie軟件v1.1.2、blast v2.2.28 軟件。如無特殊說明，軟件多采用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行。

1.2 方法

1.2.1 宏基因組原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

采集福建三明的翠碧一號（W1）、廣東南雄的粵煙97（W2）、云南大理的紅花大金元（W3）、河南平頂山的中煙100（W4）的旺長期發(fā)育正常的中部煙葉（9～11葉位）。將不同時間采集的煙葉分批次處理。首先將煙葉放置于無菌離心管，用無菌水沖洗數(shù)次后過濾（0.22 μm）。將濾膜剪碎后提取基因組并采用超聲法Covaris制備DNA樣品。首先將大片段DNA隨機(jī)打斷，然后將粘性末端修復(fù)成平末端，再通過3’ 端加堿基“A”，使得DNA片段能與3 ’端帶有“T”堿基的特殊接頭連接。隨后電泳回收目的片段連接產(chǎn)物，最后使用PCR擴(kuò)增并純化兩端帶有接頭的DNA片段。利用Agilent 7500芯片檢測文庫質(zhì)量后上機(jī)。

將原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過 Base Calling 轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)（FASTQ 格式）。FASTQ 格式文件記錄所測讀段（read）的堿基及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。Read 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以不同的字符來表示，其中每個字符對應(yīng)的 ASCII 值減去33，即為對應(yīng)的測序質(zhì)量值。堿基質(zhì)量從 0～40，即對應(yīng)的 ASCII 碼為從 “！”（0+33）到“I”（40+33）。將測序錯誤率用 E 表示，Illunima HiSeq 2000/ Miseq的堿基質(zhì)量值用 Q 表示，則有下列關(guān)系：

公式 1：Q = -10log10(E)

其中E為該堿基被測錯的概率，測錯的概率越小，堿基質(zhì)量值Q越高，通常認(rèn)為Q20為高質(zhì)量堿基。利用 FASTQC 軟件，對原始 reads 質(zhì)量值進(jìn)行評估，并對原始reads長度和堿基分布進(jìn)行了統(tǒng)計。

1.2.2 原始數(shù)據(jù)預(yù)處理

使用 SeqPrep（https∶//github.com/jstjohn/SeqPrep）和 Sickle（https∶//github.com/najoshi/sickle）軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，具體條件如下：

（1）由于探針設(shè)計長度為70 mer ，因此，將序列末端（3’端）質(zhì)量較低（質(zhì)量值小于20）的堿基修剪掉；（2）去除含 N 比率超過 5 個的 reads；（3）去除平均質(zhì)量值小于 20 的 reads；（4）去除連續(xù)低質(zhì)量堿基個數(shù)≥8 個，或者低質(zhì)量堿基個數(shù)≥15個的reads；（5）去除某種堿基含量≥80%的 reads，如 polyA 序列。

1.2.3 候選探針的統(tǒng)計及比對

利用自編 perl 程序，統(tǒng)計有效 reads 中，70 mer長度序列種類及在高質(zhì)量測序reads 中出現(xiàn)的次數(shù)。從中篩選出現(xiàn)次數(shù)≥10 次的70 mer序列，作為候選探針。利用自編perl 程序計算候選探針的GC及理論Tm值。理論Tm值計算公式見公式2。

公式 2：Tm = 81.5 + 16.6×Log10[Na+] + 0.41×(%GC)-600/L

篩選理論Tm值在68～76區(qū)間的，且在測序序列中出現(xiàn)超過10次以上的探針，使用 bowtie軟件，將其與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中所有細(xì)菌全基因組序列進(jìn)行比對。過濾掉不能與細(xì)菌基因組比上的探針，剩余能夠與細(xì)菌基因組比對上的探針，篩選出保守性好的探針作為候選檢測探針。

對篩選的探針進(jìn)行細(xì)菌種類篩選及宿主非特異性雜交檢驗(yàn)。保守性較好的探針，使用 blast軟件將其與nt 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對探針進(jìn)行特異性檢驗(yàn)。利用自編 perl 程序，篩選在屬和種層面與其他物種無非特異性雜交的探針，作為最終探針的候選。隨后使用blast 軟件，將候選探針與煙草（Nicotianatabacum,NCBI taxonomy ID∶ 4097）基因組進(jìn)行比對，過濾掉能夠在煙草基因組上比對上的探針。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始read質(zhì)量、長度及堿基分布統(tǒng)計

