胃癌細(xì)胞IL-33基因表達(dá)與化療藥物敏感性的相關(guān)性研究

蔣海忠，孫萍胡，王布江，丁小云

胃癌細(xì)胞IL-33基因表達(dá)與化療藥物敏感性的相關(guān)性研究

蔣海忠，孫萍胡，王布江，丁小云

目的本研究旨在揭示胃癌細(xì)胞白介素-33（IL-33）基因表達(dá)對化療藥物敏感性的影響及其可能的作用機制。方法用Ad-IL-33-EGFP、Ad-EGFP腺病毒載體，分別感染MGC-803得到MGC-803-IL-33、MGC-803-Mock，加入順鉑培養(yǎng)48 h。應(yīng)用MTT測細(xì)胞增殖，Western blot測caspase-3、PARP的蛋白表達(dá)，實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）測定ERCC1、BRCA1基因mRNA表達(dá)。結(jié)果MGC-803、MGC-803-Mock、MGC-803-IL-33細(xì)胞予順鉑處理，MTT結(jié)果顯示MGC-803-IL-33細(xì)胞增殖能力較MGC-803、MGC-803-Mock強（＜0.05），Westernblot結(jié)果示MGC-803-IL-33細(xì)胞caspase-3及PARP蛋白活化程度低（＜0.05），qRT-PCR測定示MGC-803-IL-33細(xì)胞ERCC1基因mRNA表達(dá)升高（＜0.05）。結(jié)論IL-33高表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對順鉑的敏感性下降，其機制可能是通過上調(diào)ERCC1基因的表達(dá)增強DNA損傷后的修復(fù)能力而產(chǎn)生耐藥。

胃腫瘤；癌；白介素-33；化療

近年來我國胃癌發(fā)病率雖有下降的趨勢［1］，但仍然明顯高于歐美國家，多數(shù)患者診斷時已處于進(jìn)展期，因此病死率也居各類腫瘤前列。根治性手術(shù)是目前進(jìn)展期胃癌患者首選治療手段，但5年生存率并不理想。因此美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南把胃癌術(shù)后的化療作為標(biāo)準(zhǔn)治療的Ⅰ類推薦，并且術(shù)前的新輔助化療也逐漸受到國內(nèi)外專家學(xué)者的重視。但是隨著臨床上腫瘤化療藥物的廣泛應(yīng)用，腫瘤的耐藥性問題越來越突出，尤其是多重耐藥已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一［2］，這也是導(dǎo)致術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)治療方法的5年生存率仍然＜50%的主要原因［3］。因此，研究胃癌細(xì)胞化療耐藥機制為臨床治療提供理論依據(jù)就顯得尤為重要。白介素（IL）-33是白細(xì)胞介素家族的新成員［4］，對于IL-33的研究主要集中在哮喘［5］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［6］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡［7］及炎癥性腸病等［8］方面。研究發(fā)現(xiàn)，IL-33在胃癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，且血清中IL-33表達(dá)水平高的患者生存期較短［9］?？紤]到術(shù)后的化療已成為臨床治療的常規(guī)方案，提示高表達(dá)水平的IL-33是否對化療藥物的敏感性產(chǎn)生影響。為此，本研究旨在探討IL-33與胃癌細(xì)胞MGC-803化療敏感性關(guān)系及其內(nèi)在機制，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料人類低分化胃癌細(xì)胞株MGC-803由寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室惠贈，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購于美國Hyclone公司，順鉑購于Sigma公司，caspase-3、Cleaved Caspas-3、PARP、Cleaved PARP抗體均購于美國Cell Signaling公司，-actin一抗（鼠抗人）抗體購于北京四正柏，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海碧云天，GoTaq qPCR Master Mix購于美國Promega，試驗所用PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，腺病毒載體Ad-IL-33-EGFP、Ad-EGFP由上海鳴鴻生物公司構(gòu)建。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的RPMI 1 640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞MGC-803，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為37℃、二氧化碳5%。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中4×104個/孔，用不含抗生素的RPMI1 640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24h后待細(xì)胞融合度達(dá)80%時根據(jù)腺病毒轉(zhuǎn)染說明書操作，分別用Ad-IL-33-E GFP、Ad-EGFP腺病毒感染胃癌細(xì)胞MGC-803后得到MGC-803-IL-33組，MGC-803-Mock組，未處理的為空白對照組。

