掌葉覆盆子快繁過程中細(xì)菌污染的種類及控制

何瑩++騰進婧++陳燦燦+　楊華

摘 要 為了降低掌葉覆盆子（Rubus chingii Hu）組培苗的細(xì)菌污染的危害，試驗分離并研究了幾種抗生素控制掌葉覆盆子快繁過程中細(xì)菌污染的效果。試驗表明：掌葉覆盆子快繁過程中常見的細(xì)菌有三種，分別為甲基桿菌 GR3、微桿菌和惡臭假單胞菌F1。在組培苗感染細(xì)菌的早期，每升培養(yǎng)基中添加25萬單位青霉素和6.25萬單位鏈霉素能有效控制紅色菌和黃色菌，且對掌葉覆盆子的生長及生根產(chǎn)生的負(fù)面影響最小。頭孢噻肟鈉對乳白色菌有一定控制效果，但效果有限。

關(guān)鍵詞 掌葉覆盆子 快繁 細(xì)菌污染 控制

中圖分類號：S567.239 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2016.09.069

The Types and Control of Bacterial Contamination

during Micropropagation of Rubus chingii

HE Ying[1]， TENG Jinjing[1]， CHEN Cancan[2]， YANG Hua[1]

（[1] College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， CHangsha， Hunan 410128；

[2] International College of Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128）

Abstract In order to reduce palmleaf Raspberry （Rubus chingii Hu） seedlings of bacterial contamination hazards， separation test and study the several antibiotics control of Rubus chingii effect of bacterial contamination in the process of rapid propagation. Experiment shows： Rubus chingii rapid propagation of common bacteria has three， namely methyl coli GR3， micro coli and Pseudomonas putida F1. Bacterial infection in tissue culture seedlings of early， per liter of culture medium added 25 million units of penicillin and 6.25 million streptomycin unit can effectively control the red bacteria and yellow bacteria and of palmleaf raspberry growth and rooting of minimal negative impact. The effect of the control effect of the sodium in the milk white fungus， but the effect is limited.

Key words Rubus chingii； rapid propagation； bacterial contamination； control

掌葉覆盆子（Rubus chingii Hu）又稱為華東覆盆子、樹莓、牛奶母、大號角公，薔薇科懸鉤子屬植物。含有黃酮、甾、醌、生物堿、有機酸、維生素、多酚類等多種化學(xué)成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗過敏、降血脂等多方面的藥理活性。 其甜茶苷口感甘甜，不易吸收，可輔助降血糖， 滿足高血糖患者對于甜食的需求。隨著國際市場對甜茶苷需求的擴大，掌葉覆盆子的栽培面積急劇增加，組培苗的需求也日益增加。但在培苗擴繁及生根過程中，會出現(xiàn)細(xì)菌污染，感染頻率高達50%，應(yīng)采取措施進行有效防控。

抗生素是在微生物代謝過程中產(chǎn)生，在低濃度下就能抑制它種微生物的生長和活動，甚至殺死它種微生物的物質(zhì)。 以一定濃度的抗生素加入植物培養(yǎng)基中，如青霉素、鏈霉素、土霉素、四環(huán)素等，可達到抑制效果。

本文對掌葉覆盆子快繁過程中常見的細(xì)菌進行了分離與鑒定，對不同濃度的醫(yī)用抗生素降低掌葉覆盆子組培苗的污染進行了研究，旨在完善掌葉覆盆子標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)體系，降低大規(guī)模生產(chǎn)掌葉覆盆子組培苗感染細(xì)菌的風(fēng)險。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）掌葉覆盆子組培苗。本實驗采用掌葉覆盆子（Rubus chingii Hu）為材料。（2）組培污染的雜菌。實驗用的細(xì)菌從污染的組培苗中分離純化獲得。（3）醫(yī)用抗生素。青霉素可濕性粉劑（k1，80萬單位）、鏈霉素可濕性粉劑（k2，100萬單位）、注射液土霉素（k3，20萬單位），頭孢噻肟鈉（k4，100萬單位）（4）培養(yǎng)基。細(xì)菌培養(yǎng)基為10 g/L 瓊脂的MS培養(yǎng)基，每升MS培養(yǎng)基外加20ml掌葉覆盆子葉子水浸液（80g 葉子加入200ml雙蒸水，搗碎，煮沸后紗布過濾，補水至200ml）。組培苗培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)菌的分離及鑒定

