不同銅源對Caco-2細胞內(nèi)銅-ATP酶二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1和金屬硫蛋白含量的影響

高　晨，朱連勤，朱風(fēng)華，王學(xué)鑫，張　婷，張　靜

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.德州學(xué)院農(nóng)學(xué)系，山東 德州 253023）

不同銅源對Caco-2細胞內(nèi)銅-ATP酶二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1和金屬硫蛋白含量的影響

高晨1，2，朱連勤1，朱風(fēng)華1，王學(xué)鑫1，張婷1，張靜1

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.德州學(xué)院農(nóng)學(xué)系，山東 德州 253023）

利用Caco-2細胞模型研究不同濃度硫酸銅，微米氧化銅，納米氧化銅（銅水平2、4、8、16 mg/L）對細胞銅-ATP酶、二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）含量的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中添加銅離子能提高Caco-2細胞銅-ATP酶、MT含量，低濃度銅離子能提高細胞DMT1含量，高濃度銅離子降低細胞DMT1含量。納米氧化銅對幾種銅轉(zhuǎn)運蛋白的作用與硫酸銅類似，但納米氧化銅對銅-ATP酶、MT、DMT1含量的影響更加明顯。

納米氧化銅；Caco-2細胞；銅-ATP酶；金屬硫蛋白；二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1

銅作為機體必需的微量元素之一。目前飼料中常用的銅源有硫酸銅和氧化銅等，但傳統(tǒng)銅源存在吸收率低、污染環(huán)境等缺點。隨著納米科技的興起，納米微量元素添加劑步入人們視野，有研究表明，飼料中添加納米氧化銅效果優(yōu)于硫酸銅和氧化銅，其生物學(xué)作用強，生物利用率高［1-3］。然而，納米氧化銅在動物體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)運機制并不清楚，仍需進一步研究。本試驗以Caco-2細胞為模型，研究不同銅源對銅-ATP酶、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）、二價金屬離子轉(zhuǎn)運體1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）的影響，探討納米氧化銅在吸收轉(zhuǎn)運時的特點，為進一步研究和開發(fā)納米氧化銅提供參考數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞株Caco-2細胞，購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2試驗設(shè)計將Caco-2細胞按1×105/mL的濃度接種于6孔板中，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)20 d后，換入含有不同銅源的DMEM培養(yǎng)液（3 mL/孔）。設(shè)12個試驗組，硫酸銅、微米氧化銅和納米氧化銅3種銅源分別設(shè)4個組（銅水平2、4、8、16 mg/L）；對照組加培養(yǎng)液3 mL/孔；每組6個重復(fù)。繼續(xù)作用24 h后，收集細胞檢測相關(guān)指標。

1.3檢測指標與方法采用BCA法檢測Caco-2細胞蛋白含量。利用銅-ATP酶測試盒、金屬硫蛋白測試盒、二價金屬離子轉(zhuǎn)運體測試盒檢測Caco-2細胞中銅-ATP酶、MT、DMT1含量。

1.4數(shù)據(jù)分析利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)處理應(yīng)用單因素方差分析和LSD多重比較。數(shù)據(jù)均采用-X±SD表示。

2　結(jié)果

2.1不同銅源對Caco-2細胞內(nèi)銅-ATP酶活性的影響結(jié)果顯示，培養(yǎng)液銅水平為2、4 mg/L時，添加納米氧化銅組的銅-ATP酶活性高于硫酸銅和微米氧化銅組（P＜0.05）。培養(yǎng)液銅水平為8 mg/L時，添加硫酸銅組的銅-ATP酶活性高于納米氧化銅組（P＜0.05）。硫酸銅和納米氧化銅對Caco-2細胞銅-ATP酶活性的影響均呈現(xiàn)隨著銅濃度升高先上升后下降趨勢（P＜0.05）。見表1。