1.2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖選擇對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞，以5×103個/孔的密度接種至96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，按照實驗要求進(jìn)行處理細(xì)胞，待處理結(jié)束后，加入MTT溶液20 l/孔后繼續(xù)培養(yǎng)，4h后去上清，加150 l/孔的DMSO后，將培養(yǎng)板置于水平搖床上振蕩10 min。酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處的吸光度，取6個復(fù)孔的平均數(shù)，計算細(xì)胞存活率。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 感染復(fù)數(shù)（MOI）的測定將MGC-803消化后制成懸液，按照每孔5 000個細(xì)胞接種到滅菌96孔板中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取其中6孔用于計數(shù)。根據(jù)每孔的細(xì)胞數(shù)量分別按病毒顆粒與細(xì)胞數(shù)的比例50∶1、100∶1和150∶1加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋的病毒溶液。每組濃度設(shè)6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后熒光顯微鏡觀察熒光細(xì)胞比例，確定最佳MOI為100∶1。

1.2.4 qRT-PCR測定IL-33、ERCC1、BRCA1的mRNA表達(dá)以Trizol一步法提取各組細(xì)胞總RNA，按照Promega公司RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA，行PCR擴增。PCR各引物序列見表1，PCR反應(yīng)條件見表2，循環(huán)次數(shù)40個周期。以目的基因與內(nèi)參GAPDH的Ct值計算Ct值。

1.2.5 Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、PARP的表達(dá)提取各組細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白變性后每孔上?0g，經(jīng)PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。封閉1 h后，4℃孵育一抗過夜，常溫下孵育相應(yīng)熒光二抗1h，最后予Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描成像。

1.3 統(tǒng)計方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有的實驗數(shù)據(jù)均表述為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間的比較采用兩獨立樣本檢驗；3組及3組以上比較采用單因素方差分析；多重比較采用SNK-檢驗。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化療藥物CDDP IC50測定將MGC-803細(xì)胞接種到96孔板中，24h后分別加入不同濃度的CDDP（0～8g/ml），48 h后進(jìn)行MTT實驗。MGC-803的細(xì)胞活性值分別為1.57±0.03、1.1±0.04、0.83±0.04、0.43±0.08、0.22±0.03，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=649.6，＜0.05）。以不加順鉑處理的細(xì)胞為空白對照組?？瞻讓φ战M細(xì)胞活力100%，其他處理濃度與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均＜0.05）。見封三彩圖1。根據(jù)實驗結(jié)果，在4 g/ml濃度時，細(xì)胞活力接近空白對照組的50%，選擇4 g/ml作為后續(xù)實驗濃度。

2.2 MGC-803胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染IL-33基因?qū)樸K化療敏感性的影響予Ad-EGFP、Ad-IL-33-EGFP分別感染MGC-803細(xì)胞得到細(xì)胞記為MGC-803-Mock、MGC-803-IL33。

2.2.1 qRT-PCR檢測感染病毒后細(xì)胞IL-33的表達(dá)Ad-IL-33-EGFP、Ad-EGFP分別感染MGC-803細(xì)胞，24 h后提取總RNA，qRT-PCR測定細(xì)胞內(nèi)IL-33 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，MGC-803-IL33細(xì)胞內(nèi)IL-33mRNA水平較MGC-803-Mock細(xì)胞顯著提高（=50.85，＜0.01）。見封三彩圖2。實驗證實了Ad-IL-33-EGFP可以將目的基因IL-33轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞高表達(dá)目的基因。

2.2.2 MTT測定細(xì)胞增殖將3組細(xì)胞MGC-803、MGC-803-Mock、MGC-803-IL-33接種到96孔板中，外周孔加入PBS，中間60孔加入3組細(xì)胞，每組20個復(fù)孔。48 h后加入CDDP 4g/ml。應(yīng)用MTT法測定各組細(xì)胞增殖水平。縱坐標(biāo)為細(xì)胞490 nm OD值。結(jié)果顯示MGC-803-IL-33細(xì)胞增殖能力為1.97± 0.22，較MGC-803、MGC-803-Mock細(xì)胞強（1.76±0.11、1.64±0.21，=22.3，＜0.05）。見封三彩圖3。