在無菌條件下用接種環(huán)挑取掌葉覆盆子組織培養(yǎng)過程中典型的紅色、淡黃色和乳白色菌，在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上用劃線法分離單菌落。得到單菌落后，再挑取單菌落用劃線法進一步分離單菌落。最后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h左右做革蘭氏染色鑒定細(xì)菌。革蘭氏染色鑒定方法參考沈萍等。

16S rDNA測序法鑒定細(xì)菌種屬。引物為27F ：5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3

1.2.2 醫(yī)用抗生素母液的配置及使用

配置1萬單位/mL的抗生素母液，采用液體倍比稀釋法制備不同濃度的抗生素工作液。青霉素標(biāo)記為K1，鏈霉素標(biāo)記為K2，頭孢噻肟鈉標(biāo)記為K3，土霉素標(biāo)記為K4。

1.2.3 抗生素對掌葉覆盆子組培苗葉片、生長及生根的影響

（1）浸泡法：在40ml無菌水添加1ml抗生素母液，用該溶液浸泡組培苗10 min，然后將處理好的組培苗接種于新的培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。每天記錄一次材料葉片、生長或生根狀況。（2）直接加入法：分別向掌葉覆盆子組培苗的培養(yǎng)基（規(guī)格為40ml/瓶）上直接加入梯度濃度的抗生素溶液1毫升，置培養(yǎng)室培養(yǎng)。每天記錄一次材料葉片、生長或生根狀況。

1.2.4 抗生素抑菌效果比較

細(xì)菌培養(yǎng)基經(jīng)過高溫滅菌后，冷卻培養(yǎng)基至不燙手，再按40ml培養(yǎng)基加1ml抗生素溶液的比例將抗生素溶液分別添加到培養(yǎng)基中，然后倒平板。對照以ddH2O代替抗生素溶液。然后用滅菌的牙簽將菌點在平板中央。每天觀察細(xì)菌生長情況，量取菌落直徑，并計算抗生素對菌類的生長抑制率。

菌類生長抑制率（%） = [（對照菌落直徑-處理菌類直徑）/對照菌落直徑]€？00

1.2.5 抗生素對掌葉覆盆子組培苗細(xì)菌污染的控制

從掌葉覆盆子組培苗中挑選出感菌的材料，加入抗生素配方，每配方處理100瓶，重新置于培養(yǎng)室培養(yǎng)。每天記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 掌葉覆盆子組培過程中感染細(xì)菌的常見種類及革蘭氏染色結(jié)果

掌葉覆盆子組培的過程中，會出現(xiàn)細(xì)菌污染的現(xiàn)象，而且感染頻率非常高。但常見的有三種菌，分別為紅色、淡黃色、乳白色將紅、淡黃、乳白色三種細(xì)菌分離純化后進行革蘭氏染色，分別被染色成紫紅色、紫紅色、紅色。鑒定結(jié)果表明：紅色、淡黃色細(xì)菌為革蘭氏陽性細(xì)菌；乳白色細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)菌。采用16S rDNA鑒定分離的菌種，紅色菌為Methylobacterium variabile strain GR3（甲基桿菌），黃色菌為Microbacterium marinilacus strain YM11-607（微桿菌），白色菌為Pseudomonas putida strain F1（惡臭假單胞菌）。