將宏基因組測序得到的原始圖像轉(zhuǎn)化為FASTQ格式，利用FASTQ軟件，對原始reads質(zhì)量進(jìn)行了評估，評估結(jié)果如圖1。從圖中可看出，測序的整體質(zhì)量值比較高，Q20占總堿基數(shù)99.2%，Q30占總堿基數(shù)81.4%，所獲得測序數(shù)據(jù)達(dá)到后續(xù)分析要求。對reads的長度分析發(fā)現(xiàn)，測序reads長度絕大多數(shù)在100bp（圖2）。而堿基所占百分比會因物種的差異而不同，從圖3可知，該文庫堿基分布均勻穩(wěn)定，GC含量占54.2%，在正常范圍內(nèi)。

圖1 測序原始 reads 各位置質(zhì)量值分布圖Fig. 1 Evaluation of the quality of each position based on the original reads

圖2 測序原始 reads 長度分布Fig. 2 Length distribution of the original reads

圖3 測序原始 reads 堿基分布Fig. 3 Base distribution of the original reads

2.2 原始數(shù)據(jù)預(yù)分析結(jié)果

為消除Illumina Hiseq2000原始測序數(shù)據(jù)中可能存在的測序接頭序列、低質(zhì)量讀段、N率較高序列及長度過短序列，利用SeqPrep和Sickle軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，結(jié)果如表1。從中篩選出現(xiàn)次數(shù)≥10 次的 70 mer 序列，作為探針候選。利用自編程序計算候選探針的GC及理論Tm值。篩選理論Tm值在68～76區(qū)間，且在測序序列中出現(xiàn)超過10次以上的探針，共計56,178條。

表1 原始reads過濾統(tǒng)計結(jié)果Tab. 1 Statistical results of the original reads filter

將過濾得到的候選探針與GenBank數(shù)據(jù)庫中所有細(xì)菌基因組進(jìn)行比對。過濾掉不能與細(xì)菌基因組比對上的探針，共計44,995 條，剩余能夠與細(xì)菌基因組比對上的探針 11,183 條，其中，比對到同一種屬的基因組上的次數(shù)≥10 次的探針有 5,910 條，作為檢測探針候選（表2）。

表2 70 mer與細(xì)菌基因組比對統(tǒng)計Tab. 2 Comparison of 70 mer and bacterial genome

將保守性較好的5910條探針比對nt數(shù)據(jù)庫，檢測該探針的特異性。當(dāng)整體比對 mismatch 堿基個數(shù)≥10 時，或者 3’端 mismatch≥5 時，作為探針不能與該條序列雜交。過濾掉滿足上述條件的冗余探針后，剩余候選探針 200 條，可檢測 9 個屬，分別是鮑特氏菌（Bordetella）1條、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）1條、腸桿菌屬（Enterobacter）1條、歐文氏菌（Erwinia）5條、鹽單胞菌屬（Halomonas）1條、成團(tuán)泛菌（Pantoea）23條、假單胞菌（Pseudomonas）165條、羅爾斯通氏菌（Ralstonia）1條、耶爾森氏菌（Yersinia）2條，其中檢測假單胞菌的探針占絕對優(yōu)勢（見表3，因版面原因不在紙質(zhì)版刊登，詳見電子版）。

為排除候選探針與宿主的非特異性雜交，將過濾后得到的200條候選探針，與煙草基因組比對，發(fā)現(xiàn)在所設(shè)定的非特異性雜交檢測閾值下（當(dāng)整體比對mismatch堿基個數(shù)≥10時，或者3’端 mismatch≥5時），200條探針在煙草基因組上均無非特異性雜交比對。證實(shí)這200 條探針可用于檢測煙草葉面細(xì)菌meta-genome 的種屬檢測探針（表3）。

3 小結(jié)

植物中存在各種微生物，包括有益微生物和有害微生物，這些微生物與植物發(fā)生互生、共生、寄生等關(guān)系，對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生多方面的影響。為了鑒定植物中的未知微生物或評價植物微生物效用，研究者曾使用核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析(ARDRA)、限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)等傳統(tǒng)技術(shù)[21]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)平臺的不斷完善，基因芯片技術(shù)以高通量、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為主流，在植物微生物檢測和鑒定方面具有巨大的應(yīng)用潛力。通過基因芯片技術(shù)對植物致病病毒和真菌的鑒定，有利于農(nóng)業(yè)病害的防治，減少經(jīng)濟(jì)損失[22-25]。