表1　不同銅源對Caco-2細胞銅-ATP酶活性的影響（μmolPi/mgprot/hour）

2.2不同銅源對Caco-2細胞內(nèi)MT含量的影響

結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中添加同等銅水平時，納米氧化銅組Caco-2細胞MT含量高于硫酸銅組和微米氧化銅組（P＜0.05）。納米氧化銅和硫酸銅對Caco-2細胞MT含量的影響均呈現(xiàn)隨培養(yǎng)液銅濃度的升高而升高（P＜0.05）。見表2。

表2　不同銅源對Caco-2細胞MT含量的影響（μg/gprot）

2.3不同銅源對Caco-2細胞內(nèi)DMT1含量的影響結(jié)果顯示，培養(yǎng)液銅水平為2 mg/L時，添加硫酸銅Caco-2細胞DMT1含量高于納米氧化銅和微米氧化銅（P＜0.05）。銅水平為4 mg/L時，添加硫酸銅和微米氧化銅Caco-2細胞DMT1含量高于納米氧化銅（P＜0.05）。銅水平為8、16 mg/L時，添加微米氧化銅Caco-2細胞DMT1含量高于硫酸銅和納米氧化銅（P＜0.05）。納米氧化銅和硫酸銅對Caco-2細胞DMT1含量的影響均呈現(xiàn)隨銅濃度的升高而下降（P＜0.05）。見表3。

3　討論

銅-ATP酶存在于細胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等亞細胞器中，在調(diào)節(jié)細胞Cu吸收和平衡方面有重要作用［4］。Xie等報道，添加銅能明顯提高大鼠腸上皮細胞中銅-ATP酶（ATP7A）活性［5］。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加低濃度納米氧化銅能提高Caco-2細胞中銅-ATP酶活性，但當添加高濃度納米氧化銅時，銅-ATP酶的活性又回落至正常水平，甚至略有下降?？赡苁怯捎诩毎诙虝r間內(nèi)積聚大量的銅，進而細胞通過負反饋調(diào)控進入細胞中的銅離子量，是細胞避免銅中毒的一種保護性反應(yīng)。硫酸銅對銅-ATP酶活性的影響與納米氧化銅相似。同時發(fā)現(xiàn)，納米氧化銅對銅-ATP酶活性的影響要強于相同濃度的硫酸銅，可能是納米氧化銅以銅離子和納米粒子兩種形式進入細胞，通過兩種途徑對細胞銅-ATP酶活性產(chǎn)生影響。添加微米氧化銅后對銅-ATP酶活性沒有影響。MT是一類與金屬元素具有高度親和力且能被其誘導(dǎo)的功能特異的蛋白質(zhì)。銅與MT結(jié)合成Cu-MT，保持細胞內(nèi)銅濃度相對穩(wěn)定，有效地減低銅的細胞毒性。Darwish等報道，大鼠肝臟細胞中的MT mRNA的表達水平與銅濃度呈正相關(guān)［6］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)液中納米氧化銅水平的升高，Caco-2細胞MT mRNA相對表達量明顯升高［7］。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)液中銅離子濃度增加，Caco-2細胞中MT的含量顯著增高，納米氧化銅對細胞中MT含量影響與硫酸銅類似，但是同等濃度的納米氧化銅比硫酸銅更能促進MT的生成。DMT1在腸中主要分布于十二指腸絨毛刷狀緣等處，DMT1除了攝取Fe2+外，也能對銅離子進行轉(zhuǎn)運［8］。Jiang等對小鼠HEK-293細胞研究發(fā)現(xiàn)，隨著細胞銅轉(zhuǎn)運量增加，DMT1 mRNA的表達受到抑制［9］。本試驗發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)液中納米氧化銅濃度的增加，細胞DMT1的生成受到抑制，同時發(fā)現(xiàn)同等濃度下納米氧化銅對DMT1的抑制作用要強于硫酸銅，可能是由于納米氧化銅以銅離子和納米粒子2種形式進入細胞為細胞提供了更多的銅，進而抑制DMT1的生成。