2.2 抗生素對組培苗葉片的影響

試驗數(shù)據(jù)顯示，中等劑量的土霉素和鏈霉素都有可能導(dǎo)致掌葉覆盆子組培苗黃化。而且以土霉素為甚，最終都會導(dǎo)致材料的死亡。土霉素不適合用于控制掌葉覆盆子組培細(xì)菌污染。采用直接加入法更適合用于控制！

2.3 抗生素對組培苗生長、生根的影響

試驗數(shù)據(jù)顯示，不同劑量的抗生素對掌葉覆盆子組培苗生長和生根有一定影響，但只有K2-1和K2-2對覆盆子組培苗生長的影響具有顯著性特征，K2-1還對覆盆子組培苗生根的影響具有顯著性特征。

2.4 不同抗生素的抑菌效果

為了比較分析不同抗生素的抑菌效果，對組培苗生長及生根無顯著影響的抗生素進行體外抑菌實驗。試驗結(jié)果顯示，K1-1和K1-2能很好地抑制紅色菌的生長，其抑制率超過80%，K2-3能較好地抑制紅色菌生長，其抑制率超過50%。K1-1，K2-3以及K2-4對黃色菌有較好的抑制效果，其抑制率超過了50%。K3-1和K3-2對乳白色菌有好的抑制效果，其抑制率在60%以上。

2.5 抗生素對掌葉覆盆子組培苗細(xì)菌污染的控制效果

通過研究抗生素對掌葉覆盆子組培苗的影響以及抗生素對掌葉覆盆子快繁殖過程中常見菌的抑制作用，我們認(rèn)為K1-1、K1-2、K2-3、K2-4、K3-1和K3-2可以用于控制掌葉覆盆子快繁過程中的細(xì)菌污染。我們選擇K1-1、K2-3和K3-1進行組合實驗，試驗結(jié)果表明，紅色細(xì)菌污染的掌葉覆盆子組培苗應(yīng)用K1-1處理，其存活率最高；用K1-1+K2-3處理，其生根率最高。黃色細(xì)菌污染的掌葉覆盆子組培苗應(yīng)用K1-1+K2-3處理，其存活率最高且生根率最高。乳白色細(xì)菌污染的掌葉覆盆子組培苗應(yīng)用K2-3+K3-1處理，其存活率和生根率均最高。

3 討論

植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的污染問題，一般采用抗生素，如青霉素、鏈霉素、等以一定濃度加入植物培養(yǎng)基中，以達到抑制效果。也有采用抑菌劑，如滅菌靈、代森錳鋅、等進行預(yù)處理外植體或加入到培養(yǎng)基中抑制細(xì)菌生長。通過考察青霉素、鏈霉素、土霉素和頭孢噻肟鈉對組培苗生長及生根的影響及其抑菌的效果，篩查到當(dāng)掌葉覆盆子組培苗感染的是紅色或黃色細(xì)菌時，可通過添加青霉素或鏈霉素來控制，提高組培苗的存活率。但從最終能生根角度考慮，建議直接向每升培養(yǎng)基中加入25萬單位青霉素和6.25萬單位鏈霉素（K1-1+K2-3配方）。當(dāng)掌葉覆盆子組培苗感染的是乳白色細(xì)菌時，可通過添加頭孢噻肟鈉來控制，提高組培苗的存活率。但考慮到生根率過低，建議一旦發(fā)現(xiàn)掌葉覆盆子組培苗感染的是乳白色細(xì)菌，應(yīng)及時將其清理。

另外對于輕度污染的組培苗，抗生素的抑制效果極為顯著，三種抗生素的聯(lián)合作用能有效控制掌葉覆盆子的細(xì)菌生長。但對于重度污染的組培苗，抗生素的控制效果不理想，培養(yǎng)1周后細(xì)菌擴散非常嚴(yán)重，組培苗無法生根。建議及早發(fā)現(xiàn)并及時處理。

*通訊作者：楊華

注釋

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