2.2.3 Westernblot測定細(xì)胞內(nèi)capase-3及PARP蛋白的活性取4個6 cm培養(yǎng)皿，接種相等量的MGC-803細(xì)胞，待細(xì)胞生長到約90%時，取其中一個培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。另兩個予Ad-EGFP及Ad-IL-33-EFGP，按照MOI 100感染細(xì)胞，感染后得到MGC-803-Mock、MGC-803-IL-33，另一個未處理的細(xì)胞作為空白對照。然后分別加入CDDP 4 g/ml培養(yǎng)，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，予Western blot測定capase-3及PARP的活化程度。結(jié)果提示：MGC-803-IL-33細(xì)胞的caspase-3（1.02±0.21）、PARP（1.75±0.15）活性較蛋白對照組MGC-803（2.44±0.09、5.25±0.29）、MGC-803-Mock［、（1.99±0.12、5.83±0.81）低（=68.54、 56.79，均＜0.05）。見封三彩圖4、5。

2.2.4 qRT-PCR測定細(xì)胞內(nèi)ERCC1及BRCA1基因mRNA的表達(dá)將細(xì)胞MGC-803預(yù)先接種到6 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長到約90%時給予Ad-EGFP及Ad-IL-33-EFGP感染細(xì)胞，未處理作為空白對照。24 h后加入CDDP 4 g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用qRT-PCR測定3組細(xì)胞內(nèi)ERCC1、BRCA1基因的表達(dá)。結(jié)果顯示ERCC1 mRNA水平分別為8.61±0.52、7.83±0.55、6.22±0.39，BRCA1 mRNA水平分別為7.06±0.51、7.77±0.31、7.67±0.39。提示MGC-803-IL-33細(xì)胞內(nèi)ERCC1基因mRNA表達(dá)明顯高于對照組（=24.46，＜0.05），而BRCA1基因mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（=3.49，＞0.05）。見封三彩圖6。

3 討論

表1 實時定量PCR引物

表2 qRT-PCR反應(yīng)條件

胃癌是常見消化道惡性腫瘤之一，加之我國早期胃癌診斷率較低［11］，因此大部分手術(shù)治療患者都是中晚期胃癌患者，其手術(shù)治療效果有限。對于這部分患者來說化療效果直接影響其預(yù)后，而腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性又是化療療效的決定性因素。隨之而來的另一臨床挑戰(zhàn)則是腫瘤對化療藥物的耐藥現(xiàn)象。順鉑在臨床的應(yīng)用已經(jīng)超過30年，但仍然是應(yīng)用最廣泛的藥物之一［12］。而在胃癌的化療中以第3代鉑類藥物奧沙利鉑為主。因此筆者選擇順鉑進(jìn)行胃癌細(xì)胞化療藥物敏感性的實驗是合理可行的。

IL-33作為一個核因子的作用知之甚少。研究認(rèn)為在細(xì)胞未受到炎癥刺激時IL-33主要存在于細(xì)胞核內(nèi)［13］，此時IL-33在細(xì)胞內(nèi)可能是作為一個核因子形式而存在。研究顯示在順鉑耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株IL-7表達(dá)明顯升高［14］，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)IL-7的表達(dá)后細(xì)胞對順鉑敏感性提高。本研究以腺病毒為載體，將IL-33轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞MGC-803后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞對順鉑藥物的敏感性明顯下降，呈現(xiàn)出對順鉑的耐藥。Western blot方法測定相關(guān)的凋亡蛋白表達(dá)結(jié)果也提示高表達(dá)IL-33后，細(xì)胞caspase-3及PARP的表達(dá)水平較對照組明顯降低，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的抗凋亡現(xiàn)象。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染IL-33基因后的細(xì)胞ERCC1基因mRNA表達(dá)水平升高，而ERCC1是DNA損傷后核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)中的重要一員。國內(nèi)外眾多研究證實了ERCC1基因表達(dá)與順鉑耐藥有關(guān)［15］。因此根據(jù)本研究結(jié)果推測，IL-33可能作為一種核因子調(diào)控了基因ERCC1的表達(dá)，使得細(xì)胞對順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)能力增強，從而呈現(xiàn)出對順鉑的敏感性降低。本研究結(jié)果胃癌細(xì)胞高表達(dá)IL-33后對順鉑的藥物敏感性降低，其機制可能是通過上調(diào)ERCC1基因表達(dá)，為腫瘤順鉑耐藥的機制研究提供了新的思路，同時也為腫瘤患者選擇合適有效的化療方案的提供了新的理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.03.023

R735.2

A

1671-0800（2016）03-0323-03

2015-09-11

（本文編輯：姜曉慶）

寧波市自然科學(xué)基金（2013A610218）

315010寧波，寧波市第一醫(yī)院

丁小云，Email：dyyyding@ 126.com