表3　不同銅源對Caco-2細胞DMT1含量的影響（μg/gprot）

本試驗發(fā)現(xiàn)，納米氧化銅對幾種銅轉(zhuǎn)運蛋白的作用與微米氧化銅有較大差異，反而與硫酸銅類似，說明納米氧化銅在培養(yǎng)液中部分以銅離子形態(tài)存在。但納米氧化銅對銅-ATP酶、MT、DMT1含量的影響更明顯，因為納米氧化銅除了以銅離子形式進入細胞外，還以納米粒子形式直接進入細胞，通過2種途徑來對細胞的銅轉(zhuǎn)運蛋白產(chǎn)生影響。

［1］朱連勤，田相迪，朱風(fēng)華，等.不同劑量納米氧化銅對肉雞免疫功能的影響［J］.中國家禽，2007，29（21）：20-23.

［2］蓋文婷，朱連勤，朱風(fēng)華，等.納米氧化銅對小白鼠銅表觀消化率的影響［J］.家畜生態(tài)學(xué)報，2008，29（5）：58-60.

［3］潘娜，朱風(fēng)華，王友令，等.日糧添加高水平硫酸鋅和納米氧化銅對雞臟器組織鋅銅沉積的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（23）：4874-4881.

［4］Gupta A，Lutsenko S.Evolution of copper transporting ATPases in eukaryotic organisms［J］.Curr Genomics，2012，13（2）：124-133.

［5］Xie L，Collins J F.Copper stabilizes the Menkes copper-transporting ATPase（Atp7a）protein expressed in ratintestinal epithelial cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2013，304（3）：2572-2562.

［6］Darwish W S，Ikenaka Y，Nakayama S，et al.The effect of copper on the mRNA expression profile of xenobiotic-metabolizing enzymes incultured rat H4-II-E cells［J］.Biol Trace Elem Res，2014，158（2）：243-248.

［7］Chen G，Lianqin Z，F(xiàn)enghua Z，et al.Effects of different sources of copper on Ctr1，ATP7A，ATP7B，MT and DMT1 protein and gene expression in Caco-2 cells［J］.Journal of Trace Elements in Medicine and Biology，2014，38：344-350.

［8］Arredondo M，Mendiburo M J，F(xiàn)lores S，et al.Mouse divalent metal transporter 1 is a copper transporter in HEK293 cells［J］. Biometals，2014，27（1）：115-123.

［9］Jiang L，Garrick M D，Garrick L M，et al.Divalent metal transporter 1（Dmt1）Mediates Copper Transport in the Duodenum of Iron-Deficient Rats and When Overexpressed in Iron-Deprived HEK-293 Cells［J］.J Nutr，2013，143（12）：1927-1933.

Effects of different sources of copper on copper-ATPase，divalent metal transporter content 1，metallothionein in Caco-2 cells

GAO Chen1，2，ZHU Lian-qin1，ZHU Feng-hua1，WANG Xue-xin1，ZHANG Ting1，ZHANG Jing1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Department of Agronomy，Dezhou University，Dezhou 253023，China）

In this study，we investigated the effects of different concentrations of CuSO4，micron-CuO，nano-CuO（copper levels 2，4，8，16 mg/L）on cell copper-ATPase，DMT1，MT content in Caco-2 cell.The results showed that the culture medium supplemented with copper ions improve the copper-ATPase，and MT content in Caco-2 cells.Low concentrations of copper ions improved DMT1 content and high concentrations of copper ions reduced DMT1 content in Caco-2 cells.Effect of nano-CuO on several copper transporters was similar to CuSO4，but the impact of nano-CuO to copper-ATPase，MT，DMT1 content was more obvious.

Nano-CuO；Caco-2 cell；copper-ATPase；MT；DMT1

ZHU Lian-qin

S852.3

A

0529-6005（2016）04-0049-02

2014-11-26

國家自然科學(xué)基金科學(xué)部主任基金項目（311400-76）；青島市科技計劃基礎(chǔ)項目［12-1-4-5-（5）-jch］

高晨（1979-），男，講師，博士，研究方向為動物營養(yǎng)代謝病與中毒病，E-mail：gaochen1127@126.com

朱連勤，E-mail：lqzhu@qau.edu.cn