煙草作為我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，對地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有十分重要的作用。在煙草生長過程中，環(huán)境中的微生物與煙草形成了植物-微生物共生體系統(tǒng)[26]。為了快速、全面的檢測煙草中的優(yōu)勢或致病微生物種群，本研究首次利用芯片技術(shù)，擬建立煙草葉面細(xì)菌的檢測方法，利用宏基因組測序數(shù)據(jù)，篩選用以檢測煙葉葉面細(xì)菌種屬特異性的探針。通過對原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估、過濾、候選探針與細(xì)菌基因組比對以及候選探針?biāo)拗鞣翘禺愋詸z測后，最終獲得200條可用于檢測煙草葉面9個細(xì)菌種群的探針。利用含有特異探針的芯片，針對基因芯片技術(shù)，采集自我國主要煙區(qū)主栽品種旺長期葉面微生物進(jìn)行宏基因組測序，結(jié)果顯示，假單胞菌的探針占絕對優(yōu)勢。已有研究表明，假單胞菌廣泛存在于植物中，包括綠針假單胞菌（Pseudomonaschlororaphis）[27]、熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）[28]、蒙氏假單胞菌（Pseudomonasmonteilii）[29]，能夠抑制植物病原微生物的生長，對改善植物營養(yǎng)、促進(jìn)植物生長具有很好的作用[30-31]。此外，利用該芯片，還鑒定得到部分致病細(xì)菌菌群，如青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）[32]、軟腐病原菌（Dickeyadadantii）[33]、菠蘿泛菌（Pantoeaananatis）[34]、解淀粉歐文氏菌（Erwiniaamylovora）[35]等。這些致病細(xì)菌能嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量。利用本研究的基因芯片系統(tǒng)，快速準(zhǔn)確的鑒定煙草葉面中的細(xì)菌種群，為有針對性地利用有益細(xì)菌和控制不利細(xì)菌以提高煙葉的品質(zhì)、產(chǎn)量、減少病蟲害奠定了基礎(chǔ)，為獲得優(yōu)質(zhì)原料提供了幫助。

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表3 200條探針的結(jié)果統(tǒng)計表Tab.3 Results of 200candidate probes

續(xù)表3

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Design and optimization of microbial probes for determination of tobacco foliicolous bacteria

ZHAO Min1, XU Chen1, JIA Ling2, CHENG Tingcai2, WANG Changguo3, DAI Ya3, XIA Qingyou2
1 Chongqing Tobacco Science Research Institute, Chongqing 400715, China;
2 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China;
3 Technology Center, China Tobacco Chongqing Industrial Corporation, Chongqing 400060, China

To rapidly and accurately detect bacterial population on tobacco leaves, gene chip was used for screening bacterial species specific probes from metagenomic sequencing data of varieties grown in main tobacco grown areas. Results showed that the overall quality of sequencing reads was relatively high, with percentage of Q20 and Q30 of 99.2% and 81.4%, respectively. The sequencing length was 100 bp and with well-distributed base. 200 specific candidate probes were identified from blast comparison results, which belong to 9 types of bacteria genera, and 165 probes belong to Pseudomonas. The results showed that gene chip technology can be applied to detect bacteria population in tobacco leaves.

tobacco; phyllosphere; probe; bacterial species

趙敏，徐宸，賈凌，等. 煙草葉面細(xì)菌區(qū)系檢測探針的設(shè)計及優(yōu)化[J]. 中國煙草學(xué)報，2016,22（5）

重慶中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（NO. 130580）；重慶市煙草專賣局科技項(xiàng)目(NY20150601070012)

趙敏（1981—），博士，主要從事微生物與煙葉品質(zhì)等方面的研究，Tel：023-68219807，Email：lszhaomin@126.com

戴亞（1946—），Email：dycy@263.net

2016-03-02

：ZHAO Min, XU Chen, JIA Ling, et al. Design and optimization of microbial probes for determination of tobacco foliicolous bacteria [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(5)